基于指紋圖譜結(jié)合多指標(biāo)成分定量用于麻黃湯的質(zhì)量評(píng)價(jià)

黃英蘭 楊芳

摘要目的：分析和評(píng)價(jià)指紋圖譜和多指標(biāo)成分定量結(jié)合用于麻黃湯主要成分的定量和質(zhì)量。方法：采用線性范圍試驗(yàn)和加樣回收率實(shí)驗(yàn)考察高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜分析方法的嚴(yán)謹(jǐn)性，由2個(gè)廠家各提供6個(gè)不同批次麻黃湯藥材，共12批次，以鹽酸麻黃堿對(duì)照品、桂皮醛對(duì)照品、苦杏仁苷對(duì)照品、甘草酸對(duì)照品，多指標(biāo)成分定量HPLC測(cè)定，分別計(jì)算各批次麻黃湯中這4種成分的含量；同時(shí)進(jìn)行指紋圖譜HPLC分析評(píng)價(jià)麻黃湯的質(zhì)量。結(jié)果：麻黃湯中的有效成分鹽酸麻黃堿、桂皮醛、苦杏仁苷、甘草酸在各自濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，且這4種成分的平均回收率分別是1000%、1001%、9939%、9904%，RSD分別是17%、13%、11%、099%。D廠中的麻黃湯藥材樣品質(zhì)量波動(dòng)較大，相似度較低，而B(niǎo)廠中麻黃湯藥材質(zhì)量波動(dòng)較小，相似度較高，一致性較好。結(jié)論：麻黃湯的主要成分是鹽酸麻黃堿、桂皮醛、苦杏仁苷和甘草酸，B廠麻黃湯的藥材質(zhì)量?jī)?yōu)于D廠。

關(guān)鍵詞指紋圖譜；成分；定量；麻黃湯；質(zhì)量評(píng)價(jià)

Quantitative Evaluation of Mahuang Decoction Based on Fingerprint and Multi Index Components

Huang Yinglan1， Yang Fang2

（Department of Pharmacy， Nanfang Hospital， Southern Medical University， Guangzhou 510515， China）

AbstractObjective：To analyze the quantitative and qualitative evaluation of the main components of Mahuang Decoction by quantitative analysis of fingerprint and multi index components. Methods：The linear range test and recovery test were used on high performance liquid chromatography （HPLC） analysis method for the rigor of the fingerprint. Two manufacturers provided 6 different batches of Mahuang Decoction， with a total of 12 batches， and with ephedrine hydrochloride， cinnamaldehyde， bitter apricot kernel， licorice glycoside reference acid as control products. Quantitative determination of HPLC content in the 4 components of each batch in Mahuang Decoction was calculated； at the same time， fingerprint HPLC was used to evaluate the quality of Mahuang Decoction. Results：1） In Mahuang Decoction， the effective ingredients including ephedrine， cinnamaldehyde， amygdalin and glycyrrhizic acid had good linear relationship within the scope of concentration was good， and the average recovery rate of 4 components were 100%， 1001%， 9939%， 9904%， with RSD of 17%， 13%， 11%， 099%. 2） The quality fluctuation of Mahuang Decoction samples from D manufactures was larger and the similarity was lower， while the quality fluctuation was lower， with high similarity and good consistency in B manufacture. Conclusion：The main components of Mahuang Decoction are ephedrine hydrochloride， cinnamic aldehyde， amygdalin and glycyrrhizic acid. The quality of Mahuang Decoction of B manufacture was better than that of D manufacture.

Key WordsFingerprint； Quantitative analysis； Mahuang Decoction； Quality evaluation

中圖分類號(hào)：R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.05.052

麻黃湯出自醫(yī)圣張仲景《傷寒論》，由麻黃、桂枝、杏仁、甘草4味藥組合而成，主治外感風(fēng)寒表實(shí)證，癥見(jiàn)惡寒發(fā)熱，頭痛身疼，無(wú)汗而喘?，F(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究顯示，麻黃湯具有抗流行性感冒、急性支氣管炎、支氣管哮喘的功效，具有明顯消炎抗菌作用[16]。國(guó)內(nèi)外諸多醫(yī)家經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，療效確切。該藥方化學(xué)成分較為復(fù)雜，指紋圖譜技術(shù)可從整體上綜合分析湯方的化學(xué)物質(zhì)內(nèi)涵，是目前國(guó)際公認(rèn)的控制中藥質(zhì)量的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)模式[710]，我們利用高效液相色譜法（HPLC）技術(shù)全面分析麻黃湯的化學(xué)物質(zhì)信息，以期為中藥湯劑使用提供客觀依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1儀器與試藥

11儀器Agilent 1100型高效液相色譜儀；精密電子秤（蘇州奇樂(lè)電子科技有限公司，型號(hào)：FA2004C）。

12試劑購(gòu)于中國(guó)食品藥品生物制品鑒定院的桂皮醛對(duì)照品（批號(hào)：111595200604）、苦杏仁苷對(duì)照品（批號(hào)：110777200406）、甘草酸對(duì)照品（批號(hào)：11075220012）、鹽酸麻黃堿對(duì)照品（批號(hào)：1107382000501）。

13分析樣品麻黃湯采用《傷寒論》中配伍比例3∶2∶2∶1，麻黃藥用部位為麻黃科植物草麻黃的干燥草質(zhì)莖，桂枝藥用部分為樟科植物肉桂的干燥嫩枝，杏仁藥用部分為薔薇科植物山杏的干燥成熟種子，甘草藥用部分為豆科植物甘草的干燥根和根莖。

2方法與結(jié)果

21色譜條件精密量取20 μL的樣品進(jìn)樣量或?qū)φ掌啡芤?，采?50 mm×46 mm，4 μm的色譜柱（Agilent ZORBAX XDBC18柱），在乙腈和01%磷酸的流動(dòng)相中，流速為1 mL/min，柱溫為25 ℃，根據(jù)高效液相色譜（HPLC）（Agilent 1100型高效液相色譜儀）多指標(biāo)成分定量測(cè)定色譜條件和指紋圖譜的梯度洗脫程序進(jìn)行試驗(yàn)。見(jiàn)表1、表2。

23供試品溶液制備麻黃藥用部位為麻黃科植物草麻黃的干燥草質(zhì)莖，桂枝藥用部分為樟科植物肉桂的干燥嫩枝，杏仁藥用部分為薔薇科植物山杏的干燥成熟種子，甘草藥用部分為豆科植物甘草的干燥根和根莖，麻黃湯采用《傷寒論》中配伍比例3∶2∶2∶1，采用回流法煎煮，于敞口藥盆中稱取9 g麻黃，加400 mL水，浸泡30 min，煮沸后文火45 min，去沫減200 mL再加入6 g桂枝和杏仁、3 g甘草取煮沸文火20 min，取100 mL藥液，在60 ℃下減壓濃縮，定容至50 mL，折合麻黃湯濃度未04 g/ mL。取5 mL柴胡黃芩濃縮液用100%甲醇定容10 mL，混合均勻，取2 mL離心取上清液在045 μm超微膜濾過(guò)即可。

24專屬性試驗(yàn)取同一供試品溶液根據(jù)23制備的供試品溶液，采用薄層層析的方法對(duì)麻黃湯進(jìn)行專屬性試驗(yàn)，結(jié)果顯示專屬性良好。

25線性關(guān)系考察根據(jù)11制備的對(duì)照品溶液，精密取01 μL、05 μL、1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、20 μL，分別編號(hào)17并連續(xù)進(jìn)樣，以峰面積為Y軸，5 μL進(jìn)樣濃度為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)對(duì)照品的回歸方程計(jì)算各有效成分在各自濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系。

26中間精密度試驗(yàn)精密吸取10 μL同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果顯示相對(duì)標(biāo)注偏差RSD是092%，精度度良好。

27供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取10 μL同一供試品溶液，配置后分別放置0、2、4、8、16、24、48 h后進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果顯示48 h內(nèi)供試品溶液基本穩(wěn)定，RSD是095%。

28重復(fù)性試驗(yàn)精密吸取10 μL同一供試品溶液，在相同色譜條件，相同液相分析儀上檢測(cè)5次，結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為089%，重復(fù)性良好。

29加樣回收率試驗(yàn)取6份同一供試品溶液根據(jù)11制備的供試品溶液，編號(hào)AF并分別加入鹽酸麻黃堿對(duì)照品、桂皮醛對(duì)照品、苦杏仁苷對(duì)照品、甘草酸對(duì)照品，計(jì)算各有效成分在HPLC中的加樣回收率。

麻黃湯中的有效成分鹽酸麻黃堿、桂皮醛、苦杏仁苷、甘草酸在各自濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，且這4中成分的平均回收率分別是1000%、1001%、9939%、9904%，RSD分別是17%、13%、11%、099%。見(jiàn)表3、表4。

210樣品測(cè)定結(jié)果

2101多指標(biāo)成分定量東莞仁濟(jì)大藥房（簡(jiǎn)稱D廠）提供6個(gè)不同批次麻黃湯藥材，根據(jù)11制備供試品溶液，分別編號(hào)S1、S2……S6中國(guó)北京同仁堂（集團(tuán)）有限責(zé)任公司（簡(jiǎn)稱B廠）提供6個(gè)不同批次麻黃湯藥材，根據(jù)11制備供試品溶液，分別編號(hào)S7、S8……S12，根據(jù)12中表1的色譜條件，以鹽酸麻黃堿對(duì)照品、桂皮醛對(duì)照品、苦杏仁苷對(duì)照品、甘草酸對(duì)照品，分別計(jì)算各批次麻黃湯中這4種成分的含量。

12批麻黃湯HPLC多指標(biāo)成分定量分析各批次麻黃湯中的主要成分是鹽酸麻黃堿、桂皮醛、苦杏仁苷、甘草酸和其定量分析結(jié)果。見(jiàn)圖1、表5。

2102指紋圖譜同上12個(gè)批次麻黃湯藥材，制備成供試品溶液后精密吸取5 μL，根據(jù)12中表2的色譜條件依次測(cè)定并記錄12批麻黃湯的色譜圖。

根據(jù)《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A》中相似度的評(píng)價(jià)方法，選用夾角余弦法，由圖2、3顯示D廠中的麻黃湯藥材樣品質(zhì)量波動(dòng)較大，相似度較低，而B(niǎo)廠中麻黃湯藥材質(zhì)量波動(dòng)較小，相似度較高，一致性較好。

3討論

本研究利用梯度洗脫方法對(duì)麻黃湯中標(biāo)志性指標(biāo)鹽酸麻黃堿、桂皮醛、苦杏仁苷、甘草酸進(jìn)行含量測(cè)定，并對(duì)12批次的麻黃湯藥材進(jìn)行含量測(cè)定。在流動(dòng)相選擇時(shí)本團(tuán)隊(duì)曾經(jīng)嘗試使用流動(dòng)相相同梯度方法進(jìn)行洗脫，結(jié)果存在部分峰拖尾嚴(yán)重的現(xiàn)象，而曾經(jīng)我們亦嘗試使用乙腈與01%甲酸、乙腈與01%乙酸為流動(dòng)相用相同梯度進(jìn)行洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基線無(wú)法實(shí)現(xiàn)平穩(wěn)，我們認(rèn)為產(chǎn)生這一結(jié)果的原因可能與甲酸、乙酸在270 nm出出現(xiàn)吸收現(xiàn)象有關(guān)。最終研究中我們將乙腈及01%磷酸最終設(shè)定為流動(dòng)相的成分，結(jié)果顯示此流動(dòng)相設(shè)置下所得的圖譜基線具有明顯平穩(wěn)性，且波峰結(jié)果理想，分離效果理想，保留時(shí)間適中。

圖312批不同批次的麻黃湯指紋圖譜的相似度結(jié)果

在所選擇的色譜柱條件下我們發(fā)現(xiàn)各成分分離度高，色譜峰尖銳，分離時(shí)間亦理想，實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分可靠。該研究采用各地的不同批次進(jìn)行指紋圖譜檢查分析，結(jié)果顯示不同批次的圖譜結(jié)果基本一致，在相似度檢測(cè)中各批藥材的相似度尚可，這說(shuō)明經(jīng)過(guò)國(guó)家藥物質(zhì)量監(jiān)督部分的努力，現(xiàn)中藥藥材市場(chǎng)上的藥材質(zhì)量較前明顯改善。我們采用最大吸收波長(zhǎng)作為不同有效成分的檢測(cè)指標(biāo)，此類方法不但減少了實(shí)驗(yàn)誤差，且可提高檢測(cè)靈敏度。

本研究我們將2個(gè)廠家的12批次藥材的指紋圖譜利用MATLAB軟件進(jìn)行主要成分統(tǒng)計(jì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)D廠中的麻黃湯藥材樣品質(zhì)量波動(dòng)較大，相似度較低，而B(niǎo)廠中麻黃湯藥材質(zhì)量波動(dòng)較小，相似度較高，一致性較好。說(shuō)明不同廠家藥材化學(xué)成分存在一定差異，我們認(rèn)為不同廠家所選藥材可能因產(chǎn)地、種屬等差異，此外生產(chǎn)工藝亦存在一定差異，所以導(dǎo)致藥材產(chǎn)品質(zhì)量訊在一定差異。在成分測(cè)定中我們看出麻黃堿吸收最大波長(zhǎng)在250 nm，桂皮醛吸收最大波長(zhǎng)為290 nm，苦杏仁苷及甘草酸分別為270 mm及278 nm，因?yàn)榭嘈尤受占案什菟岢龇宓拈g隔時(shí)間較短，來(lái)不及變換明顯波長(zhǎng)，而在250 nm波長(zhǎng)麻黃堿有較強(qiáng)的吸收，在290mm桂皮醛有明顯吸收，這一結(jié)果與國(guó)內(nèi)外諸多文獻(xiàn)[1116]數(shù)據(jù)一致。因此，對(duì)于檢測(cè)組方中不同成分盡量采用其最大吸收波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)，即可提高檢測(cè)靈敏度，又可減少誤差。

HPLC完整體現(xiàn)了麻黃湯的組方特征，同時(shí)驗(yàn)證了該藥對(duì)產(chǎn)生最大藥物效價(jià)，以期指導(dǎo)臨床運(yùn)用。

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