HBV母嬰阻斷失敗兒童的HLA基因多態(tài)性研究

姚琳 佘芹 尹玉竹

【摘要】目的探討遺傳因素對(duì)HBV母嬰傳播免疫阻斷失敗的影響。方法選擇母親血清HBsAg陽(yáng)性、經(jīng)聯(lián)合免疫后發(fā)生HBV阻斷失敗的12例嬰兒為研究對(duì)象，7月齡時(shí)抽取肘靜脈血，提取DNA，對(duì)其進(jìn)行HLADPB1、HLADPB2等2個(gè)基因中3個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)（rs2281388、rs9277535、rs9366816）的PCR擴(kuò)增測(cè)序，分析目的SNP位點(diǎn)的堿基組成和等位基因比例，統(tǒng)計(jì)不同位點(diǎn)的基因頻率，并與國(guó)際千人基因組計(jì)劃中的中國(guó)南方人群比較。結(jié)果12例HBV母嬰阻斷失敗嬰兒的rs9277535位點(diǎn)GA基因型頻率與中國(guó)南方人群比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005），且GA基因型與AA基因型相比，新生兒感染HBV的風(fēng)險(xiǎn)較低（OR=0064，95% CI 0006～0641）；rs9366816的C等位基因頻率與中國(guó)南方人群比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005），且C等位基因與T等位基因相比，新生兒感染HBV的風(fēng)險(xiǎn)較高（OR=2585，95% CI 1008～6629）；HBV母嬰阻斷失敗嬰兒的rs2281388各基因型及等位基因頻率與中國(guó)南方人群比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>005）。結(jié)論rs9277535（HLADPB1）的GA基因型可能是HBV母嬰傳播的保護(hù)性因素，rs9366816（HLADPB2）的C等位基因可能是HBV母嬰傳播的危險(xiǎn)性因素。

【關(guān)鍵詞】乙型肝炎病毒；母嬰傳播；易感基因；單核苷酸多態(tài)性

Study of the polymorphism of HLA gene in the failure of blockage of mothertochild transmission of hepatitis B virus：a report of 12 casesYao Lin， She Qin， Yin Yuzhu Department of Obstetrics， the Third Affiliated Hospital of Sun Yatsen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Yin Yuzhu， Email： yyzst2011@163com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of genetic factors on the failure of immune blockage of mothertochild transmission of hepatitis B virus （HBV） MethodsTwelve infants presenting with the failure of HBV transmission blockage after combined immunotherapy and positive serum HBsAg of their mothers were recruited in this investigation The venous blood samples were collected from the elbows of the 7monthold infants DNA extraction was performed Three single nucleotide polymorphisms （SNPs， rs2281388， rs9277535 and rs9366816） at the HLADPB1 and HLADPB2 loci were subject to PCR amplification sequencing The base composition and allele proportion of the target SNP sites were analyzed The gene frequencies at different loci were statistically compared with those in the southern Chinese population recorded in the 1000s Genomes Project ResultsThe frequencies of GA genotype of rs9277535 significantly differed between 12 infants with the failure of HBV transmission blockage and the population from southern China （P<005） The infants with GA genotype had a lower risk of HBV infection compared with their counterparts with AA genotype （OR=0064，95% CI： 00060641） The frequency of C allele of rs9366816 also significantly differed from that of the southern population （P<005） The infants with C allele had a higher risk of HBV infection compared with those with T allele （OR=2585， 95% CI： 10086629） However， there was no significant difference in the frequencies of rs2281388 genotypes and alleles between 12 infants and those from southern China （all P> 005） ConclusionThe GA genotype of rs9277535 （HLADPB1） may be a protective factor， whereas the C allele of rs9366816 （HLADPB2） is probably a risk factor of mothertochild transmission of HBV

【Key words】Hepatitis B virus； Mothertochild transmission； Susceptibility gene；

Single nucleotide polymorphisms

HBV母嬰傳播是導(dǎo)致人群攜帶HBV的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)，孕婦血清HBeAg陽(yáng)性和HBV DNA高水平是HBV母嬰傳播免疫阻斷失敗的危險(xiǎn)因素[12]。然而，并非所有具有高危因素的孕婦所分娩的新生兒都發(fā)生免疫阻斷失敗。HBV母嬰阻斷失敗除了與病原學(xué)特征、環(huán)境、遺傳背景等因素有關(guān)外，還可能與宿主存在HBV感染的易感基因有關(guān)。有報(bào)道，與健康人群相比，慢性乙型肝炎（CHB）患者的HLA基因中存在與HBV在成年人之間水平傳播相關(guān)的基因型[39]。本研究擬從尋找HBV感染相關(guān)易感基因著手，探討遺傳因素對(duì)HBV母嬰傳播免疫阻斷失敗的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

選取2011年1月至2016年3月在中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院產(chǎn)科出生、母親血清HBsAg陽(yáng)性、經(jīng)聯(lián)合免疫后發(fā)生免疫阻斷失敗的嬰兒為研究對(duì)象。病例選擇標(biāo)準(zhǔn)：①母親年齡20歲或以上，孕28～42周，血清HBsAg陽(yáng)性，本次妊娠為單胎，無(wú)嚴(yán)重肝、腎功能異常及其他嚴(yán)重妊娠合并癥，血清甲、丙、丁、戊、庚型肝炎系列檢查均陰性，妊娠期間未使用抗病毒藥物、免疫調(diào)節(jié)藥和細(xì)胞毒性藥，無(wú)長(zhǎng)期使用腎上腺皮質(zhì)激素類藥物史，配偶HBsAg陰性；②嬰兒發(fā)生免疫阻斷失敗，但無(wú)嚴(yán)重的內(nèi)外科疾病和先天畸形。本研究經(jīng)中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象的監(jiān)護(hù)人均已簽署知情同意書。

二、診斷標(biāo)準(zhǔn)

免疫阻斷失敗是指新生兒出生時(shí)HBsAg和（或）HBV DNA陽(yáng)性并持續(xù)陽(yáng)性至7月齡。HBV DNA陽(yáng)性指血液中的HBV數(shù)量超過(guò)了HBVDNA正常值（100 IU/ml）。

三、免疫接種方案

新生兒于出生24 h內(nèi)盡早肌內(nèi)注射乙肝Ig 100 U，并按0、1、6方案接種重組酵母乙肝疫苗10 μg進(jìn)行主被動(dòng)聯(lián)合免疫。分別于出生時(shí)聯(lián)合免疫前以及7月齡時(shí)采集嬰兒肘靜脈血，進(jìn)行HBV血清標(biāo)志物（HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe、抗HBc）的檢測(cè)。

四、檢測(cè)方法

國(guó)際千人基因組計(jì)劃（https： //www ncbi nlm nih gov/variation/tools/1000genomes/），是由中英美德等國(guó)科學(xué)家共同承擔(dān)研究任務(wù)，繪制了迄今為止最詳盡的、最有醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值的人類基因組遺傳多態(tài)性圖譜，其測(cè)序人群包含了以廣東人群為主的中國(guó)南方人群。采用DNAMAN軟件對(duì)比DNA序列評(píng)估測(cè)序結(jié)果，Chromas軟件分析測(cè)序峰圖，統(tǒng)計(jì)目的SNP位點(diǎn)的堿基組成和等位基因比例，計(jì)算不同位點(diǎn)的雜合率，并與國(guó)際千人基因組計(jì)劃中的中國(guó)南方人群比較。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 220處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用二分類Logistic回歸模型分析各基因型與兒童感染HBV的關(guān)系，計(jì)算優(yōu)勢(shì)比（OR）和95%可信區(qū)間（CI）。P<005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、12例免疫阻斷失敗兒童的一般資料

2011年1月至2016年3月符合納入標(biāo)準(zhǔn)的免疫阻斷失敗兒童共12例，其一般資料見(jiàn)表2。

討論

中國(guó)是HBV感染的高發(fā)地區(qū)，育齡女性中HBV感染率高達(dá)718%，從而使HBV母嬰傳播的風(fēng)險(xiǎn)增加[1013]。對(duì)HBsAg陽(yáng)性孕婦所分娩的新生兒進(jìn)行乙肝Ig和乙肝疫苗的聯(lián)合免疫，可阻斷大部分母嬰傳播，但仍有嬰兒發(fā)生免疫阻斷失敗，成為新的HBV感染者。有研究表明，HBV母嬰阻斷失敗可能和病毒因素、妊娠期阻斷方式有關(guān)，但與宿主遺傳因素的關(guān)系仍知之甚少[12，1416]。自20世紀(jì)70年代初以來(lái)，HLA被證實(shí)為最主要的與感染性疾病易感性相關(guān)基因，并作為個(gè)體組織細(xì)胞的遺傳學(xué)標(biāo)志，在抗原識(shí)別、免疫應(yīng)答等方面起著重要的作用。其通過(guò)影響抗原提呈等免疫應(yīng)答過(guò)程，對(duì)宿主清除外來(lái)病毒如HBV病毒發(fā)揮作用，并可能影響病毒感染的持久化以及感染后病情進(jìn)展。

2009年，日本全基因組研究中心首次提出HLADPB1的rs9277535與日本成年人CHB有關(guān)[34]。針對(duì)中國(guó)人群的研究也表明rs9277535與CHB有關(guān)，提出HLADP的基因多態(tài)性在成年人HBV感染中扮演重要的角色，該研究還證實(shí)了rs9277535的A等位基因與HBV的清除有關(guān)，能降低中國(guó)漢族人罹患CHB的風(fēng)險(xiǎn)[57]。另有研究發(fā)現(xiàn)，HLADPB2 的rs9366816與HBV的持續(xù)性感染有關(guān)[8]。2016年Fan等[9]的研究表明，HLADP基因上的rs9277535 GG基因型、rs9366816 TC基因型和rs2281388 GA基因型與成年人HBV持續(xù)性感染相關(guān)，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)rs9277535的GA基因型與HBV母嬰阻斷失敗后感染有關(guān)。

本研究對(duì)12例免疫阻斷失敗兒童外周血中的3個(gè)相關(guān)SNP位點(diǎn)進(jìn)行了PCR擴(kuò)增測(cè)序和分析，并與中國(guó)南方人群的基因頻率相比，結(jié)果顯示rs9277535（HLADPB1）和rs9366816（HLADPB2）的基因型或等位基因頻率與中國(guó)南方人群比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示這2個(gè)位點(diǎn)可能與免疫阻斷失敗有關(guān)。其中免疫阻斷失敗兒童的rs9277535的GA基因型頻率為8%，遠(yuǎn)低于中國(guó)南方人群的47%，和Fan等[9]的研究結(jié)論一致。他們的研究認(rèn)為， rs9277535的GA基因型與兒童免疫阻斷失敗后感染有關(guān)。本研究提示，HLADPB1基因上rs9277535的GA基因型可能是HBV感染的保護(hù)性基因型，具有此基因型者，可能會(huì)降低HBV的母嬰感染率。既往研究證實(shí)，HLADPB2基因rs9366816的CT基因型與成年人的HBV持續(xù)性感染有關(guān)[89]。本研究中，12例免疫阻斷失敗兒童的rs9366816 CT基因型頻率（33%）與中國(guó)南方人群（49%）相近。但免疫阻斷失敗兒童rs9366816的C等位基因頻率為67%，高于中國(guó)南方人群的基因頻率（43%），提示rs9366816的C等位基因可能是HBV感染的易感基因，不僅能導(dǎo)致成年人的持續(xù)性HBV感染，還可能會(huì)增加HBV母嬰阻斷失敗的風(fēng)險(xiǎn)。既往研究發(fā)現(xiàn)，rs2281388 CT基因型與成年人慢性HBV感染有關(guān)[9]。在本研究免疫阻斷失敗兒童中的rs2281388 CT基因型頻率為50%，與中國(guó)南方人群的基因型頻率（47%）相近，可能與本研究的樣本量較小有關(guān)；也可能提示由于兒童的免疫系統(tǒng)與成人相比尚未完全發(fā)育，從而存在不同的免疫機(jī)制有關(guān)，其與兒童HBV母嬰傳播免疫阻斷失敗無(wú)關(guān)。

胎兒由于免疫系統(tǒng)的特殊性，其基因組中是否含有圍生期感染HBV的易感基因型尚不明確。本研究中，雖然在免疫阻斷失敗兒童中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)SNP位點(diǎn)與南方人群中的基因型頻率存在差異，但由于病例數(shù)較少，尚不能說(shuō)明其與HBV感染相關(guān)，需要在后續(xù)的研究中，進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量和增加目的SNP位點(diǎn)，繼續(xù)探討遺傳因素對(duì)HBV母嬰阻斷失敗的影響，進(jìn)而為在人群中篩選具有遺傳易感性的高危個(gè)體，并對(duì)其采取針對(duì)性的預(yù)防措施或治療手段，為減少HBV的母嬰傳播和控制慢性 HBV感染提供理論與實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。

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（收稿日期：20180226）

（本文編輯：林燕薇）