蒜頭果內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物抑制人類致病菌活性的研究

肖支葉　華梅　原曉龍　邱堅(jiān)　鄭科　王毅

摘要： 蒜頭果是我國特有的單種屬稀有樹種，為了進(jìn)一步開發(fā)利用蒜頭果樹皮內(nèi)生真菌的抗菌活性化合物，該研究對來自蒜頭果的植物內(nèi)生真菌（白黃筍頂孢霉、哈茨木霉、大棘黑團(tuán)孢、枝狀枝孢菌、斑污擬盤多毛孢、赭綠青霉、淡紫紫孢菌、朱黃青霉、Xenoacremonium recifei、Xylaria feejeensis）進(jìn)行液體培養(yǎng)，10 d后回收培養(yǎng)液并用乙酸乙酯萃取獲得初提物，采用抑菌圈法檢測蒜頭果內(nèi)生真菌初提物抑菌活性，同時(shí)測定了最低抑菌濃度（MIC）。結(jié)果表明：白黃筍頂孢霉、大棘黑團(tuán)孢、枝狀枝孢菌、斑污擬盤多毛孢、赭綠青霉、淡紫紫孢菌均有抑菌活性，大棘黑團(tuán)孢、斑污擬盤多毛孢、淡紫紫孢菌的初提物均對緩慢芽孢桿菌、無乳鏈球菌和藤黃微球菌有明顯抗菌活性，最低抑菌濃度在1.562 5～6.25 mg·mL-1之間。這說明蒜頭果樹皮內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物具有抗菌活性，各內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物的抗菌效果不同。

關(guān)鍵詞： 蒜頭果樹皮， 內(nèi)生真菌， 次生代謝產(chǎn)物， 抗菌活性， 最低抑菌濃度

中圖分類號(hào)： Q946， Q93文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A文章編號(hào)： 1000-3142（2018）07-0903-08

Abstract： Malania oleifera is an endemic and rare species in China. In order to explore and utilize the antibacterial active compounds of endophytic fungi from M. oleifera bark， endophytic fungi （Acrostalagmus luteoalbus， Trichoderma harzianum，Periconia macrospinosa，Cladosporium cladosporioides，Pestalotiopsis maculans，Penicillium ochrochloron， Purpureocillium lilacinum， Penicillium minioluteum， Xenoacremonium recifei and Xylaria feejeensis） from Malania oleifera were cultured in liquid media. After 10 d culture， the culture media were collected， and then the crude extracts were obtained with ethyl acetate extraction. The inoculating inhibition zone was used to evaluate the antibacterial activity of the crude extracts. Meanwhile， the minimum inhibitory concentration （MIC） of antibacterial activity was also detected. The results showed that the crude extracts of Acrostalagmus luteoalbus， Periconia macrospinosa， Cladosporium cladosporioides，Pestalotiopsis maculans， Penicillium ochrochloron and Purpureocillium lilacinum had antibacterial activities， the crude extracts of Periconia macrospinosa， Pestalotiopsis maculans and Purpureocillium lilacinum had significant antibacterial activities against Bacillus lentus， Streptcococcus agalactiae and Micrococcus luteus. The minimum inhibitory concentration was between 1.562 5 and 6.25 mg·mL-1. This results showed that secondary metabolites of endophytic fungi of Malania oleifera bark had antibacterial activities and the antibacterial effects of secondary metabolites of endophytic fungi were different.

Key words： Malania oleifera bark， endophytic fungi， secondary metabolites， antibacterial activity， the minimum inhibitory concentration

植物內(nèi)生真菌是指在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的真菌（Wiyakrutta et al，2004），與宿主植物在長期的協(xié)同進(jìn)化過程中建立了和諧共生關(guān)系，在生長過程中會(huì)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)各異的次生代謝產(chǎn)物，一些代謝產(chǎn)物能夠協(xié)同寄主植物防御病原微生物（Arnold et al，2003），一些可增強(qiáng)植物的抗逆性 （徐范范等，2010）。植物內(nèi)生真菌是具有高度多樣性的微生物資源，其生物多樣性及生存環(huán)境的特殊性使其產(chǎn)生的活性產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類型豐富多樣。目前，已從植物內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物中分離到黃酮類、萜類、生物堿類、甾體類、多肽、環(huán)肽類和醌類化合物，這些不同類型的化合物具有抗菌、抗腫瘤、抗真菌等多種生物活性（孫毓焓等，2016）。如從藥用植物Bauhinia guianensis內(nèi)生真菌Aspergillus sp. EJC08中分離得到生物堿Fumigaclavine C，該化合物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和大腸桿菌具有不同程度的抑制活性（Pinheiro et al，2013）；張慧茹等（2015）的研究表明，真菌發(fā)酵液會(huì)影響細(xì)胞膜的通透性，使得胞質(zhì)內(nèi)容物滲漏，同時(shí)影響菌體蛋白合成，從而抑制細(xì)菌生長。在太平洋短葉紫杉（Taxus brevifolia）樹皮里分離獲得內(nèi)生真菌Taxomyces andreanae，在半合成液體培養(yǎng)基中生長時(shí)能夠產(chǎn)生紫杉醇，該化合物具有抗腫瘤活性，被認(rèn)為是當(dāng)今世界上廣譜、活性最強(qiáng)的抗癌藥物（Stierle et al，1993）。已獲得的這些活性化合物具有開發(fā)成為新型抗生素的潛能，通過廣泛地從植物內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物中尋找具有活性的化合物，并研發(fā)出新型藥物可以有效改善細(xì)菌耐藥性現(xiàn)象。

蒜頭果（Malania oleifera）又稱山桐果，為鐵青樹科（Olacaceae）馬蘭木屬（Malania Chun et S. Lee）植物，主要分布在廣西西北部和云南東南部的狹窄地帶（肖支葉等，2017），為國家二級(jí)珍稀瀕危保護(hù)樹種和重要野生經(jīng)濟(jì)植物（傅立國，1992）。為合理利用蒜頭果資源，已對蒜頭果做了化學(xué)成分和內(nèi)生真菌多樣性等方面的研究（劉雄民等，2007；Tang et al，2013；王毅等，2017）。如在蒜頭果種皮中提取獲得黃酮類化合物，測定出含量；首次從蒜頭果種子中分離、純化獲得一種新的植物毒蛋白（Malanin），并鑒定了蛋白質(zhì)的性質(zhì)（Wu et al，2012；袁燕等，2011；Yuan et al，2009）。通過分離純化并分析不同生境蒜頭果的根、樹皮及葉組織內(nèi)生真菌的多樣性，發(fā)現(xiàn)不同生境對蒜頭果根內(nèi)生真菌的組成及多樣性影響顯著（王毅等，2017）。目前尚未見有蒜頭果內(nèi)生真菌的抗菌活性的相關(guān)報(bào)道，而植物內(nèi)生真菌可產(chǎn)生大量新穎的天然產(chǎn)物，有些能產(chǎn)生與宿主植物相同或相近的次生代謝產(chǎn)物（何佳等，2007）。本研究所用10種內(nèi)生真菌來自于無明顯病害的蒜頭果樹皮，分別為白黃筍頂孢霉、大棘黑團(tuán)孢、赭綠青霉、枝狀枝孢菌、斑污擬盤多毛孢、淡紫紫孢菌、Xenoacremonium recifei、Xylaria feejeensis、哈茨木霉、朱黃青霉。液體培養(yǎng)獲得乙酸乙酯初提物并分別對13種致病菌進(jìn)行活性篩選，以期找到具有抗菌效果的初提物，并測定各提取物的最低抑菌濃度，為下一步分離提純活性化合物的研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 材料

蒜頭果樹皮采于云南省文山州廣南縣（105°01′E， 23°97′N），采集時(shí)，帶上無菌手套用無菌工具將蒜頭果健康的樹皮采集后放入無菌的離心管內(nèi)，-4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｖ袊茖W(xué)院昆明植物研究所彭華研究員對所采集樹種進(jìn)行鑒定為蒜頭果（Malania oleifera）。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯淀粉5 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g。OMA液體培養(yǎng)基：大豆蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蔗糖20 g，酵母提取物1 g，分別用水定容至1 L，于120 ℃滅菌20 min。

1.2 檢測菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、大腸埃希菌（Escherichia coli）、溶血性葡萄球菌（Straphylococcus haemolyticus）、福氏志賀氏菌（Shigella flexneri）、無乳鏈球菌（Streptcococcus agalactiae）、緩慢芽孢桿菌（Bacillus lentus）、乙型副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphi B）由昆明市食品藥品檢驗(yàn)所提供。

1.3 內(nèi)生真菌的分離與純化

先將新鮮采集的蒜頭果樹皮用大量自來水清洗表面雜物，再用自來水連續(xù)沖洗 2 h，盡量除去表面可能的真菌孢子及細(xì)微雜物。將樣品浸泡在70%乙醇中表面消毒 5 min，用 3%雙氧水處理7 min，分別用50 mL 蒸餾水沖洗 3 次。用無菌手術(shù)刀將消毒處理后的植物組織切成小塊，用鑷子將組織小塊放到含有鏈霉素（50 mg·μL-1）和氨芐青霉素（50 mg·μL-1）的 PDA 培養(yǎng)基上，待內(nèi)生真菌長出菌絲后，將邊緣菌絲切下轉(zhuǎn)至新的 PDA 培養(yǎng)基上，經(jīng)數(shù)次轉(zhuǎn)接后獲得純培養(yǎng)菌株。

1.4 內(nèi)生菌的鑒定

將純培養(yǎng)菌株接種到不同培養(yǎng)基上，觀察菌落生長速度、大小、產(chǎn)色素情況，初步確定所分離到的內(nèi)生真菌種類。用CTAB 法提取分離菌株的DNA ，以真菌 ITS 通用引物（ITS1F 和 ITS4）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，電泳檢測 PCR 擴(kuò)增結(jié)果后，直接將 PCR 產(chǎn)物送測序公司測序。將獲得的內(nèi)生真菌 ITS 序列與 NCBI 上已有的序列進(jìn)行blast比對，通過形態(tài)和分子鑒定最終確定內(nèi)生真菌的種名。

1.5 制備提取物

將10種內(nèi)生真菌分別轉(zhuǎn)接入OMA液體培養(yǎng)基（大豆蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蔗糖20 g，酵母提取物1 g）中，于28 ℃、轉(zhuǎn)速為 150 r·min -1的搖床中培養(yǎng)10 d。過濾培養(yǎng)物，與等體積的乙酸乙酯混合后，超聲2次，每次30 min。濾去水相，取有機(jī)相濃縮培養(yǎng)液收獲提取物，萃取2次。分別稱取適量提取物，加入DMSO溶解成50 mg·mL-1提取物母液備用。

1.6 檢測提取物抑菌活性

制備檢測菌懸浮液：參照趙能等（2017）的方法。抑菌實(shí)驗(yàn)：紙片法（王軍等，2013）。均勻涂布各菌液在LB固體培養(yǎng)基上，分別滴加10 μL不同提取物溶液于濾紙片（φ=5 mm）上，一片濾紙片滴加10 μL DMSO作為陰性對照，揮干后貼在涂有供試菌的培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑，做3次技術(shù)性重復(fù)。采用二倍稀釋法，測定活性提取物的最低抑菌濃度（MIC）值。

2結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌的分離

利用組織塊分離法，將蒜頭果樹皮30個(gè)組織塊分別接種到含有抗生素的PDA固體培養(yǎng)基上，在顯微鏡下將生長出來的菌絲接種到新的PDA平板上，通過三次轉(zhuǎn)接后，共得到28個(gè)菌落均一，菌落邊緣整齊的菌株，通過形態(tài)觀察初步判斷得到10種內(nèi)生真菌。并提取10種內(nèi)生真菌的DNA，以真菌ITS通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 測序后首先通圖 1基于ITS序列構(gòu)建的蒜頭果樹皮內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育樹過比對分析初步確定屬名后，再通過與臨近種的ITS構(gòu)建進(jìn)化樹確定種名（圖1），最終結(jié)合分子鑒定及形態(tài)觀察確定從蒜頭果樹皮中共分離得到10種內(nèi)生真菌，分別為白黃筍頂孢霉、哈茨木霉、大棘黑團(tuán)孢、枝狀枝孢菌、斑污擬盤多毛孢、赭綠青霉、淡紫紫孢菌、朱黃青霉、Xenoacremonium recifei、Xylaria feejeensis。

2.2 培養(yǎng)液乙酸乙酯萃取得率

10種內(nèi)生真菌在OMA液體培養(yǎng)所得培養(yǎng)液，經(jīng)乙酸乙酯萃取2次后得率如表1所示，可以看出，不同內(nèi)生真菌在相同培養(yǎng)基中培養(yǎng)同等時(shí)間后，所得萃取物得率差別明顯，所得提取物量均低于0.1 g，得率均較低。得率最低的為白黃筍頂孢霉，僅有156 μg·mL-1；最高的為淡紫紫孢菌，初提物得率能夠達(dá)到837 μg·mL-1。

2.3 活性提取物的MIC

具有抑菌活性培養(yǎng)物的相應(yīng)備試液與相應(yīng)致病菌進(jìn)行MIC的測定，結(jié)果如表2所示。從表2可以看出，白黃筍頂孢霉、大棘黑團(tuán)孢、赭綠青霉、斑污擬盤多毛孢、枝狀枝孢菌和淡紫紫孢菌的提取物具有抗菌活性。六種內(nèi)生真菌培養(yǎng)液乙酸乙酯濃縮物的最低抑制濃度各不相同。大棘黑團(tuán)孢、斑污擬盤多毛孢和淡紫紫孢菌的抑菌范圍最為廣泛。大棘黑團(tuán)孢、赭綠青霉、斑污擬盤多毛孢和淡紫紫孢菌對藤黃微球菌表現(xiàn)出明顯的抑制活性，斑污擬盤多毛孢和淡紫紫孢菌的次生代謝產(chǎn)物對革蘭氏陽性菌的抑菌活性較好，而赭綠青霉的次生代謝產(chǎn)物對革蘭氏陰性菌的抑菌活性較好。大棘黑團(tuán)孢、淡紫紫孢菌和斑污擬盤多毛孢活性均優(yōu)于其他三種內(nèi)生真菌。

蒜頭果10種內(nèi)生真菌對蠟樣芽孢桿菌抗菌活性的初步篩選結(jié)果如圖2所示，初提物初始濃度為50 mg·mL-1，在較高的濃度時(shí)，大棘黑團(tuán)孢和赭綠青霉對蠟樣芽孢桿菌有抗菌活性，但是當(dāng)其初提物稀釋2次以后，對蠟樣芽孢桿菌的活性即明顯減弱。大棘黑團(tuán)孢初提物的抑菌范圍最廣，稀釋后抑菌效果卻不明顯，說明其次生代謝產(chǎn)物中的活性成分需要達(dá)到一定的量才能表現(xiàn)出明顯的抑菌活性。表2僅列出了內(nèi)生真菌對檢測菌種抗菌活性較為穩(wěn)定且明顯的MIC值。

3討論

不同生態(tài)位的植物內(nèi)生真菌產(chǎn)生的生物活性代謝產(chǎn)物多種多樣。與溫帶植物內(nèi)生真菌相比，熱帶植物內(nèi)生真菌會(huì)產(chǎn)生更多的活性天然產(chǎn)物和更多的次生代謝產(chǎn)物。阿魏酸是從常見的熱帶雨林植物內(nèi)生真菌——小孢擬盤多毛孢中分離得到的一種抗真菌劑（Li et al， 2001）；從斯里蘭卡的一種瀕臨滅絕的熱帶雨林蘭花中分離得到一種炭角菌屬真菌，該菌會(huì)產(chǎn)生抗菌藥物煙曲霉酸（Ratnaweera et al， 2014）。據(jù)報(bào)道，煙曲霉酸對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度分別為4、2 μg·mL-1，表現(xiàn)出顯著的抗菌活性。Cryptocandin是從藥用植物雷公藤內(nèi)生真菌Cryptosporiopsis quercina中分離并鑒定出的一種肽類抗真菌劑，能抑制灰葡萄孢等一些植物病原真菌， 而且還能抑制白假絲酵母等人類病原真菌（Strobel et al， 1999）。藥用植物雞冠刺桐內(nèi)生擬莖點(diǎn)霉屬真菌會(huì)產(chǎn)生一種新的聚酮內(nèi)脂Phomol，有抗菌、抗真菌和抗炎活性（Weber et al， 2005）。這表明有抗菌活性的植物內(nèi)生真菌來源廣泛，是開發(fā)新型抗生素和農(nóng)用藥物活性成分的資源寶庫。

蒜頭果樹皮中廣泛分布有抗菌活性的菌株。本研究發(fā)現(xiàn)，具有抗菌活性的內(nèi)生真菌數(shù)占總數(shù)的60%，有些內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物的抑菌效果非常好，其中淡紫紫孢菌是生防菌。研究指出，大棘黑團(tuán)孢對植物病原真菌——尖孢鐮刀菌有較好的抑菌活性（Ginting et al，2013），白黃筍頂孢霉對多種植物病原真菌有明顯的抑菌或溶菌作用，該菌具有生防菌的必備特質(zhì)（何蘇琴等，2010）。枝孢菌屬真菌F14的有機(jī)酸——肉桂酸、環(huán)肽類化合物——cyclo-（Phe-Pro）、cyclo-（Val-Pro）對三種污染細(xì)菌有抗菌活性，且肉桂酸可有效抑制幼蟲的沉降（Qi et al，2009）。在東北紅豆杉的樹枝中的黑團(tuán)孢屬真菌代謝產(chǎn)生的兩種fusicoccane diterpenes二萜類化合物，具有抗菌活性（Kim et al，2004）。擬盤多毛孢屬真菌是紅樹林內(nèi)生真菌的重要類群之一，由于一些內(nèi)生擬盤多毛孢菌能產(chǎn)生重要的代謝產(chǎn)物如紫杉醇（Yang et al， 2012），而引起人們對紅樹林的關(guān)注。來自淡紫紫孢菌的代謝產(chǎn)物中性肽paecilotoxins有中等的抗菌性（Goncalves et al，2015）。這表明白黃筍頂孢霉、枝孢菌屬、黑團(tuán)孢屬、擬盤多毛孢菌屬和淡紫紫孢菌分別能夠產(chǎn)生生物堿類、有機(jī)酸類、二萜類和多肽類抗菌活性物質(zhì)。因此，本研究不同真菌提取物的活性成分有可能是此四類抗菌活性物質(zhì)，可為下一步的分離鑒定提供理論基礎(chǔ)。

本研究中，淡紫紫孢菌對蠟樣芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、無乳鏈球菌、藤黃微球菌和溶血性葡萄球菌的抗菌活性，赭綠青霉對銅綠假單胞菌和福氏志賀氏菌的抗菌活性，以及白黃筍頂孢霉、大棘黑團(tuán)孢、斑污擬盤多毛孢和枝狀枝孢菌抗革蘭氏陽性菌和陰性菌的活性為首次發(fā)現(xiàn)。采用OMA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)10種真菌的提取物得率很低，此培養(yǎng)基可能不是活性真菌的最佳培養(yǎng)基。大棘黑團(tuán)孢的抑菌范圍最廣，斑污擬盤多毛孢的抑菌活性與Maria et al（2005）報(bào)道的擬盤多毛孢屬真菌對枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌相符（Maria et al，2005）。大棘黑團(tuán)孢和斑污擬盤多毛孢初提物在低濃度下，對多種致病細(xì)菌仍然具有抑菌效果，具備研發(fā)成新型藥物先導(dǎo)化合物的潛力。今后，采用單菌多產(chǎn)物策略（OSMAC）發(fā)酵活性真菌，進(jìn)一步探究它們的最優(yōu)培養(yǎng)條件，大量培養(yǎng)獲得提取物，采用硅膠層析柱離析、通過薄層色譜分析，確定活性化合物的極性，進(jìn)而分離、純化并鑒定活性化合物。由于分類地位特殊，蒜頭果可能會(huì)產(chǎn)生其他多數(shù)種群植物中沒有的化合物，其樹皮內(nèi)生真菌可能會(huì)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性多樣的化合物，這類天然活性物質(zhì)是藥物的重要來源。據(jù)分析，1981—2006年間，約有68%的抗生素及34%的抗腫瘤藥物都直接來自天然產(chǎn)物或天然產(chǎn)物的衍生物（Newman & Cragg，2007），而內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物是一類重要天然產(chǎn)物。因此，將蒜頭果樹皮內(nèi)活性真菌代謝產(chǎn)生的活性化合物開發(fā)成新型抗生素或綠色農(nóng)藥有潛在的可能性與應(yīng)用價(jià)值。

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