黑果枸杞無菌苗愈傷組織誘導(dǎo)體系的建立

李琳　杜倩　梁素鈺

摘要：? 以黑果枸杞為主要研究對(duì)象，利用組織培養(yǎng)技術(shù)，研究不同濃度的植物生長激素對(duì)黑果枸杞愈傷組織形成的影響，及不同外植體器官對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)分化的影響，同時(shí)對(duì)其野生資源保護(hù)和利用提供技術(shù)支持。研究結(jié)果表明：最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS + 2，4D 0.4 mg/L + 6-BA 0.2 mg/L;黑果枸杞根、莖、葉誘導(dǎo)愈傷組織率均高于98%，但莖和葉的誘導(dǎo)時(shí)間較短為15天。

關(guān)鍵詞：? 黑果枸杞;? 愈傷組織誘導(dǎo);? 外植體

中圖分類號(hào)：? ?S 567. 9， S 603. 6? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? ?A

黑果枸杞（Lycium ruthenicum） 為茄科 （Solanceae） 枸杞屬 （Lycium）多年生灌木，富含花青素、類胡蘿卜素、維生素等多種營養(yǎng)成分，還含有豐富的Fe、Zn、Se等微量元素[ 1 - 5 ]。近年來，黑果枸杞藥用價(jià)值及營養(yǎng)保健作用被廣泛傳播，市場(chǎng)需求量激增，野生黑果枸杞的價(jià)格飛速上漲，巨大的經(jīng)濟(jì)利益使得銷售者不顧生態(tài)環(huán)境延續(xù)性，開展了毀滅性采摘，從而導(dǎo)致野生黑果枸杞資源破壞嚴(yán)重[ 6 - 7 ]。目前對(duì)黑果枸杞的醫(yī)藥研究主要集中在化學(xué)活性成分及活性成分提取方面[ 8 - 14 ]。因此，本研究選用種子萌發(fā)20天的黑果枸杞無菌苗子葉為外植體，探究不同植物生長激素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，然后選取最優(yōu)配比對(duì)黑果枸杞子葉、下胚軸、胚根等不同外植體器官進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)研究，建立黑果枸杞愈傷組織誘導(dǎo)體系，為今后進(jìn)一步優(yōu)化黑果枸杞無菌苗組培快繁體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 材料

本研究選用的黑果枸杞種子購買于青海省寧夏市。

1. 2 方法

1. 2. 1 種子的消毒

將黑果枸杞種子浸于蒸餾水中，于4℃冷藏過夜后，棄去浮于上方的干癟種子，并將其反復(fù)沖洗多次，去除果肉等雜質(zhì)，以免消毒不徹底導(dǎo)致種子萌發(fā)過程中真菌感染。將沖洗后的種子用75%酒精和NaClO進(jìn)行消毒，消毒時(shí)間分別為30 s和5～10 min，換用消毒劑時(shí)用無菌水沖洗3～5次，最后用無菌水沖洗3～5次，待用。

1. 2. 2 黑果枸杞無菌苗的種植

將消毒后的黑果枸杞種子播種于1/2MS培養(yǎng)基上，在組織培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度25℃，光照時(shí)間12 h/天，光照強(qiáng)度2 000～2 500 lux。

1. 2. 3 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的選擇

以黑果枸杞無菌苗子葉為外植體，用剪刀將葉片剪成0.5 cm的小塊，葉片的正面朝上接種到以MS基本培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基上添加不同濃度2，4-D（0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L）和6-BA（0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L）誘導(dǎo)愈傷組織（表1），每個(gè)培養(yǎng)瓶接種5塊外植體，每6個(gè)培養(yǎng)瓶為一個(gè)處理，每處理重復(fù)3次。20天后統(tǒng)計(jì)形成愈傷組織的百分率，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選。

1. 2. 4 不同外植體類型對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和分化的影響

為找到最適合黑果枸杞組織培養(yǎng)的外植體，本研究將萌發(fā)10天無菌苗的子葉、下胚軸、根作為外植體接種到篩選出的最優(yōu)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，3周后統(tǒng)計(jì)愈傷組織數(shù)，選擇出最適黑果枸杞組織培養(yǎng)外植體。

2 結(jié)果與分析

2. 1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的選擇

愈傷組織在添加10種不同激素配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上（3次重復(fù)）培養(yǎng)3周后，均誘導(dǎo)出愈傷組織（表2），YD4、YD5、YD6的誘導(dǎo)率高于98%，YD7、YD9、YD10上的誘導(dǎo)率90%以上，YD8誘導(dǎo)率83%左右，YD3誘導(dǎo)率71.11%，而YD1、YD2誘導(dǎo)率低于10%，顯著低于其他梯度。YD6的愈傷組織增殖最快，但愈傷組織呈現(xiàn)為水浸狀;YD4、YD5培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出的愈傷組織增殖較快，形成淡黃色質(zhì)地疏松的愈傷組織團(tuán);YD1、YD2、YD7雖然誘導(dǎo)出愈傷組織，但為深綠色顆粒狀緊密愈傷組織團(tuán);YD7愈傷組織褐化;YD3、YD8、YD9的愈傷組織上誘導(dǎo)的愈傷，顏色為淡黃色、質(zhì)地緊密呈顆粒狀，YD9愈傷組織少許褐化。

單獨(dú)使用6-BA，低濃度下對(duì)誘導(dǎo)愈傷作用較小，而高濃度下能夠誘導(dǎo)愈傷，但愈傷組織長勢(shì)不好，發(fā)生褐化;單獨(dú)使用2，4-D能誘導(dǎo)出愈傷組織，但是愈傷組織呈水浸狀，高濃度下發(fā)生褐化。說明了黑果枸杞誘導(dǎo)愈傷組織對(duì)2，4-D敏感，2，4-D濃度0.4 mg·L-1配合低濃度6-BA誘導(dǎo)愈傷組織效果最好。

2. 2 不同外植體器官對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和分化的影響

將黑果枸杞萌發(fā)10天的無菌種子苗的子葉、下胚軸、胚根作為外植體，分別接種到2.1中確定的最適愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS + 0.4 mg/ml 2，4D + 0.2 mg/ml 6-BA中，3周后統(tǒng)計(jì)愈傷組織數(shù)（表3）可知：黑果枸杞種苗下胚軸、子葉、胚根都表現(xiàn)了極高的愈傷組織誘導(dǎo)率，其中胚根誘導(dǎo)出愈傷組織的時(shí)間最短為10天，子葉及下胚軸均為15天，但是胚根誘導(dǎo)形成的愈傷組織經(jīng)過多次繼代，愈傷組織逐漸褐化，幾乎無法分化出叢生芽，而子葉和下胚軸誘導(dǎo)形成的愈傷組織能夠正常誘導(dǎo)分化出叢生芽，但是由于下胚軸誘導(dǎo)出的愈傷組織體積較小，在規(guī)?；囵B(yǎng)中產(chǎn)量低于子葉誘導(dǎo)的愈傷組織，因此工廠化組培快繁體系應(yīng)選用子葉為外植體為最佳。

3 結(jié)論與討論

3. 1 喬永旭[ 15 ]以子葉、下胚軸、胚根3種器官為外植體誘導(dǎo)愈傷組織研究表明：黑果枸杞下胚軸誘導(dǎo)率最高，與本研究不一致，該現(xiàn)象可能是由于選取的植物生長素不同，及生長素與分裂素比例差異造成的。植物組織培養(yǎng)過程中常用的生長素有2，4D，NAA、IAA等，生長素具有促進(jìn)細(xì)胞延長、誘導(dǎo)愈傷組織形成等作用，而常見的細(xì)胞分裂素6-BA、KT等能夠促進(jìn)植物細(xì)胞的分裂與膨大。當(dāng)植物生長素與細(xì)胞分裂素的比值低時(shí)，有利于叢生芽誘導(dǎo)，當(dāng)比值高時(shí)，有利于生根誘導(dǎo)。

3. 2 高濃度的細(xì)胞分裂素會(huì)導(dǎo)致玻璃化苗的出現(xiàn)，尤其是6-BA濃度與玻璃化苗的發(fā)生呈顯著正相關(guān)，因此在植物組織培養(yǎng)中6-BA的濃度不易過高。本研究結(jié)果表明：適于黑果枸杞愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的6-BA濃度在0.4 mg/L為宜。褐化是植物組織培養(yǎng)中常出現(xiàn)的顯現(xiàn)，褐化產(chǎn)物對(duì)植物組織細(xì)胞中的許多酶產(chǎn)生抑制作用，從而導(dǎo)致植物材料逐漸死亡。研究表明：多種植物組織培養(yǎng)外植體的選擇、培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。外植體的選擇以幼芽為佳，老齡外植體和根尖均有一定程度的褐化現(xiàn)象。此外，培養(yǎng)過程中溫度過高、光照時(shí)間過長、光照強(qiáng)度過大也是造成褐化的主要原因。

3. 3 本研究中組織培養(yǎng)基最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS + 2，4D 0.4 mg/L + 6-BA 0.2 mg/L;黑果枸杞下胚軸、子葉、胚根誘導(dǎo)愈傷組織率均高于98%，但莖和葉的誘導(dǎo)時(shí)間較短為15天。

參考文獻(xiàn)

[1] 藺定運(yùn)，? 李煒，? 甘青梅，? 等.? 黑果枸杞果實(shí)色素的初步研究[J].? 中國食品添加劑，? 1995（2）：? 5 - 9.

[2] 陳亮，? 張煒，? 陳元濤，? 等.? 響應(yīng)曲面法優(yōu)化黑果枸杞多糖的超聲提取工藝[J].? 食品科技，? 2015，? 40（1）：? 220 - 227.

[3] 任小娜，? 陳志梅，? 曾俊，? 等.? 黑果枸杞中原花青素提取條件的優(yōu)化與含量測(cè)定[J].? 食品與發(fā)酵工業(yè)，? 2015，? 41（1）：? 147 - 150.

[4] 韓愛芝，? 白紅進(jìn)，? 耿會(huì)玲，? 等.? 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取黑果枸杞葉片總黃酮的工藝研究[J].? 西北林學(xué)院學(xué)報(bào)， 2013，? 28（1）：? 114 - 118， 122.

[5] 馬繼雄.? 道地藥材黑果枸杞的應(yīng)用研究進(jìn)展及青海的發(fā)展前景[J].? 青海師范大學(xué)學(xué)報(bào)：? 自然科學(xué)版，? 2012， 28（3）：? 53 -56，? 85.

[6] 甘青梅，? 駱桂法，? 李普衍， 等.? 藏藥黑果枸杞開發(fā)利用的研究[J].? 青?？萍?，? 1997（1）：? 17 - 19.

[7] 馮建森，? 劉志虎.? 酒泉市野生黑果枸杞資源及利用[J].? 林業(yè)實(shí)用技術(shù)，? 2013（2）：? 62 - 64.

[8] 浩仁塔本，? 趙穎，? 郭永盛，? 等.? 黑果枸杞的組織培養(yǎng)[J].? 植物生理學(xué)通訊，? 2005（41）5：? 631.

[9] 馬彥軍，? 程艷青，? 張榮梅.? 黑果枸杞組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究[J].? 林業(yè)科技通訊，? 2015（5）：? 26 - 28.

[10] 楊寧，? 李宜珅，? 陳霞，? 等.? 黑果枸杞的組織培養(yǎng)和快速繁殖[J].? 西北師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），? 2：? 84 - 88.

[11] 孫曉紅，? 位書磊，? 宋強(qiáng)，? 等.? 黑果枸杞的葉片分化與快速繁殖[J].? 植物生理學(xué)報(bào)，? 2015（5）：? 653 - 658.

[12] 李冬杰.? 植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)黑果枸杞愈傷組織誘導(dǎo)、 增殖及分化的影響[J].? 河北林業(yè)科技，? 2016（4）：? 1 - 5.

[13] 冀菲，? 唐曉杰，? 程廣有.? 黑果枸杞組培繁殖培養(yǎng)基選擇[J].? 北華大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），? 2016，? 17（4）：? 537 - 538.

[14] 王祎，? 趙彤彤，? 楊魏，? 等.? 紅松成熟合子胚愈傷組織誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)條件[J].? 森林工程，? 2015，? 31（2）：? 5 - 7.

[15] 喬永旭.? 黑果枸杞高頻再生體系的建立[J].? 中藥材，2015，? 38（10）：? 2 031 - 2 034.

Establishment of Callus Induction of Non-bacterial Seedling

of Lycium ruthenicum

（The Key Laboratory of Forest and Forestry Ecological Engineering in Heilongjiang Province，? Heilongjiang Forest Engineering and Environment Research Institute，? Heilongjiang Harbin 150081）

Abstract This study selected Lycium ruthenicum as the main research object， using tissue culture technology， the effects of different concentrations of plant growth hormone and different explants on callus formation were studied， which could provide technical support for its protection and utilization of the wild. The results showed that the optimal callus induction medium was MS + 2，4D 0.4 mg·L-1 + 6-BA 0.2 mg·L-1. The callus rate of root， stem and leaf was more than 98%， but the induction time of stem and leaf was 15 days shorter.

Key words Lycium ruthenicum;? Callus induction;? Explant