抑制‘白花油茶’葉片外植體褐化和誘導(dǎo)愈傷組織的研究

黃國文，黃超超，譚 毅

（湖南科技學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 永州 425199）

油茶Camellia oleifera，屬山茶科Theaceae山茶屬Camellia[1]，是我國南方的木本油料樹種。油茶育苗主要是培育優(yōu)良無性系，但是所需的時(shí)間長，扦插很難生根，嫁接時(shí)成苗率低，因此很難在短時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)出優(yōu)良無性系[2]。植物組織培養(yǎng)技術(shù)在植物脫毒和快繁、獲取次級(jí)代謝產(chǎn)物以及利用基因工程等方面發(fā)揮著越來越重要的作用[3]。用無性系“湘林1號(hào)”和“湘林4號(hào)”油茶無菌苗的葉片、莖尖和莖段作為外植體，用IBA，KT，2,4-D和NAA四種激素[4]，6-BA和NAA[5]以及6-BA（2.0 mg·L-1）和2,4-D（0.5 mg·L-1）[6]都能夠容易地誘導(dǎo)出葉片愈傷組織，但是對(duì)于大田栽培的成熟油茶葉片，僅僅利用在培養(yǎng)基中加入一點(diǎn)激素的常規(guī)條件進(jìn)行組織培養(yǎng)，外植體褐化現(xiàn)象很普遍，存活率低，甚至全部外植體因褐化而死亡。外植體的褐化可能是外植體中多酚含量高和多酚氧化酶活性高引起的[5,7]。目前，抑制植物組織培養(yǎng)中外植體褐化的方法有多種，如接種前用100 mg·L-1維生素C（Vc）溶液浸泡非洲菊Gerbera jamesonii外植體1 h[8]，用Vc浸泡香蕉Musa nana芽[9]，用檸檬酸和Na2S2O3浸泡白玉蘭Magnolia denudata芽[10]，在培養(yǎng)基中添加活性炭（Ac）[11]和抗氧化劑[12]，在紅豆杉Taxus chinensis愈傷組織培養(yǎng)基中添加葡萄糖（Glu）和果糖[13-14]等都能夠抑制外植體褐化，提高外植體存活率及愈傷組織誘導(dǎo)率。油茶組織培養(yǎng)中，有低溫預(yù)處理油茶葉片7 d和培養(yǎng)基中加入0.3 mg·L-1Ac來抑制外植體褐化[6]的報(bào)道，但主要集中在改變培養(yǎng)基中激素種類和濃度配方上，對(duì)組培過程中的機(jī)理缺乏充分研究，距離實(shí)際應(yīng)用還有一定的距離，還不能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[15-16]。因此，用不同的油茶品種，不同生理狀態(tài)的植株甚至不同的器官來進(jìn)行組織培養(yǎng)，對(duì)于理解組織培養(yǎng)的機(jī)理和掌握油茶組培條件是很必要的。由于用油茶器官在培養(yǎng)基上培養(yǎng)無菌苗的時(shí)間長、生長慢，利用無菌苗作為外植體會(huì)延長油茶組培的時(shí)間，然而用大田栽培的油茶葉片作為外植體，節(jié)約實(shí)驗(yàn)費(fèi)用，減少步驟，加快組培進(jìn)程。

本研究以普通栽培‘白花油茶’葉片作為外植體，把‘白花油茶’嫩枝放在室內(nèi)進(jìn)行弱光培養(yǎng)，用 Vc漂洗外植體，在培養(yǎng)基中加入Ac和Vc防止培養(yǎng)時(shí)葉片外植體褐化，對(duì)激素配比、基本培養(yǎng)基類型、瓊脂含量和組合糖等因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，不同組合實(shí)驗(yàn)研究誘導(dǎo)油茶愈傷組織的最適培養(yǎng)條件，為再分化‘白花油茶’植株打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2016年3－6月，在湖南科技學(xué)院油茶示范基地采集‘白花油茶’的側(cè)枝頂部光照充足的一年生枝條，以葉片作為外植體進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒和取材方法 取室內(nèi)弱光處水培1～ 2 d的一年生枝條，用剪刀剪斷葉柄得到質(zhì)地稍厚的20片葉左右，在自來水下沖洗30 min，用棉花輕輕地擦洗后瀝干，切去葉柄和葉尖放入燒杯中帶到超凈工作臺(tái)上。用75%酒精消毒30 s后用無菌水反復(fù)沖洗3次，再用1.0 g·L-1HgCl2處理7 min，對(duì)于顏色深綠的較老葉片，消毒時(shí)間增加到10 min，用無菌水沖洗5次，最后瀝去水分，放置于無菌濾紙上。用滅菌的剪刀剪去葉片邊緣并切成1.5 cm×1.5 cm大小的外植體，用于進(jìn)一步的預(yù)處理和接種后培養(yǎng)。

1.2.2 ‘白花油茶’葉片外植體的防褐化方法

1.2.2.1 培養(yǎng)基中添加Vc和Ac對(duì)葉片外植體活性的效應(yīng) 在特定培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基，含有1.0 mg·L-16-BA和1.5 mg·L-12,4-D，瓊脂含量為7.0 g·L-1，蔗糖（Suc）含量為30 g·L-1，調(diào)節(jié)pH 5.8）上，分別添加0.2，0.3，0.4 g·L-1Vc，0.5，1.0，2.0 g·L-1Ac，其中以 0.3 g·L-1Vc分別與 0.5，1.0，2.0 g·L-1Ac的組合作為處理組，一組為不加Ac和Vc為對(duì)照組。將消毒瀝干的外植體接種到這些培養(yǎng)基上培養(yǎng)。每組接種10瓶，每瓶接種3個(gè)外植體，定期觀察和記錄結(jié)果。

1.2.2.2 Vc與Ac溶液漂洗外植體的活性效應(yīng) 酒精消毒后切好的葉片分成10組：對(duì)照組在無菌水中浸泡3 min，實(shí)驗(yàn)組分別在 0.2，0.3，0.4 g·L-1Vc溶液，1，2，3 g·L-1Ac粉末液體，0.2，0.3，0.4 g·L-1Vc與 1 g·L-1Ac粉末組合混合液中浸泡3 min。用1.0 g·L-1HgCl2處理并沖洗瀝干。然后將外植體接種到含有0.3 g·L-1Vc和1 g·L-1Ac的基本培養(yǎng)基上。每組接種5瓶，每瓶接種3個(gè)外植體，培養(yǎng)箱溫度在（25±2）℃。

1.2.2.3 室內(nèi)弱光下水培‘白花油茶’嫩枝對(duì)外植體活性的效應(yīng) 摘取帶有20片葉左右且有嫩葉展開的枝條3根，枝條長度10 cm左右，插在盛自來水的燒杯中，放置在室溫25℃的室內(nèi)光線較暗的角落分別培養(yǎng)1，2，3 d。每天下午取葉片消毒，0.3 g·L-1Vc預(yù)處理的制備外植體，接種在含有0.3 g·L-1Vc和1.0 g·L-1Ac的基本培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。每組接種5瓶，每瓶接種3個(gè)外植體，記錄外植體存活率及愈傷組織誘導(dǎo)情況。

1.2.3 誘導(dǎo)‘白花油茶’葉片外植體愈傷組織的單因素實(shí)驗(yàn) 取室內(nèi)弱光水培2 d的枝條上的葉片切取外植體，消毒后用 0.3 g·L-1Vc 漂洗 3 min，瀝干后用于接種。以 7.0 g·L-1瓊脂，30 g·L-1Suc，添加 0.3 g·L-1Vc和 1.0 g·L-1Ac的MS基本培養(yǎng)基；1 mg·L-1的6-BA和1 mg·L-1的2,4-D為最初培養(yǎng)基的成分。當(dāng)變動(dòng)一個(gè)因素時(shí)，其它因素與最初培養(yǎng)基中成分一致。植物激素濃度配比為0.5，1.0，1.5，2.0 mg·L-1的6-BA和1.5 mg·L-1的2,4-D以及 1.0 mg·L-1的 6-BA 和 0.5，1.0，1.5，2.0 mg·L-1的 2,4-D；瓊脂濃度為 6.0，6.5，7.0，8.0 g·L-1；基本培養(yǎng)基為 WPM，MS，1/2MS；糖類處理為 30 g·L-1Suc，30 g·L-1Suc，16 g·L-1Glu，30 g·L-1Glu，40 g·L-1Glu，15 g·L-1Suc + 15 g·L-1Glu，誘導(dǎo)愈傷組織的形成，總共21組，每組接種5瓶，每瓶接種3個(gè)外植體。觀察記錄外植體存活情況以及愈傷組織誘導(dǎo)情況。

1.2.4 組合實(shí)驗(yàn)優(yōu)化誘導(dǎo)愈傷組織的條件 根據(jù)植物激素配比、培養(yǎng)基類型、瓊脂濃度和糖類4個(gè)因素確定的適宜條件，按L9（34）正交實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行不同組合實(shí)驗(yàn)，得出‘白花油茶’最佳愈傷組織誘導(dǎo)條件。綜合評(píng)分為外植體成活率、愈傷組織誘導(dǎo)率和愈傷組織生長狀況得分之和。100%成活率計(jì)3分，100%誘導(dǎo)率計(jì)6分；愈傷組織長勢(shì)好計(jì)3分（長勢(shì)一般和長勢(shì)差依次減一分），愈傷組織表面疏松計(jì)2分（表面光滑致密計(jì)1分），愈傷組織的可見時(shí)間以15 d計(jì)3分，每增加1 d扣0.2分，每減少1 d加0.2分。

1.3 數(shù)據(jù)處理

在培養(yǎng)第 16天后觀察和統(tǒng)計(jì)外植體存活（仍然為綠色或者產(chǎn)生了愈傷組織）量以及褐化死亡（排除染菌死亡）量。計(jì)算外植體的存活率和愈傷組織誘導(dǎo)率，公式如下：

存活率（%）=（接種外植體總數(shù)－外植體褐化數(shù)）/接種外植體總數(shù)×100

誘導(dǎo)率（%）= 誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 抑制‘白花油茶’葉片外植體的褐化作用

2.1.1 在培養(yǎng)基中添加Vc和Ac對(duì)‘白花油茶’葉片外植體褐化的影響 植物組織培養(yǎng)過程中，外植體褐化是阻礙愈傷組織生長的最大因素，防止外植體褐化有利于誘導(dǎo)愈傷組織。在接種‘白花油茶’外植體的培養(yǎng)基中加入Ac和Vc對(duì)預(yù)防‘白花油茶’外植體褐化有一定的效果，也影響了愈傷組織誘導(dǎo)率（表1）。在培養(yǎng)基中單獨(dú)添加Ac的防褐化效果普遍優(yōu)于單獨(dú)加入Vc的作用，兩者一起加入對(duì)抑制外植體褐化的作用更強(qiáng)。1.0 g·L-1Ac和0.3 g·L-1Vc條件下的外植體存活率為70.0%，誘導(dǎo)率最高為33.33%?？赡苁怯捎赩c是一種抗氧化試劑，能夠防止外植體切口流出的多酚氧化成醌類褐化切口，但是隨著作用時(shí)間的增長Vc被降解，其還原態(tài)轉(zhuǎn)化成氧化態(tài)，導(dǎo)致多酚物質(zhì)的氧化從而使材料褐化。然而，Ac有吸附多酚的作用，且作用時(shí)間長，Vc和Ac兩者共同作用會(huì)更好地除去葉片細(xì)胞釋放的多酚物質(zhì)的作用，使外植體的細(xì)胞活性加強(qiáng)。

表1 培養(yǎng)基中添加Vc和Ac對(duì)‘白花油茶’葉片外植體褐化和愈傷組織的影響Table 1 Effect of addition of vitamin C or activated carbon or both in culture medium on browning of explant and callus

2.1.2 Vc與Ac溶液漂洗外植體對(duì)抑制外植體褐化的影響 在實(shí)驗(yàn)過程中，剛剪成小塊的‘白花油茶’葉片四周切口顏色會(huì)很快變成淺褐色，直接影響到外植體的存活率及愈傷組織誘導(dǎo)率。用Vc及Ac粉末溶液漂洗剪切的外植體可以減輕外植體褐化并提高愈傷組織誘導(dǎo)率（表2）。實(shí)驗(yàn)表明，單獨(dú)用Ac粉末的懸濁溶液漂洗外植體與空白組的結(jié)果相差不大，外植體存活率為67%左右，愈傷組織誘導(dǎo)率為30%左右，說明單獨(dú)用Ac粉末溶液漂洗外植體未能夠提高外植體的存活率。單獨(dú)使用 Vc漂洗外植體，外植體存活率及誘導(dǎo)率顯著提高，采用0.3 g·L-1Vc時(shí)效果最好，存活率為80.0%，誘導(dǎo)率為50.0%。這說明Vc溶液在前期處理外植體時(shí)可以較好地抑制酚類物質(zhì)氧化，防止外植體四周切口出現(xiàn)褐化。

與單獨(dú)使用0.3 g·L-1Vc相比，用0.3 g·L-1Vc和2.0 g·L-1Ac處理的外植體存活率從80.0%降到73.33%，誘導(dǎo)率從50.0%降低到48.0%。說明Ac與Vc溶液共同使用時(shí)，Ac也會(huì)對(duì)Vc產(chǎn)生一定的吸附作用，因而產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)。因此單獨(dú)使用0.3 g·L-1Vc溶液預(yù)處理外植體3 min有利于抑制酚類物質(zhì)氧化。

表2 Vc和Ac漂洗外植體對(duì)葉片外植體褐化和愈傷組織的影響Table 2 Effect of washing of explants with vitamine C and activated carbon on browning and callus

2.1.3 室內(nèi)水培嫩枝對(duì)抑制‘白花油茶’外植體褐化的影響 室內(nèi)水培枝條能夠影響‘白花油茶’外植體存活率和愈傷組織誘導(dǎo)率（表3）。室內(nèi)環(huán)境水培處理1～2 d的外植體存活率最高，達(dá)到80.0%以上，愈傷組織的誘導(dǎo)率也同樣。說明室內(nèi)水培處理后，可能使葉片表面疏松，降低葉片細(xì)胞中多酚氧化酶的活性，防止了外植體切口組織中多酚的氧化，因而提高了外植體存活率。

表3 室內(nèi)水培時(shí)間對(duì)抑制葉片外植體褐化和愈傷組織的影響Table 3 Effect of indoor water culture days on browning of explant and callus

2.2 誘導(dǎo)‘白花油茶’葉片外植體愈傷組織的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 外源激素濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響 外源植物激素配比影響‘白花油茶’外植體的愈傷組織的分化（表4）。6-BA濃度為1.0 mg·L-1，2,4-D濃度為2.0 mg·L-1時(shí)在第10天就誘導(dǎo)出愈傷組織，愈傷組織疏松、帶有淡淡的綠色；6-BA濃度為1.0 mg·L-1，2,4-D濃度為1.5 mg·L-1時(shí)，第12天可以誘導(dǎo)出愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率最大為52.67%。2,4-D的濃度低于1.0 mg·L-1時(shí)，愈傷組織較難形成，且出現(xiàn)的時(shí)間長，因此，在一定范圍內(nèi)提高2,4-D的濃度有利于愈傷組織的形成。

2.2.2 瓊脂濃度對(duì)外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響 在添加1.0 g·L-1Ac和0.3 g·L-1Vc的MS培養(yǎng)基中，瓊脂濃度對(duì)外植體存活率及愈傷組織誘導(dǎo)有影響（表5）。當(dāng)瓊脂濃度為6.5 g·L-1時(shí)，外植體存活率最大達(dá)到83.33%，此時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率為53.67%。當(dāng)瓊脂濃度大于6.5 g·L-1，隨著瓊脂濃度的增加，愈傷組織誘導(dǎo)率逐漸降低，而存活率先增加后降低。說明，瓊脂濃度過高可能阻礙營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞，導(dǎo)致愈傷組織出現(xiàn)較晚生長較慢；瓊脂濃度過低，可能使外植體細(xì)胞活性和外植體存活率降低而且容易引起愈傷組織的玻璃化。

表4 外源激素對(duì)外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 4 Effect of the exogenous hormones on the induction of callus of explants

表5 瓊脂濃度對(duì)‘白花油茶’外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 5 Effect of agar concentration on induction of callus of explants

2.2.3 培養(yǎng)基種類對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響 培養(yǎng)基種類對(duì)‘白花油茶’外植體愈傷組織誘導(dǎo)有影響（表6）。外植體在3種培養(yǎng)基上的愈傷組織的誘導(dǎo)率從大到小的順序依次為WPM>1/2MS>MS。在WPM培養(yǎng)基上，外植體存活率最高，第12天時(shí)出現(xiàn)愈傷組織，且愈傷組織致密、生長快。在MS培養(yǎng)基上，外植體第16天時(shí)出現(xiàn)愈傷組織，愈傷組織致密、生長較快。在1/2MS培養(yǎng)基上，外植體第15天時(shí)出現(xiàn)愈傷組織，愈傷組織疏松，生長較差。

表6 不同類型培養(yǎng)基對(duì)外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 6 Effect of different culture media on induction of callus of explants

2.2.4 糖的種類和濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響 培養(yǎng)基中糖的種類影響‘白花油茶’外植體愈傷組織的誘導(dǎo)形成（表7）。在含30 g·L-1Glu，40 g·L-1Glu或者15 g·L-1Suc + 15 g·L-1Glu的培養(yǎng)基上外植體存活率均達(dá)80%以上，外植體愈傷組織誘導(dǎo)率以15 g·L-1Suc + 15 g·L-1Glu最高，40 g·L-1Glu的為其次。在添加40 g·L-1Glu或者15 g·L-1Suc和15 g·L-1Glu的培養(yǎng)基上，分別在第9天和第8天誘導(dǎo)出愈傷組織。說明Glu誘導(dǎo)外植體分化出愈傷組織的作用優(yōu)于Suc。

表7 單獨(dú)Suc或Glu和兩者對(duì)外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 7 Effect of single sucrose or glucose and both on induction of callus of explants

2.3 組合實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以瓊脂濃度、植物激素配比和糖類型的三個(gè)較好水平與培養(yǎng)基類型進(jìn)行組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（表8），仿照正交實(shí)驗(yàn)L9（34）來進(jìn)行組合實(shí)驗(yàn)，并對(duì)各個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)分和極差分析（表9和表10），以確定誘導(dǎo)‘白花油茶’外植體愈傷組織生長的最佳組合條件。

表8 ‘白花油茶’外植體愈傷組織誘導(dǎo)組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 8 Experiment design for induction of callus of Camellia oleifera explants

表9 ‘白花油茶’愈傷組織誘導(dǎo)的組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 9 Result of the experiment

表10 ‘白花油茶’外植體愈傷組織誘導(dǎo)的組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析Table 10 Analysis on experiment result

極差分析表明，影響成熟‘白花油茶’外植體愈傷組織誘導(dǎo)的因素大小順序是糖類>植物激素配比>瓊脂濃度>培養(yǎng)基?！谆ㄓ筒琛庵搀w愈傷組織誘導(dǎo)的最優(yōu)培養(yǎng)條件為 WPM+6.5 g·L-1瓊脂+15 g·L-1Suc+15 g·L-1Glu+1.5 mg·L-12,4-D+1.0 mg·L-16-BA。

經(jīng)過驗(yàn)證，在最優(yōu)培養(yǎng)條件下，成熟‘白花油茶’植株葉片外植體的成活率為95%以上，愈傷組織誘導(dǎo)率為90%左右。本培養(yǎng)條件下獲得的愈傷組織（圖1）白色透亮，質(zhì)地疏松、長勢(shì)好。

圖1 接種第16天‘白花油茶’外植體的愈傷組織Figure 1 The callus of explant 16 days after inoculation

3 結(jié)論與討論

‘白花油茶’組織培養(yǎng)過程涉及到外植體及其細(xì)胞的生理過程的變化，外植體褐化導(dǎo)致愈傷組織形成受阻甚至細(xì)胞死亡是‘白花油茶’組織培養(yǎng)中最主要問題。油茶組培苗用芽和莖等器官培養(yǎng)成植株，成苗系數(shù)大，用來培養(yǎng)優(yōu)良無性系。無菌的組培苗器官作為外植體，可以免除消毒時(shí)對(duì)其的傷害，同時(shí)苗相對(duì)弱小、次生代謝產(chǎn)物積累少，有利于誘導(dǎo)愈傷組織形成。野外苗木由于受到空氣中微生物的污染和次生代謝產(chǎn)物積累較多，組培時(shí)外植體褐化嚴(yán)重、愈傷組織誘導(dǎo)率低，但是省略培養(yǎng)植株的步驟，節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間和成本，加快愈傷組織的培養(yǎng)進(jìn)程。取長度為10 cm左右的嫩枝在室內(nèi)弱光下水培1～2 d后的葉片作為外植體，可以提高其存活率，可能降低了其酶活力并消耗了葉內(nèi)淀粉。這與水培蘋果梨Pyrus pyrifolia ‘Pingguoli’組織來提高外植體存活率的結(jié)論相吻合[17]，在用HgCl2滅菌消毒外植體后，用0.3 g·L-1Vc溶液漂洗外植體一定時(shí)間，能夠洗去外植體切口上流出的多酚物質(zhì)提高了其成活率，但用Ac懸濁液漂洗外植體的效果差；在培養(yǎng)基里加入1.0 g·L-1Ac和0.3 g·L-1Vc溶液可以消除組培過程中外植體產(chǎn)生的多酚物質(zhì)的氧化作用，從而預(yù)防了外植體的褐化并提高了存活率。以糖類、激素配比、培養(yǎng)基種類和瓊脂含量4個(gè)因素進(jìn)行不同組合實(shí)驗(yàn)，表明影響外植體愈傷組織形成最主要的因素是糖類，其次是激素配比，可能15 g·L-1Glu + 15 g·L-1Suc的組合中Glu能夠快速進(jìn)入細(xì)胞，為細(xì)胞提供了快速能源物質(zhì)，從而刺激了因室內(nèi)弱光培養(yǎng)產(chǎn)生的葉片饑餓細(xì)胞的活性和對(duì)外界條件的反應(yīng)敏感性，促進(jìn)了愈傷組織的形成；激素配比雖然是愈傷組織形成不可缺少的，但是如果細(xì)胞活性小甚至失去活性這些激素也無法起作用。此外，WPM優(yōu)于MS，可能是WPM中的Ca2+濃度是MS的2倍，維生素B1濃度也明顯高于 MS。Ca2+能夠促進(jìn)細(xì)胞生長和分化，影響植物細(xì)胞的生長[18-19]，也是促進(jìn)愈傷組織形成的重要因素[20]；維生素B1在一定程度上可以提高愈傷組織的活力。如果培養(yǎng)1～2 d發(fā)現(xiàn)外植體邊緣褐化，立即剪去褐化部分，繼續(xù)放在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，這時(shí)外植體成活率幾乎達(dá)100%，愈傷組織的誘導(dǎo)率將會(huì)達(dá)到95%左右。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，‘白花油茶’葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最佳條件是以水培1～2 d的‘白花油茶’枝條的葉片作為外植體，并用0.3 g·L-1Vc漂洗外植體2～3 min。優(yōu)化的培養(yǎng)基配方為WPM + 6.5 g·L-1瓊脂 + 15 g·L-1Suc +15 g·L-1Glu + 1.5 mg·L-12,4-D + 1.0 mg·L-16-BA + 1.0 g·L-1Ac + 0.3 g·L-1Vc。葉片愈傷組織誘導(dǎo)包括防止外植體褐化以促進(jìn)外植體成活、刺激細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)條件的反應(yīng)活性和誘導(dǎo)愈傷組織形成，做好這3個(gè)方面的工作能夠有效提高愈傷組織的誘導(dǎo)率。

[1] 林秀艷，彭秋發(fā)，呂洪飛，等. 山茶屬油茶組和短柱茶組葉解剖特征及其分類學(xué)意義[J]. 植物分類學(xué)報(bào)，2008，46（2）：183－193.

[2] 王瑞，陳永忠，王湘南，等. 油茶優(yōu)良無性系葉片愈傷組織誘導(dǎo)研究[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究，2009，27（2）：35－39.

[3] 畢方鋮，譚曉風(fēng)，張智俊，等. 油茶離體培養(yǎng)誘導(dǎo)再生植株的研究[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究，2004，22（2）：5－9.

[4] 王瑞，陳永忠，王湘南，等. 不同外植體及植物激素對(duì)油茶愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（19）：29－32.

[5] 蔡冬元. 油茶葉片初始誘導(dǎo)培養(yǎng)技術(shù)研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，20：5－7.

[6] 劉海英. 油茶組培再生體系建立及愈傷組織誘導(dǎo)[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[7] 馮代弟，王燕，陳劍平. 植物組培褐化發(fā)生機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，27（6）：1108－1116.

[8] 張素勤，鄒志榮，耿廣東，等. 非洲菊組織培養(yǎng)抑制褐變現(xiàn)象的研究[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，35（2）：56－57.

[9] 何瓊英，張東方，王潤華. 抗壞血酸預(yù)處理阻止香蕉吸芽外植體褐變的研究初報(bào)[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，16（3）：79－82.

[10] 周麗艷，郭振清，秦子禹，等. 白玉蘭組織培養(yǎng)中的褐化控制[J]. 河北科技師范學(xué)院報(bào)，22（4）：9－12.

[11] 徐耀華，楊春華，劉曉波，等. 扁穗牛鞭草組織培養(yǎng)中褐化控制技術(shù)初探[J]. 草業(yè)科學(xué)，2013，30（2）：212－217.

[12] 彭思佳，丁力，劉清波，等. 抗褐化劑對(duì)荻外植體褐化和愈傷組織生長的影響[J]. 草原與草坪，2015，35（5）：7－11，16.

[13] 丁世萍，嚴(yán)菊強(qiáng)，季道藩. 糖類在植物組織培養(yǎng)中的效應(yīng)[J]. 植物學(xué)通報(bào)，1998，15（6）：42－46.

[14] 盛長忠，王淑芳，王寧寧，等. 紅豆杉愈傷組織培養(yǎng)中褐變現(xiàn)象的初探[J]. 南開大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，34（4）：120－122.

[15] 胡瑩，楊柳青. 山茶科植物組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（2）：6－9.

[16] 葛立雯，郭維，潘正康，等. 我國山茶屬植物組織培養(yǎng)研究文獻(xiàn)分析[J]. 福建林業(yè)科技，2015，42（1）：237－241.

[17] 陳蕾，曹后男，宗成文，等. 降低蘋果梨組培過程中外植體褐化的研究[J]. 北方園藝，2008，（10）：139－142.

[18] 余芳，左德遠(yuǎn)，孫大業(yè). 愈傷組織形成過程中鈣離子與激素誘導(dǎo)效應(yīng)的關(guān)系[J]. 實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào)，1991，24（4）：385－389.

[19] 敬碧，毛拉艾麥提·阿不都卡迪爾，王芳，等. 新疆紫草毛狀根愈傷組織誘導(dǎo)及其生長條件研究[J]. 新疆農(nóng)業(yè)學(xué)科學(xué)，2011，48（7）：1205－1209.

[20] 余芳，孫大業(yè). 鈣離子與植物愈傷組織形成的關(guān)系[J]. 科學(xué)通報(bào)，1990，24（4）：385－389.