杜仲葉提取物對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、免疫酶 活性及肝胰腺組織的影響

李軍濤　李金寶　冼健安　陳惠琴　張秀霞　鄭佩華　魯耀鵬　王冬梅

李軍濤1，李金寶2，冼健安1，陳惠琴1，張秀霞1，鄭佩華1，魯耀鵬1，王冬梅1*

（1中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所，海口 571101；2山東龍昌動(dòng)物保健品有限公司，山東 齊河 251100）

摘要：【目的】明確杜仲（Eucommia ulmoides）葉提取物在凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）餌料中的適宜添加量，為研發(fā)高效、無污染、無殘留的對(duì)蝦餌料配方提供參考依據(jù)。【方法】以凡納濱對(duì)蝦專用餌料為基礎(chǔ)餌料，分別添加0.1、0.2、0.3、0.5和0.7 g/kg的杜仲葉提取物，進(jìn)行為期6周的養(yǎng)殖試驗(yàn)，探究餌料中梯度添加杜仲葉提取物對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能、免疫相關(guān)酶活性及肝胰腺組織結(jié)構(gòu)的影響。【結(jié)果】綜合凡納濱對(duì)蝦的增重率、存活率和肥滿度3個(gè)指標(biāo)可知，添加0.3 g/kg杜仲葉提取物可有效改善凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能和個(gè)體存活率，同時(shí)降低凡納濱對(duì)蝦的餌料系數(shù)；隨杜仲葉提取物添加量的增加，凡納濱對(duì)蝦的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和酚氧化酶（PO）活性整體上呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，而丙二醛（MDA）水平的變化恰好相反，綜合各項(xiàng)指標(biāo)也是以0.3 g/kg添加量的效果最佳；梯度添加杜仲葉提取物對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺無明顯影響，仍保持完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但其B細(xì)胞數(shù)量明顯增多。【結(jié)論】餌料中添加杜仲葉提取物能有效提高凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能和免疫酶活性，并增加肝胰腺中具分泌功能的消化酶細(xì)胞，具有替代抗生素的潛能，實(shí)際生產(chǎn)中的最適添加量為0.3 g/kg。

關(guān)鍵詞： 凡納濱對(duì)蝦；杜仲葉提取物；生長(zhǎng)性能；免疫相關(guān)酶活性；肝胰腺

中圖分類號(hào)： S966.12； S963.739 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）09-1858-07

0 引言

【研究意義】凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）又名南美白對(duì)蝦，是當(dāng)前世界上養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大優(yōu)良品種之一（熊建華等，2011；姜松等，2018）。我國(guó)是凡納濱對(duì)蝦的主要養(yǎng)殖國(guó)，但一直存在蝦苗易發(fā)病、養(yǎng)殖成功率低、缺乏高效功能型配合餌料等問題，致使生產(chǎn)上曾大量不規(guī)范使用抗生素，導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性的同時(shí)給水產(chǎn)品質(zhì)量安全帶來極大隱患。我國(guó)經(jīng)濟(jì)正處在轉(zhuǎn)型升級(jí)的關(guān)鍵時(shí)期，加上人民群眾消費(fèi)觀念的轉(zhuǎn)變，現(xiàn)已逐漸禁止在動(dòng)物養(yǎng)殖過程中使用抗生素，因此尋求抗生素替代品成為養(yǎng)殖業(yè)的研究焦點(diǎn)，各類飼料添加劑也由化工型逐步轉(zhuǎn)向中藥型?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】杜仲（Eucommia ulmoides）是國(guó)家二級(jí)珍稀樹種，名貴滋補(bǔ)藥材，主要以皮入藥，種質(zhì)資源稀缺（馮風(fēng)和梁志榮，1996）。杜仲皮一般需生長(zhǎng)15—20年，而葉的資源相對(duì)豐富且易得，在發(fā)現(xiàn)其生理功能之前一直被視為廢棄物。近年來，國(guó)內(nèi)外專家對(duì)杜仲葉的成分（Leiss et al.，2009）及其藥效（李竹等，2004）進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)杜仲葉提取物中富含綠原酸、多糖及黃酮等有益成分（李冉等，2016），與杜仲皮的成分類似。以杜仲葉代替杜仲皮的可行性已在臨床、藥理上得到驗(yàn)證（季春，2017），一致認(rèn)為杜仲葉提取物作為飼料添加劑具有不產(chǎn)生耐藥性、基本無毒副作用、資源豐富等特點(diǎn)，具有替代抗生素的潛能，即杜仲葉提取物是一種非常具有開發(fā)價(jià)值的中藥飼料添加劑。在飼料中適量添加杜仲葉提取物對(duì)畜禽及魚類的生產(chǎn)性能均有促進(jìn)作用，具體表現(xiàn)為促進(jìn)生長(zhǎng)（呂武興等，2005；胡忠澤等，2006；陳敬佳，2017）、增強(qiáng)非特異性免疫（王軼等，2015；段俊紅等，2016）、提高抗應(yīng)激能力（石英等，2008）和抗氧化能力（林建斌等，2015）、改善肉質(zhì)等（孫文通，2017）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】杜仲葉活性成分具有降血糖、降血脂、抗菌、抗病毒、提高免疫力、清除自由基、抗衰老等功能作用（李燕舞等，2017），但至今有關(guān)杜仲葉提取物對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能、免疫功能及肝胰腺功能的影響鮮見研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】探究基礎(chǔ)餌料中梯度添加杜仲葉提取物對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能、免疫相關(guān)酶活性及肝胰腺組織結(jié)構(gòu)的影響，確定其在凡納濱對(duì)蝦餌料中的適宜添加量，為研發(fā)高效、無污染、無殘留的對(duì)蝦餌料配方提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

選擇苗場(chǎng)健康的凡納濱對(duì)蝦蝦苗培育至體長(zhǎng)2.5 cm左右，隨機(jī)分為6組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾蝦，蝦苗初始體重0.193±0.002 g/尾。杜仲葉提取物由山東龍昌動(dòng)物保健品有限公司提供，凡納濱對(duì)蝦基礎(chǔ)餌料購(gòu)自廣東海大集團(tuán)股份有限公司。在基礎(chǔ)餌料中分別添加0.1、0.2、0.3、0.5和0.7 g/kg的杜仲葉提取物作為試驗(yàn)餌料，配制前先將杜仲葉提取物充分溶解，采用梯度稀釋的方法配制各試驗(yàn)餌料，制好的餌料自然風(fēng)干，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?，飼喂前須將餌料解凍至室溫。

1. 2 養(yǎng)殖管理

2017年5—7月在海南寶萊生物科技有限公司蝦苗場(chǎng)進(jìn)行為期6周的養(yǎng)殖試驗(yàn)。采用長(zhǎng)×寬×高為50 cm×40 cm×40 cm的養(yǎng)殖箱進(jìn)行養(yǎng)殖，水深25 cm左右，整個(gè)飼養(yǎng)期間保持水質(zhì)穩(wěn)定，水溫28～33 ℃，溶氧量在6.0 mg/L以上，pH 7.8～8.5，氨氮0.02～0.04 mg/L，亞硝酸鹽0.02～0.04 mg/L，鹽度15‰～18‰。每天投喂4次餌料，日投餌量為蝦總重的5%～8%，根據(jù)蝦的攝食情況和水溫進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)。每次投喂后40 min利用虹吸管收集殘餌，經(jīng)烘箱70 ℃烘干后記錄投喂量和殘餌量。每2周稱重1次，用以矯正投餌率。

1. 3 樣品采集

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后禁食24 h，測(cè)定各組對(duì)蝦體重，記錄對(duì)蝦尾數(shù)。每箱隨機(jī)抽取6尾對(duì)蝦，測(cè)量其體長(zhǎng)和體重，抽取血淋巴，在冰盤上解剖分離肝胰臟和腸道并稱重，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 指標(biāo)測(cè)定

1. 4. 1 生長(zhǎng)性能指標(biāo)

餌料系數(shù)=每缸投喂飼料總量/每缸對(duì)蝦總增重量

肥滿度（%）=體重/體長(zhǎng)3×100

肝體比（%）=肝胰臟重/體重×100

增重率（%）=（終末蝦體總重-初始蝦體總重）/

初始蝦體總重×100

存活率（%）=終末尾數(shù)/初始尾數(shù)×100

1. 4. 2 免疫相關(guān)酶活性指標(biāo) 參照試劑盒（南京建成生物工程研究所）說明測(cè)定免疫相關(guān)酶活性。

1. 4. 3 肝胰腺組織切片制作 肝胰腺組織切片委托基爾頓生物科技（上海）有限公司制作。

1. 5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，利用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncans多重比較，并采用Origin 8.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 添加杜仲葉提取物對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響

由表1可知，對(duì)蝦存活率隨杜仲葉提取物添加量的增加呈先升后降的變化趨勢(shì)，其中0.1、0.2和0.3 g/kg組的對(duì)蝦存活率均顯著高于未添加杜仲葉提取物的對(duì)照組（P<0.05，下同），并以0.3 g/kg組的對(duì)蝦存活率最高，為94.44%。0.7 g/kg組的對(duì)蝦增重率最低（496.49%），對(duì)應(yīng)的餌料系數(shù)（1.940）顯著高于其他試驗(yàn)組。隨杜仲葉提取物添加量的增加，對(duì)蝦肥滿度也呈先升后降的變化趨勢(shì)，其中0.2、0.3、0.5和0.7 g/kg組對(duì)蝦的肥滿度顯著高于對(duì)照組。綜合各項(xiàng)生長(zhǎng)性能指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)杜仲葉提取物在基礎(chǔ)餌料中的最適添加量為0.3 g/kg。

2. 2 添加杜仲葉提取物對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫相關(guān)酶活性的影響

2. 2. 1 對(duì)凡納濱對(duì)蝦超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響 餌料添加杜仲葉提取物對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺和血清中SOD活性的影響如圖1所示。無論是肝胰腺SOD活性還是血清SOD活性，對(duì)照組與各杜仲葉提取物添加組間的差異均不顯著（P>0.05，下同）；血清SOD活性以0.3 g/kg組最高，肝胰腺SOD活性則以0.2 g/kg組最高。

2. 2. 2 對(duì)凡納濱對(duì)蝦丙二醛（MDA）水平的影響 餌料添加杜仲葉提取物對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺和血清中MDA水平的影響如圖2所示。在對(duì)蝦血清中，0.1 g/kg組的MDA水平顯著高于對(duì)照組和0.3 g/kg組，其他杜仲葉提取物添加組與對(duì)照組間差異不顯著；在對(duì)蝦肝胰腺中，0.7 g/kg組的MDA水平顯著高于對(duì)照組和其他杜仲葉提取物添加組。

2. 2. 3 對(duì)凡納濱對(duì)蝦過氧化氫酶（CAT）活性的影響 餌料添加杜仲葉提取物對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺和血清中CAT活性的影響如圖3所示。對(duì)照組對(duì)蝦的血清CAT活性顯著低于0.1、0.2、0.3和0.5 g/kg組，但各杜仲葉提取物添加組間差異不顯著，其中以0.2、0.3和0.5 g/kg組的CAT活性較高，分別為4.23、4.17和4.22 U/mg；在對(duì)蝦肝胰腺中，對(duì)照組的CAT活性顯著低于各杜仲葉提取物添加組，以0.2 g/kg組的CAT活性最高，達(dá)6.20 U/mg。

2. 2. 4 對(duì)凡納濱對(duì)蝦谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性的影響 餌料添加杜仲葉提取物對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺和血清中GSH-Px活性的影響如圖4所示。在對(duì)蝦血清中，對(duì)照組與各杜仲葉提取物添加組間差異不顯著，其中以0.2和0.3 g/kg組的杜仲葉提取物添加組較高，分別為66.43和66.38 U；在對(duì)蝦肝胰腺中，0.3、0.5和0.7 g/kg組的GSH-Px活性顯著高于對(duì)照組，其中又以0.7 g/kg組的最高，達(dá)56.34 U。

2. 2. 5 對(duì)凡納濱對(duì)蝦酚氧化酶（PO）活性的影響 餌料添加杜仲葉提取物對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清PO活性的影響見圖5。隨杜仲葉提取物添加量的增加，對(duì)蝦血清PO活性呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，以0.3 g/kg組的PO活性最高，達(dá)3.77 U/mg，顯著高于對(duì)照組和0.7 g/kg組。

2. 3 餌料添加杜仲葉提取物對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺組織結(jié)構(gòu)的影響

由圖6可看出，對(duì)照組與各杜仲葉提取物添加組對(duì)蝦肝胰腺組織細(xì)胞均保持完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，未出現(xiàn)肝胰腺壞死癥狀，說明各試驗(yàn)組對(duì)蝦的肝胰腺組織基本正常。R細(xì)胞：呈高柱狀，細(xì)胞核位于近基部，呈圓形或橢圓形，有1～2個(gè)核仁，主要功能是吸收和儲(chǔ)存能量。F細(xì)胞：呈高柱狀，細(xì)胞核呈橢圓形或圓形，核仁明顯，有1～3個(gè)核仁，其功能是吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和合成蛋白質(zhì)。B細(xì)胞：體積最大且形狀不規(guī)則，胞質(zhì)中含有1～2個(gè)大液泡，占細(xì)胞體積的80%～90%，主要功能是分泌消化酶及消化蛋白質(zhì)。E細(xì)胞：細(xì)胞個(gè)體小，呈多邊形，細(xì)胞核較大，呈圓形或橢圓形，有l(wèi)～3個(gè)核仁，其生理功能是分裂和分化為其他類型的肝胰腺細(xì)胞。通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，0.2、0.3和0.5 g/kg組對(duì)蝦肝胰腺組織中的B細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組和0.1、0.7 g/kg組，說明這3組對(duì)蝦的消化酶分泌量較多，與生長(zhǎng)性能中的增重率變化趨勢(shì)一致。其他幾種細(xì)胞增加的數(shù)量不明顯。

3 討論

近年來，已有研究證實(shí)杜仲提取物或鮮杜仲可促進(jìn)水生動(dòng)物生長(zhǎng)性能提高的物種有鯉魚（Cyprinus carpio）（王華朗等，2003）、羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）（Liu et al.，2010）、凡納濱對(duì)蝦（劉波等，2013）和中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis H. Milne-Edwards）（季延濱等，2015）等。本研究結(jié)果表明，餌料中添加杜仲葉提取物對(duì)凡納濱對(duì)蝦增重率、存活率、肥滿度的影響均呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，未表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系，可能與杜仲葉本身的藥用成分有關(guān)，達(dá)到最適添加劑量后繼續(xù)增加反而產(chǎn)生負(fù)作用。綜合這3個(gè)指標(biāo)可知，添加0.3 g/kg杜仲葉提取物可有效改善凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能和個(gè)體存活率。此外，在餌料中添加0.3 g/kg杜仲葉提取物能有效降低凡納濱對(duì)蝦的餌料系數(shù)，可能與杜仲本身具有保肝護(hù)膽的功效有關(guān)。相對(duì)于高等生物，凡納濱對(duì)蝦生理構(gòu)造較簡(jiǎn)單，其肝胰腺既是解毒免疫器官又是消化器官，與凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)及免疫密切相關(guān)。本研究初步確定杜仲葉提取物能有效提高凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能，且以0.3 g/kg的添加量最優(yōu)，但作為綠色無公害的保健型餌料添加劑還需進(jìn)一步探究驗(yàn)證。

邱果等（2008）研究表明，對(duì)小鼠注射40 mg/kg的杜仲葉醇提取物可顯著提高其巨噬細(xì)胞的吞噬能力及血清中的溶血素含量，進(jìn)而提高其免疫力；王新軍等（2013）按2.06 g/kg的劑量以杜仲提取物對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠進(jìn)行灌胃，6周后大鼠肝臟的T-AOC、T-SOD、GSH-Px、CAT活性均顯著高于對(duì)照組（灌胃生理鹽水），即杜仲提取物可有效保護(hù)大鼠肝臟組織的抗氧化能力。在水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖中，杜仲提取物主要作為飼料添加劑使用。如在彭澤鯽（Carassius auratus var. pengze）餌料中添加1500 mg/kg杜仲提取物后其NBT陽性細(xì)胞、溶菌活力和抗菌活力較對(duì)照組明顯升高（姚紅梅，2005）；投喂添加杜仲提取物的餌料可有效提高斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）抗白斑病毒的能力（Balaubramanian et al.，2008）；在草魚（Ctenopharyngodon idellus）餌料中添加4%杜仲葉粉和0.10%、0.15%杜仲葉提取物均能極顯著提高SOD活性（P<0.01）（冷向軍等，2008）。本研究發(fā)現(xiàn)，隨杜仲葉提取物添加量的增加，凡納濱對(duì)蝦的SOD、CAT、PO和GSH-Px活性整體上呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，而MDA水平恰好相反，綜合各項(xiàng)指標(biāo)以0.3 g/kg組的效果最佳，可能是杜仲葉提取物中含有的綠原酸、丁香脂素雙糖苷、地普黃酮等有效成分具有殺菌抑菌和抗氧化作用，能消除動(dòng)物體內(nèi)過多的自由基，從而提高機(jī)體的非特異性免疫。

本研究以添加杜仲葉提取物的餌料投喂凡納濱對(duì)蝦，結(jié)果表明，對(duì)照組和各杜仲葉提取物添加組對(duì)蝦肝胰腺組織細(xì)胞均保持完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，未出現(xiàn)肝胰腺壞死癥狀，能保證個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育的需求。0.2、0.3和0.5 g/kg組對(duì)蝦肝胰腺組織中的B細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組和0.1、0.7 g/kg組。B細(xì)胞作為消化酶分泌的功能性細(xì)胞，其數(shù)量增加標(biāo)志著添加杜仲葉提取物后對(duì)蝦肝胰腺的消化吸收能力明顯增強(qiáng)。但與免疫和分化相關(guān)的R細(xì)胞、F細(xì)胞、E細(xì)胞未出現(xiàn)明顯的增加或減少，可能是生理狀態(tài)處于正常或適宜條件下這些細(xì)胞未得到生態(tài)環(huán)境變化的足夠刺激時(shí)無法顯示出來。但在集約化的高密度養(yǎng)殖模式中，養(yǎng)殖環(huán)境通常隨自然環(huán)境和養(yǎng)殖密度的改變而發(fā)生變化，因此對(duì)蝦肝胰腺組織中R細(xì)胞、F細(xì)胞和E細(xì)胞的變化規(guī)律還需進(jìn)一步試驗(yàn)探究。

4 結(jié)論

餌料中添加杜仲葉提取物能有效提高凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能和免疫酶活性，并增加肝胰腺中具分泌功能的消化酶細(xì)胞，具有替代抗生素的潛能，實(shí)際生產(chǎn)中的最適添加量為0.3 g/kg。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）