復(fù)方苦玄參顆粒急性毒性和亞慢性毒性試驗(yàn)

鄧鑫　陸彥蓉　覃蘭遷　黃茂高

摘要：【目的】分析復(fù)方苦玄參顆粒對(duì)昆明小鼠的急性毒性作用和對(duì)Wistar大鼠的亞慢性毒性作用，評(píng)價(jià)其用藥安全性，為復(fù)方苦玄參顆粒的獸醫(yī)臨床用藥提供理論依據(jù)?！痉椒ā考毙远拘栽囼?yàn)以SPF級(jí)昆明小鼠為研究對(duì)象，分3次灌胃，測(cè)定復(fù)方苦玄參顆粒對(duì)昆明小鼠的急性毒性作用。亞慢性毒性試驗(yàn)選取Wistar大鼠為研究對(duì)象，設(shè)高、中、低3個(gè)劑量組[13.40、6.70和3.35 g/kg（以復(fù)方顆粒計(jì)）]，每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥35 d，分別于第1、7、14、21、28和35 d稱重，給藥結(jié)束后對(duì)各劑量組Wistar大鼠（雌、雄各半）進(jìn)行眼球采血，用于血常規(guī)指標(biāo)和血清生化指標(biāo)檢測(cè)；同時(shí)采集肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、腸道、睪丸（♂）或子宮（♀）等器官稱重，計(jì)算各器官的臟器系數(shù)，以及固定后制作石蠟切片，用于組織病理學(xué)檢測(cè)?！窘Y(jié)果】急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，昆明小鼠在最大給藥量（80.40 g/kg）下未表現(xiàn)出任何毒性反應(yīng)，解剖也未發(fā)現(xiàn)明顯可見的病理變化。亞慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，各劑量組Wistar大鼠的體重、血常規(guī)指標(biāo)、血清生化指標(biāo)和臟器系數(shù)與對(duì)照組（生理鹽水灌胃）Wistar大鼠相比均未發(fā)生顯著變化（P>0.05）；經(jīng)剖檢和組織病理學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)高劑量組和對(duì)照組Wistar大鼠的脾臟、肺臟、肝臟、腎臟、胃、腸道、睪丸（♂）或子宮（♀）等器官組織均未出現(xiàn)異常病理變化。【結(jié)論】復(fù)方苦玄參顆粒無急性毒性作用，長(zhǎng)期用藥也不會(huì)產(chǎn)生亞慢性毒性作用，具有很高的用藥安全性，可在獸醫(yī)臨床上推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞： 復(fù)方苦玄參顆粒；急性毒性；亞慢性毒性：用藥安全性

中圖分類號(hào)： S853.74 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）09-1873-07

0 引言

【研究意義】中藥復(fù)方制劑是由兩種或兩種以上的中藥材組方而成，含有多種有效成分，能直接殺滅或抑制病原及增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力，且具有毒性低、不易產(chǎn)生副作用、多靶點(diǎn)、病原微生物對(duì)其不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，在抗菌抗病毒的同時(shí)能促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)（李艷華等，2008；王志敬等，2016；靳二輝等，2018）。中藥復(fù)方制劑成分極其復(fù)雜，且多不明確，因此復(fù)方藥物相互間產(chǎn)生的配伍效果需預(yù)先通過毒理學(xué)試驗(yàn)來檢驗(yàn)其安全性，以減少或避免藥物在臨床運(yùn)用時(shí)產(chǎn)生拮抗作用等不良反應(yīng)，即中藥復(fù)方制劑的安全性闡述和正確評(píng)價(jià)已成為當(dāng)今新型中藥開發(fā)及審核的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】復(fù)方苦玄參顆粒是以廣西道地藥材苦玄參和桃金娘根為主要藥味、按一定比例提取制備獲得的中藥復(fù)方顆粒劑?？嘈ⅲ≒icria felterrae Lour.）又名苦草，玄參科植物，味苦性寒，具有消腫止痛、清熱解毒的功效，主要用于治療咽喉腫痛、風(fēng)熱感冒、細(xì)菌性痢疾和毒蛇咬傷等（秦秀霞，2014）；桃金娘根是桃金娘的干燥根部，又名崗稔根、稔子根，具有理氣止痛、利濕止瀉、收斂、去瘀止血及益腎養(yǎng)血等功效（肖婷等，2013）。目前，針對(duì)苦玄參的藥效已有大量研究報(bào)道，證實(shí)苦玄參具有鎮(zhèn)痛（周芳等，2006）、抑菌（黃燕等，2008）、抗炎解熱（李萍等，2007；吳建璋等，2012；陳君等，2013）、中樞抑制及心血管調(diào)節(jié)（邱燦華等，2008）等藥效作用。其中，王奇志等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，精制的苦玄參提取物對(duì)胃竇癌、胃癌、殘骨癌等癌細(xì)胞均表現(xiàn)出細(xì)胞毒活性， 即具有一定的抗癌作用；吳建璋等（2012）研究表明，苦玄參干燥全草經(jīng)水提和大孔樹脂純化所獲得的提取物能抑制由二甲苯引導(dǎo)誘發(fā)的小鼠耳郭腫脹及腹腔毛細(xì)血管的通透性；陳君（2013）研究發(fā)現(xiàn)，以60%乙醇對(duì)苦玄參葉進(jìn)行提取所得的提取物除了具有抗炎作用外，對(duì)小白鼠蛋清足跖腫脹也有抑制作用。在桃金娘的藥效研究方面，Sepici-Dincel等（2007）以家兔為動(dòng)物模型，經(jīng)舌下注射桃金娘油后與正常家兔進(jìn)行比較，結(jié)果證實(shí)桃金娘油具有明顯的降血糖作用；Limsuwan和Voravuthikunchai（2008）研究發(fā)現(xiàn)，桃金娘葉提取物能強(qiáng)烈影響化膿性鏈球菌體內(nèi)各種酶的重要代謝途徑；陳旭和杜正彩（2010）研究表明桃金娘多糖對(duì)大鼠急性肝損傷有保護(hù)作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】根據(jù)新獸藥臨床前研究階段要求，需使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物開展相關(guān)安全性試驗(yàn)以考察產(chǎn)品開發(fā)的可行性。安全性試驗(yàn)一般包括急性毒性、長(zhǎng)期毒性和特殊毒性研究，必要時(shí)需進(jìn)行毒代動(dòng)力學(xué)研究，以證明藥物的安全性問題。復(fù)方苦玄參顆粒是本課題組以廣西道地藥材苦玄參和桃金娘根為主要藥味、按一定比例提取制備獲得，具有清熱瀉火、消炎止痢等功效（徐楊峰等，2018），但目前尚無有關(guān)復(fù)方苦玄參顆粒安全性評(píng)價(jià)的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過觀察復(fù)方苦玄參顆粒對(duì)昆明小鼠的急性毒性作用和對(duì)Wistar大鼠的亞慢性毒性作用，評(píng)價(jià)其用藥安全性，為復(fù)方苦玄參顆粒的獸醫(yī)臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

8周齡SPF級(jí)昆明小鼠（動(dòng)物合格證號(hào)XCXK桂2015-0001，體重20±2 g）和4周齡清潔級(jí)Wistar大鼠（動(dòng)物合格證號(hào)XCXK桂2015-0002，體重80～120 g）均購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌雄各半，試驗(yàn)前在人工照明12 h、通風(fēng)良好的條件下飼養(yǎng)觀察7 d；灌胃前禁食12 h，但不限制飲水；試驗(yàn)期間飼喂大鼠全價(jià)鼠料，飼養(yǎng)環(huán)境為SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房。復(fù)方苦玄參顆粒（批號(hào)20151113）由廣西北斗星動(dòng)物保健有限公司生產(chǎn)提供，每1.00 g復(fù)方顆粒相當(dāng)于原生藥1.80 g，其最大溶解度為5.36 g復(fù)方顆?？扇芙庥?.0 mL無熱原蒸餾水中，即每毫升中含0.67 g復(fù)方顆粒（相當(dāng)于每毫升含1.21 g原生藥）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 急性毒性試驗(yàn) 預(yù)試驗(yàn)：取SPF級(jí)昆明小鼠12只，隨機(jī)分為3組，每組4只，按高（0.8 mL/只）、中（0.4 mL/只）、低劑量（0.2 mL/只）一次性灌胃給藥，對(duì)照組則以生理鹽水灌胃（0.8 mL/只），結(jié)果發(fā)現(xiàn)即使在高劑量組也未能測(cè)出半數(shù)致死量（LD50），說明復(fù)方苦玄參顆粒毒性低，因此需采用24 h內(nèi)多次給藥的方法測(cè)定藥物最大給藥量，以評(píng)價(jià)復(fù)方苦玄參顆粒毒性。正式試驗(yàn)：采用最大耐受劑量法，選取SPF級(jí)昆明小鼠40只，禁食12 h后分為2組（給藥組和對(duì)照組），每組20只，雌雄各半。稱重后采取灌胃給藥，24 h內(nèi)分3次灌胃，間隔8 h，每次給藥劑量均為最大耐受劑量26.80 g/kg（以復(fù)方顆粒計(jì)）；對(duì)照組每次灌胃生理鹽水（0.4 mL/只），24 h內(nèi)分2次灌胃。給藥后持續(xù)觀察30 min，在最后1次給藥結(jié)束后2 h進(jìn)行觀察，此后每天定時(shí)對(duì)昆明小鼠進(jìn)行觀察，連續(xù)觀察7 d，記錄昆明小鼠的行為、精神狀態(tài)和排泄情況等臨床癥狀，若出現(xiàn)中毒癥狀則增加觀察頻率和時(shí)間，詳細(xì)記錄毒性反應(yīng)出現(xiàn)和消失的時(shí)間、死亡時(shí)間等相關(guān)信息。試驗(yàn)期間保證昆明小鼠可自由采食和飲水，試驗(yàn)結(jié)束后將所有存活昆明小鼠處死，進(jìn)行病理學(xué)檢查，并按毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的急性毒性反應(yīng)。

1. 2. 2 亞慢性毒性試驗(yàn) 選取Wistar大鼠80只，隨機(jī)分為4組，每組20只，雌雄各半，初始個(gè)體差異不超過平均體重的±20%。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)給藥劑量組，高劑量組按照最大灌胃量2.0 mL/100 g進(jìn)行灌胃，中、低劑量組依次按照等比系數(shù)1∶2的劑量進(jìn)行灌胃，即高、中、低劑量組分別為13.40、6.70和3.35 g/kg（以復(fù)方顆粒計(jì)）。另設(shè)對(duì)照組，按1.0 mL/100 g的劑量灌服生理鹽水。試驗(yàn)期間，每天定時(shí)按劑量灌胃給藥1次，觀察記錄各組Wistar大鼠的行為表現(xiàn)、中毒及死亡情況，記錄其飲水量和采食量，并于第1、7、14、21、28、35 d分別稱重。試驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)所有Wistar大鼠進(jìn)行眼球采血，每只大鼠的血樣分成2份：一份以抗凝劑抗凝，用于血常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)；另一份靜置析出血清，用于檢測(cè)血清生化指標(biāo)。完成采血工作后，每組選取10只Wistar大鼠（雌雄各半）進(jìn)行剖檢，稱取主要器官的重量，計(jì)算各器官的臟器系數(shù)；同時(shí)采集肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、腸道、睪丸（♂）或子宮（♀）等器官組織進(jìn)行固定和制作石蠟切片，用于組織病理學(xué)檢測(cè)。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，并以t檢驗(yàn)分析各試驗(yàn)組與對(duì)照組的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

昆明小鼠24 h內(nèi)灌胃給藥3次，每次0.8 mL/只，結(jié)果發(fā)現(xiàn)即使在最大給藥量2.4 mL/只[80.40 g/kg（以復(fù)方顆粒計(jì)）]下，昆明小鼠也未表現(xiàn)出任何毒性反應(yīng)。經(jīng)過7 d的連續(xù)觀察后處死所有昆明小鼠，通過解剖未發(fā)現(xiàn)明顯可見的病理變化。說明復(fù)方苦玄參顆粒對(duì)昆明小鼠無急性毒性作用，臨床用藥安全可靠。

2. 2 亞慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果

2. 2. 1 復(fù)方苦玄參顆粒對(duì)Wistar大鼠日常狀態(tài)和體重增長(zhǎng)的影響 高、中、低劑量組及對(duì)照組的Wistar大鼠在35 d的給藥期間，其活動(dòng)、攝食、飲水和排泄糞便均表現(xiàn)正常，未出現(xiàn)中毒癥狀，也無死亡現(xiàn)象。由表1和表2可看出，雌、雄性Wistar大鼠的體重增長(zhǎng)速率與對(duì)照組相比均無顯著差異（P>0.05，下同），表明復(fù)方苦玄參顆粒對(duì)Wistar大鼠體重增長(zhǎng)無明顯影響。

2. 2. 2 復(fù)方苦玄參顆粒對(duì)Wistar大鼠血常規(guī)指標(biāo)及血清生化指標(biāo)的影響 由表3和表4可看出，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各劑量組Wistar大鼠血常規(guī)指標(biāo)中的紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（Ec）、血紅蛋白（Hb）、白細(xì)胞計(jì)數(shù)（Lc）、嗜堿性粒細(xì)胞（BL）、嗜酸性粒細(xì)胞（AL）、中性粒細(xì)胞（NL）、淋巴細(xì)胞（LM）和單核細(xì)胞（ML），以及血清生化指標(biāo)中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、血糖（Glu）、血清白蛋白（Alb）、總蛋白（TP）、總膽固醇（CHO）和甘油三酯（TG）與對(duì)照組Wistar大鼠相比差異均不顯著，表明復(fù)方苦玄參顆粒對(duì)Wistar大鼠血常規(guī)指標(biāo)及血清生化指標(biāo)無明顯影響。

2. 2. 3 復(fù)方苦玄參顆粒對(duì)Wistar大鼠臟器系數(shù)的影響 由表5和表6可看出，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各劑量組Wistar大鼠的臟器系數(shù)與對(duì)照組Wistar大鼠相比也無顯著差異，表明復(fù)方苦玄參顆粒對(duì)Wistar大鼠的臟器無明顯影響。

2. 2. 4 組織病理學(xué)檢查結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)束后剖檢Wistar大鼠，經(jīng)肉眼觀察均未發(fā)現(xiàn)任何異常和可疑病變。采集復(fù)方苦玄參顆粒高劑量組和對(duì)照組Wistar大鼠的肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、腸道、睪丸（♂）或子宮（♀）等器官組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。由圖1可看出，高劑量組和對(duì)照組Wistar大鼠的臟器均未出現(xiàn)異常病理變化，表明復(fù)方苦玄參顆粒對(duì)Wistar大鼠臟器組織無損害作用。

3 討論

苦玄參具有抗炎解熱、鎮(zhèn)痛、中樞抑制和抗腫瘤等作用，但其與桃金娘根配制復(fù)方顆粒的安全性評(píng)價(jià)至今尚無研究報(bào)道。中藥顆粒劑的優(yōu)點(diǎn)在于其保持了中藥有效成分的穩(wěn)定性，且在大規(guī)模生產(chǎn)、包裝和保存上十分便利（何龍和姚堯，2010）。與傳統(tǒng)中藥湯劑相比，顆粒劑中添加的輔料可避免湯劑味苦而導(dǎo)致不宜口服的缺點(diǎn)，以保證中藥有效成分能讓機(jī)體快速吸收而發(fā)揮藥效。此外，中藥顆粒劑保留了原中藥飲片的特征，并解決了沖劑、合劑和糖漿劑等不能隨證加減的缺點(diǎn)（于開彬，2008）。中藥復(fù)方制劑是否安全是進(jìn)一步研究其藥理毒理作用的基本保障，同時(shí)對(duì)評(píng)價(jià)新藥是否具備研發(fā)價(jià)值具有重要意義（李海燕，2015）。因此，進(jìn)行急性毒性和亞慢性毒性試驗(yàn)是評(píng)價(jià)復(fù)方苦玄參顆粒安全性的必要環(huán)節(jié)。中藥復(fù)方制劑的急性毒性通常采用半數(shù)致死量（LD50）進(jìn)行衡量（李玉平，2012），但大量研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)中藥的毒性一般很低，急性毒性試驗(yàn)通常無法按常規(guī)方法測(cè)定出LD50，為此本研究采用最大耐受劑量法進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，即當(dāng)用藥劑量大于5000 mg/kg時(shí)未出現(xiàn)動(dòng)物死亡，則表示未能測(cè)出LD50，可結(jié)束整個(gè)急性毒性試驗(yàn)。本研究中的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，昆明小鼠在最大給藥劑量為80.40 g/kg（以復(fù)方顆粒計(jì)）的條件下（其最大給藥量遠(yuǎn)超過5000 mg/kg）7 d內(nèi)均未出現(xiàn)任何毒性反應(yīng)和死亡現(xiàn)象，且進(jìn)食、排便等活動(dòng)正常，說明復(fù)方苦玄參顆粒對(duì)昆明小鼠無急性毒性作用。

亞慢性毒性試驗(yàn)是新獸藥臨床用藥前安全性評(píng)價(jià)中不可缺少的環(huán)節(jié)，通過不同劑量的長(zhǎng)期重復(fù)給藥，觀察不同劑量藥物長(zhǎng)期在動(dòng)物體內(nèi)可能發(fā)生的不良反應(yīng)，從而判斷藥物對(duì)靶器官和受試動(dòng)物的累積作用，并明確安全的可重復(fù)給藥劑量值區(qū)間，為臨床科學(xué)用藥提供理論依據(jù)（洪偉鳴等，2013）。在本研究的亞慢性毒性試驗(yàn)中，Wistar大鼠連續(xù)以灌胃方式給藥35 d，較一般采用的大鼠30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)多5 d，以便更好地發(fā)現(xiàn)藥物的亞慢性毒性作用。試驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方苦玄參顆粒對(duì)Wistar大鼠無亞慢性毒性作用，具體表現(xiàn)為：（1）各劑量組Wistar大鼠的體重增長(zhǎng)速率與對(duì)照組相比均無明顯差異；（2）復(fù)方苦玄參顆粒對(duì)Wistar大鼠血常規(guī)指標(biāo)及血清生化指標(biāo)無明顯影響；（3）各劑量組Wistar大鼠的臟器系數(shù)與對(duì)照組Wistar大鼠相比也無顯著差異；（4）組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示高劑量組和對(duì)照組Wistar大鼠的臟器均未出現(xiàn)異常病理變化。復(fù)方苦玄參顆粒對(duì)Wistar大鼠雖無亞慢性毒性作用，但其獸醫(yī)臨床科學(xué)用藥劑量仍需進(jìn)一步研究確認(rèn)。

4 結(jié)論

復(fù)方苦玄參顆粒無急性毒性作用，長(zhǎng)期用藥也不會(huì)產(chǎn)生亞慢性毒性作用，具有很高的用藥安全性，可在獸醫(yī)臨床上推廣應(yīng)用。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）