聚維酮碘對(duì)中華絨鰲蟹蟹種急性毒性實(shí)驗(yàn)和概率回歸分析

徐宇+楊鳶劼+葛家春+許志強(qiáng)+鄧燕飛

摘要：本實(shí)驗(yàn)為掌握聚維酮碘對(duì)中華絨鰲蟹蟹種的半致死劑量（LD50）。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，得到實(shí)驗(yàn)劑量的上限劑量對(duì)數(shù)值（Xk）和下限劑量對(duì)數(shù)值（Xi），實(shí)驗(yàn)組間距（d），再確定實(shí)驗(yàn)組藥物濃度。實(shí)驗(yàn)設(shè)1個(gè)對(duì)照組，7個(gè)實(shí)驗(yàn)組藥物濃度分別為15.85，19.50，23.99，29.51， 36.31， 44.67和54.95 mg/L。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組放置雌、雄蟹蟹種各10只，平均體重（5.95±0.48） g。以一次性給藥方式，觀察和記錄24 h和48 h實(shí)驗(yàn)蟹種的死亡情況。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件中概率單位程序進(jìn)行概率回歸分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，7個(gè)實(shí)驗(yàn)組聚維酮碘對(duì)中華絨鰲蟹蟹種24 h急性毒性試驗(yàn)死亡率分別為0、0、0.15%、0.35%、0.85%、0.95%、100.0%、100.0%。直線回歸方程：Y=-16.104 1 +11.519 2 log（Dose）， R2=0.897 4（P>0.8）。24 h半致死劑量（LD50）為25004 86 mg/L，95%可置信區(qū)間23.313 96～26.806 31 mg/L。48 h對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)蟹種在24 h基礎(chǔ)上均無死亡。

關(guān)鍵詞：聚維酮碘；中華絨鰲蟹；蟹種；急性毒性；SAS

聚維酮碘（povidone-iodum，PVP-I）又稱碘伏、強(qiáng)力碘等。是以高分子聚合物聚乙烯吡咯烷酮（PVP）為載體與碘絡(luò)合而成的不定型絡(luò)合碘，具有很好的水溶性和穩(wěn)定性。聚維酮碘以結(jié)合碘形式存在，只有少部分為游離碘，在溶劑中逐漸釋放游離碘，起到緩釋作用，具有極強(qiáng)的殺菌力和廣泛的殺菌譜[1-3]。聚維酮碘曾選用于美國(guó)阿波羅航天計(jì)劃太空實(shí)驗(yàn)室消毒而聞名于世，被美國(guó)藥典、英國(guó)藥典、日本藥典、馬丁代爾藥典和《中華人民共和國(guó)藥典》載入，是國(guó)際公認(rèn)的高效、廣譜、無毒的消毒殺菌產(chǎn)品。

中華絨鰲蟹（Eriocheir sinensis）為我國(guó)淡水養(yǎng)殖主要經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，其生活周期有三個(gè)階段[4]。在海水中孵出經(jīng)脫殼變態(tài)為大眼幼體，淡化后在淡水中變態(tài)生長(zhǎng)為蟹種，最后養(yǎng)成為成蟹。各生長(zhǎng)階段面臨著生理、生物和機(jī)械等不安全因素的影響。為獲得安全和便于操作的中華絨鰲蟹蟹種消毒藥物，實(shí)驗(yàn)選擇聚維酮碘，通過對(duì)蟹種的急性毒性試驗(yàn)，了解和掌握聚維酮碘對(duì)中華絨鰲蟹蟹種的半致死劑量（LD50）。旨在為中華絨鰲蟹養(yǎng)殖過程中的消毒和疾病預(yù)防提供依據(jù)和指導(dǎo)。

1料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)藥物聚乙烯吡咯烷酮絡(luò)合碘（C6H9I2NO），上海阿拉丁生化科技股份有限公司試劑級(jí)產(chǎn)品。中華絨鰲蟹取自江蘇省淡水水產(chǎn)研究所高淳河蟹養(yǎng)殖基地培育的長(zhǎng)江雙年系F1代蟹種。實(shí)驗(yàn)用水為曝氣自來水。玻璃水族箱大小為（90×30）cm。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1急性毒性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中華絨鰲蟹蟹種選擇無病癥、步足完整的健康個(gè)體。實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)7 d，投喂蛋白含量為32%，青島六和水產(chǎn)飼料有限公司生產(chǎn)的蟹種配合飼料。實(shí)驗(yàn)前停食1 d，排空腸道，實(shí)驗(yàn)期間不喂食。實(shí)驗(yàn)水體體積0.29 m3，水深10 cm，pH值6.5～8.5，水溫19.3 ℃。24 h氣泵充氣，確保溶氧5.0 mg/L以上。實(shí)驗(yàn)采用一次性給藥，觀察和記錄24 h和48 h實(shí)驗(yàn)蟹種的死亡情況，以玻棒輕觸實(shí)驗(yàn)蟹種不動(dòng)即判斷為死亡。

實(shí)驗(yàn)設(shè)1個(gè)對(duì)照組，7個(gè)藥物劑量組。每個(gè)實(shí)驗(yàn)劑量組放置雌蟹蟹種和雄蟹蟹種各10只。預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)8個(gè)藥物劑量為0，8.0，16.0，20.0，250，32.0，64.0和128.0 mg/L。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定實(shí)驗(yàn)劑量的上限劑量對(duì)數(shù)值（Xk）和下限劑量對(duì)數(shù)值（Xi），依據(jù)實(shí)驗(yàn)組間距公式d =（Xk-Xi）/（G-1），[d<0.155（0.08～0.10）]，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組藥物的對(duì)數(shù)劑量。

1.2.2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS/STAT13.1統(tǒng)計(jì)軟件中概率單位程序（PROBIT Procedure）進(jìn)行概率回歸分析[5]。概率單位程序選擇以藥物對(duì)數(shù)劑量[log10（Dose）]作為自變量，死亡概率單位為應(yīng)變量，利用最大可能率估計(jì)法找出回歸模型的參數(shù)估計(jì)值，建立直線回歸方程模型：Y = b0 + b1×log10（DOSE）。模型的適合度和概率值的95%置信區(qū)間，分別由選項(xiàng)LACKFIT和INVERSRCL定界。最后根據(jù)模型估算的概率值與實(shí)際估算值進(jìn)行比較，以PREDPPLOT圖表示兩者間的吻合程度。

設(shè)藥物分組標(biāo)志為A，劑量為DOSE，各次試驗(yàn)的死亡數(shù)為R，試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)為N，計(jì)算藥物的半致死劑量（LD50）。

SAS程序：

DATA a；

Input a dose r n；

PROC PROBIT LOG10；

MODEL r/n=dose/LACKFIT INVERSECL；

BY A；

RUN。

2結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)藥物劑量的確定

實(shí)驗(yàn)蟹種平均體重（4.56±0.53） g。24 h對(duì)照組死亡率為0。根據(jù)7個(gè)藥物劑量組24 h死亡率，選取16.0，20.0，25.0，29.0和55.0 mg/L為有效實(shí)驗(yàn)藥物劑量（表1）。

2.2聚維酮碘對(duì)中華絨鰲蟹蟹種的急性毒性影響

實(shí)驗(yàn)蟹種平均體重（5.95±0.48）g。24 h急性毒性試驗(yàn)對(duì)照組和15.85 mg/L藥物劑量組死亡數(shù)為0。19.50、23.99、29.51和36.31 mg/L藥物劑量組死亡數(shù)分別為3、7、17和19只。4467 mg/L和54.95 mg/L藥物劑量組死亡數(shù)均為20只。由此得到，24 h聚維酮碘對(duì)中華絨鰲蟹蟹種死亡率分別為0、0.15%、0.35%、085%、0.95%、100.0%、100.0%。48 h對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)蟹種在24 h基礎(chǔ)上均無死亡。

3討論

聚乙烯吡咯烷酮本身沒有抗菌作用，與碘絡(luò)合后碘在表面活性劑中的緩慢釋放，不僅增加了碘的溶解度，同時(shí)提高了碘溶液的穿透能力，達(dá)到持久消毒殺菌作用。聚維酮碘是唯一被中國(guó)藥典收載的含碘消毒制劑，對(duì)大部分細(xì)菌，真菌和病毒均有不同的抑菌和殺菌作用[6，7]。根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》（GB/T 31270.12-2014）中農(nóng)藥對(duì)魚類等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)，聚維酮碘為低毒類藥物?！段ｋU(xiǎn)化學(xué)品魚類急性毒性分級(jí)試驗(yàn)方法》（GB/T 21281-2007）中，聚維酮碘為急性毒性Ⅲ級(jí)。聚維酮碘性狀穩(wěn)定，使用簡(jiǎn)便，殺菌作用持久，刺激性低，不產(chǎn)生二次污染，無殘留毒性的特點(diǎn)，在水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖中主要用于魚卵、苗種和疾病防治的殺菌消毒[8-12]。

急性毒性試驗(yàn)是評(píng)價(jià)毒物最直接的方法。聚維酮碘對(duì)甲殼類養(yǎng)殖動(dòng)物幼體的毒性研究中，郭永軍[13]、熊斌[14]和李飛[15]等分別對(duì)凡納濱對(duì)蝦仔蝦、南美白對(duì)蝦仔蝦和青蝦幼蝦進(jìn)行了毒性研究報(bào)道。本次實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)中華絨鰲蟹蟹種進(jìn)行了24 h急性毒性試驗(yàn)，SAS/STAT13.1統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到直線回歸方程：Y=-16104 1 + 11.519 2 log10（Dose）， 24 h半致死劑量（LD50）值為25.00486 mg/L，95%可置信區(qū)間為23.313 96～26.806 31 mg/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果低于與劉慶坤[16]對(duì)三疣梭子蟹大眼幼體和Ⅰ仔蟹24 h LD50 36.661 mg/L和35.467 mg/L，鹽度是否對(duì)聚維酮碘有效碘穩(wěn)定性產(chǎn)生影響還待進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探討。

實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算半致死劑量（LD50）的方法很多，如目測(cè)法、改良冠氏法、序貫法、概率單位-對(duì)數(shù)圖解法、加權(quán)直線回歸法（Bliss）法等[17]。Bliss法是毒理學(xué)研究中常用的數(shù)據(jù)分析方法，SAS軟件分析系統(tǒng)中可以調(diào)用PROBIT過程來實(shí)現(xiàn)Bliss法。

本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用國(guó)際公認(rèn)的大型集成標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用軟件SAS（statistical analysis system）軟件包編寫程序[17-18]。數(shù)據(jù)語言程序建立臨時(shí)數(shù)據(jù)集a，輸入順序?yàn)樗幬飫┝浚╠oes），死亡數(shù)（n），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)（r）。調(diào)用PROBIT過程，選擇LOG10為藥物劑量取常用對(duì)數(shù)。MODEL語句以LACKFIT要求對(duì)失似進(jìn)行檢驗(yàn)；INVERSECL求出用原始藥物劑量所表達(dá)的各種反應(yīng)劑量。BY語句要求按分組劑量A分別計(jì)算。參數(shù)的估計(jì)通過概率單位（PROBIT Procedure）程序進(jìn)行概率回歸分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與函數(shù)值間的似合度，以皮爾遜卡方檢驗(yàn)（Pearson Chi-Square）和L.R卡方檢驗(yàn)（L.R.Chi-Square） 2種方法對(duì)曲線失似進(jìn)行檢驗(yàn)分析。檢驗(yàn)結(jié)果P值均大于0.05，似合優(yōu)度檢驗(yàn)結(jié)果支持PROBIT模型。

曲線似合檢驗(yàn)采用概率單位法分析，以對(duì)數(shù)藥物劑量作為自變量，死亡概率為應(yīng)變量，得到直線回歸方程。同時(shí)進(jìn)行了參數(shù)的假設(shè)檢驗(yàn)，得到直線回歸方程中截距（a），斜率（b）與對(duì)數(shù)半致死劑量（μ）、標(biāo)準(zhǔn)差（σ）間的關(guān)系。PREDPPLOT圖選項(xiàng)與ODS圖形觀察符合正態(tài)的公差分布，曲線的似合效果是滿意的。

運(yùn)用SAS軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，大大簡(jiǎn)化了繁鎖的運(yùn)算，運(yùn)算精密度高，使用者只需根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更改程序的數(shù)據(jù)部分，結(jié)果更加可靠。

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