補骨脂對維甲酸誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)疏松的治療

劉 穎 袁曉美 畢亞男 高玉娜 周 昆 李云章

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018)(2. 天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津市中藥藥理重點實驗室，天津 300100)

中藥補骨脂為豆科植物補骨脂(PsoraleacorylifoliaL.)的干燥成熟果實，始載于《開寶本草》，又名破故紙。性溫，味辛、苦。中醫(yī)常用于治療腎陽不足，陽痿遺精，遺尿尿頻，腰膝冷痛，腎虛作喘，五更泄瀉；外用治白癜風(fēng)，斑禿?，F(xiàn)代研究表明補骨脂有擴張冠脈、增加冠脈血流量、抗腫瘤、保肝、抗早孕、雌激素樣、抗骨質(zhì)疏松、抗前列腺增生、平喘、提高免疫力等作用[1]。補骨脂主要含香豆素類(主要為呋喃香豆素類，如補骨脂素psoralen和異補骨脂素isopsoralen等)；擬雌內(nèi)酯類(如補骨脂定psoralidin等)；黃酮類(主要有補骨脂甲素corylifolin、補骨脂乙素corylifolinin、補骨脂異黃酮corylin、補骨脂查耳酮bavachalcone等)；酚萜類(如補骨脂酚bakuchiol)化合物等，其中多個成分具有雌激素樣作用[2]。研究表明植物雌激素有著和天然雌激素相似的抗骨質(zhì)疏松癥作用，且少有雌激素樣副作用的發(fā)生。體外研究提示補骨脂中多個成分可能有抗骨質(zhì)疏松作用[3]，且體內(nèi)研究已經(jīng)證實作為補骨脂重要成分的補骨脂素和異補骨脂素對小鼠骨質(zhì)疏松有較好的治療作用[4]。

補骨脂常用方式為水煎，脂溶性的補骨脂酚等成分水煎基本不能提取出來，而水煎后剩余部分是否同樣具有抗骨質(zhì)疏松作用尚未有研究證實。為此，本實驗采用維甲酸致骨質(zhì)疏松模型，觀察補骨脂生藥、水提物及藥渣對維甲酸致骨質(zhì)疏松大鼠的影響，探討藥渣對大鼠骨質(zhì)疏松的療效，為補骨脂的合理應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

Wistar大鼠，60只，雌雄各半，體質(zhì)量190～210 g，SPF級，購自北京華阜康生物科技有限公司，合格證號：SCXK(京)2009-0004。動物飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，濕度40%～60%，自然光照。所用飼料為天津市華榮實驗動物科技有限公司生產(chǎn)全價顆粒飼料,許可證號：SCXK(津)2012-0001，飲用凈化自來水。

1.2 受試藥物

補骨脂生藥，由深圳華潤三九醫(yī)藥股份有限公司提供。補骨脂水提物，批號20120920，4.78 g生藥/g粉；補骨脂藥渣，批號20120920，1.33 g生藥/g粉；均為天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院王躍飛副研究員團隊制備提供。

1.3 試劑

維甲酸，戊巴比妥鈉(北京索萊寶科技有限公司)；堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(北京中生北控)；酸性磷酸酶(ACP)檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；乙醇，甲醛(天津市康科德科技有限公司)。

1.4 儀器

VivaCT40骨密度儀(瑞士，SCANCO Medical AG)；7020全自動生化儀(日本，Hitachi)；InfiniteM200多功能讀板儀(瑞士，TECAN)；AE200S電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；JJ2000精密電子天平(常熟雙杰測試儀器廠)；Micro 17 R高速離心機(美國，Thermo)；LDZ5-2型離心機(北京醫(yī)用離心機廠)。

1.5 方法

1.5.1分組及給藥：60只Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，隨機分為對照組、模型組、補骨脂生藥組(0.9 g生藥/kg)、補骨脂水提物組(0.9 g生藥/kg)、補骨脂藥渣組(0.9 g生藥/kg)5個組，每組12只。除對照組外，其余各組灌胃給予維甲酸70 mg/kg，連續(xù)14 d。造模后，大鼠依各組別劑量，按1 mL/100 g體質(zhì)量灌胃給藥，連續(xù)給藥8周，對照組及模型組給予相應(yīng)體積的飲用水。

1.5.2實驗數(shù)據(jù)采集：動物用戊巴比妥鈉麻醉后，腹主動脈取血并離心得血清，用全自動生化儀檢測堿性磷酸酶(ALP)，酸性磷酸酶(ACP)按試劑盒說明書進行檢測。取大鼠脛骨，用75%乙醇浸泡，每天換液，連續(xù)3 d，隨后置無水乙醇中長期保存。使用VivaCT 40骨密度儀進行脛骨CT掃描，進行骨密度分析。主要檢測指標(biāo)為骨密度(of BV)、骨連接度(Conn.D)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁分離度(Tb.Sp)。

1.6 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

給藥8周后，補骨脂生藥組，水提組，藥渣組的ACP與模型組相比均有明顯下降，有統(tǒng)計學(xué)意義。其中補骨脂藥渣組下降程度>生藥組>水提物組；比較ALP/ACP值，藥渣組>生藥組>水提物組>模型/對照組(見表1)。

表1 補骨脂給藥8周各組血清中ACP和ALP含量Table 1 Serumindexes of rats of each groupafter8 weeks’ administration

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

Note: Compared with model group，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

用VivaCT 40骨密度儀對大鼠脛骨進行骨CT掃描，各給藥組與模型組相比，生藥組、水提物組和藥渣組的骨密度要高于模型組，其中藥渣組具有顯著性；各給藥組的骨連接度和骨小梁數(shù)均顯著高于模型組，而骨分離度均顯著低于模型組，有統(tǒng)計學(xué)意義(見表2,圖1)。給藥后各組指標(biāo)與對照組均無統(tǒng)計學(xué)差異。

表2 補骨脂給藥8周各組大鼠脛骨CT指標(biāo)Table 2 CT indexes of rat tibia after 8weeks’ administration

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

Note: Compared with model group，*P<0.05，**P<0.01

表2 (續(xù))補骨脂給藥8周各組大鼠脛骨CT指標(biāo)Table 2 (Continued) CT indexes of rat tibia after 8weeks’administration

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

Note: Compared with model group，*P<0.05，**P<0.01

圖1 各組大鼠脛骨CT圖像Fig.1 3D spiral CT images of rat tibia

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是以骨量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，致使骨的脆性增加以致易于發(fā)生骨折的一種全身性的骨骼疾病[4]。維甲酸是維生素A的衍生物，可影響骨的生長、發(fā)育和代謝。維甲酸在用于腫瘤或銀屑病等治療當(dāng)中，常引發(fā)骨痛、骨質(zhì)疏松等不良反應(yīng)。有文獻報道，維甲酸可促進成骨細胞的增值和分化，又可增加破骨細胞的骨吸收，造成高轉(zhuǎn)化型的骨質(zhì)疏松，但總趨勢是骨吸收大于骨形成[5]。且大鼠灌胃給予維甲酸來引導(dǎo)建立模型，與去卵巢法相比，操作簡單，成模時間短，因此被許多研究者采用。本實驗中選用成年大鼠，灌胃給予維甲酸70 mg/kg，連續(xù)14 d建立骨質(zhì)疏松模型，且未出現(xiàn)其他文獻提到的高死亡率現(xiàn)象[6]。從脛骨CT重建圖像上看，維甲酸誘導(dǎo)的病變并不是典型的骨質(zhì)疏松狀態(tài)，其對軟骨組織的破壞更加明顯，與劉和娣等[7]研究結(jié)果相符。

預(yù)實驗中我們用活體進行掃描，希望在實驗過程中根據(jù)掃描結(jié)果決定是否繼續(xù)給藥，節(jié)約動物資源的同時還可以減少實驗中的誤差，保證同批大鼠實驗的準(zhǔn)確性。但活體掃描后大鼠死亡率達到3/4以上，解剖可見明顯的臟器損壞，可能與射線下暴露時間過長(掃描時間30 min)有關(guān)，故本實驗中采用離體CT掃描方法。

補骨脂不同工藝給藥治療，主要關(guān)注補骨脂藥渣對維甲酸骨質(zhì)疏松模型的治療作用，根據(jù)大鼠血清生化指標(biāo)及脛骨骨CT掃描結(jié)果，補骨脂藥渣組的骨密度、骨小梁數(shù)和骨連接度均明顯高于模型組，骨分離度明顯低于模型組，血清酸性磷酸酶比模型組顯著降低，且具有統(tǒng)計學(xué)意義。顯示補骨脂藥渣對維甲酸誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松模型的大鼠有治療作用，且治療效果顯著。中藥絕大多數(shù)來源于植物，其藥渣中含有粗纖維、粗蛋白、粗脂肪以及多種微量元素等。近年來，中藥藥渣主要從以下幾個方面進行再利用：再提取其他有效成分、用于栽培食用菌、用作飼料或飼料添加劑、制成有機肥料、處理廢水、用作生物質(zhì)能源、用作造紙原料、用于發(fā)酵生產(chǎn)等[8]。本研究證明了補骨脂藥渣對維甲酸造成的大鼠骨質(zhì)疏松有一定療效，為藥材的充分利用及開發(fā)制藥新工藝提供了理論依據(jù)。

自2005年韓國報道44歲婦女因以補骨脂泡茶飲用而導(dǎo)致急性膽汁淤積性肝損害[9]，近年來補骨脂的肝毒性成為研究熱點。前期研究發(fā)現(xiàn)，補骨脂水提物及其主要成分補骨脂素和異補骨脂素有肝毒性[10-11]，而本研究提示補骨脂藥渣同樣有良好藥效，如果其肝毒性較低，那么補骨脂水提取后的藥渣將成為一個新的可用部分。因此，補骨脂水提取后的藥渣的安全性考察將成為進一步研究的方向。