巴馬豬椎間盤退變模型的建立*

黃 明 孫瑩杰 張鐵錚 李 凱 鄭昊龍 何寶文 陳克研

(1.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院麻醉科， 沈陽 110016)(2.沈陽市第四人民醫(yī)院麻醉科，沈陽 110031)

椎間盤突出癥是骨科常見的疾病，尤以腰椎更為常見，雖然目前準確的病因尚未明確，但椎間盤的退變是這一過程的關鍵環(huán)節(jié)。為深入探討椎間盤退變的病因及病理生理機制，建立巴馬豬腰椎間盤退變模型具有一定的必要性，本實驗通過建立退變的巴馬豬椎間盤退變模型，產(chǎn)生與臨床相似病變癥狀，在實驗動物活體內(nèi)模擬并觀察椎間盤退變過程，生化物質(zhì)的檢驗分析及其他伴隨癥狀，從而為臨床椎間盤退變性疾病的研究提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取健康成年巴馬豬6頭(由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學實驗動物科提供)雌雄不限，體質(zhì)量50～60 kg，按數(shù)字表法隨機分為2組，每組3頭，分別為空白對照組(Con組)和造模組(Mod組)，在標準的飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)2周。2組巴馬豬的一般情況見表1。

表1 2組巴馬小型豬實驗前一般情況Table 1 The general situation of two groupsof Bama miniature pigs

1.2 動物模型建立

1.2.1麻醉與監(jiān)測:巴馬小型豬，術前禁食12 h，不禁水。術前取耳緣靜脈穿刺建立靜脈通路。靜注丙泊酚3.0 mg/kg體質(zhì)量；待呼吸減慢，肢體活動消失，角膜反射消失時，行氣管內(nèi)插管。麻醉成功后，將巴馬小型豬固定在手術臺上，持續(xù)泵入丙泊酚8 mL/h維持麻醉，術中監(jiān)測生命體征，調(diào)整給藥劑量。

1.2.2手術步驟:將豬麻醉成功后，進行生命體征監(jiān)測，開通靜脈通路，靜點生理鹽水，在生理鹽水中加160萬U青霉素預防感染，并對豬背部進行備皮，對手術區(qū)域進行常規(guī)消毒，鋪無菌洞巾，術中根據(jù)情況調(diào)整丙泊酚劑量。在具有影像引導(C形臂X光引導)手術室內(nèi)，將豬以左側(cè)臥位躺在射線手術臺上。

1.2.3椎間盤退變手術過程:在C形臂X光引導下確定豬L2-3、L3-4、L4-5、L5-6椎間隙，用1%的利多卡因進行浸潤麻醉，用16G的引導針沿定位點穿刺椎間盤。穿透纖維環(huán)后側(cè)后，呈放散狀將椎間盤進行針刺破壞。每個間盤進行6次穿刺，每個角度間隔30度，將椎間盤進行破壞，完成造模見圖1。術后將穿刺點外敷無菌敷料，并用膠布固定，繼續(xù)應用青霉素80萬U，連續(xù)應用3 d，每日觀察大小便以及飲食情況，1周后去除敷料，術后1個月行MR檢測驗證模型是否成功。

圖1 C形臂X光引導下進行椎間盤手術Fig.1 The C-arm X-ray guided the intervertebral disc operation

1.3 影像學檢查

在豬進行造模前、造模后1個月分別進行MR檢測，觀察椎間盤狀態(tài)，每次行MR檢查均將豬進行全麻，并監(jiān)測生命體征。進行MR后密切觀察豬的飲食及二便3 d，一切均正常后，進行統(tǒng)一飼養(yǎng)。并運用Pfirrmann分級系統(tǒng)進行評估[1]。

1.4 椎間盤HE染色觀察病理改變

放血處死，游離豬的脊柱，找出相對應的椎間盤，切開椎間盤周圍的韌帶及組織，進行鈍性分離，用手術刀將椎間盤切開，使上下兩個椎體分開，并取下纖維環(huán)，放入4%甲醛溶液中固定，對椎間盤組織進行HE染色。

2 結(jié)果

2.1 影像學(MRI)變化

Videman等[2]根據(jù)椎間盤含水量的變化將退變分為4級:I級,無明顯退變征象,表現(xiàn)為T2加權像均勻高信號；Ⅱ級,可見輕度退變征象,T2加權信號強度輕度降低；Ⅲ級，中度退變,信號強度中度降低,且不均勻；Ⅳ級,嚴重退變,信號缺失。

圖2 巴馬豬腰椎間盤MR檢測結(jié)果Fig.2 MRI results of intervertebral discs of Bama miniature pigs

MR檢測結(jié)果顯示：Con組巴馬豬椎間盤纖維環(huán)呈中等信號,髓核呈高信號影,纖維環(huán)信號略有不均勻,局部呈低信號影；Mod組巴馬豬椎間隙變窄，椎間盤后突，硬膜囊受壓，髓核信號基本喪失，椎間盤變型，由于造模過程中對組織損傷較大，部分椎體高度發(fā)生明顯變化(圖2)。

Pfirrmann分級顯示， Con組中的MR影像主要以Ⅰ～Ⅱ級為主，未見明顯的退變征象；Mod組中主要以Ⅲ～Ⅳ級為主，可見明顯的退行性改變，其中 Con組椎間盤的Ⅰ、Ⅱ級總數(shù)為100%，而Mod組Ⅰ、Ⅱ級總數(shù)為16.7%。

2.2 椎間盤形態(tài)學改變

HE染色結(jié)果顯示，Con組椎間盤未見明顯退變痕跡，髓核呈白色膠凍狀、含水豐富，清晰飽滿，纖維環(huán)結(jié)構清楚、呈同心圓排列，排列整齊，按Thompson分級為I級；而Mod組的椎間盤纖維化結(jié)構紊亂，纖維環(huán)局部明顯可見中斷,形成一個瘢痕樣針刺通道,貫穿整個纖維環(huán)及髓核,通道周圍組織廣泛硬化,并有骨贅形成， Thompson分級為Ⅳ～Ⅴ級，見圖3～4，表3。

圖3 2組巴馬豬間盤大體病理改變Fig.3 Gross pathological changes of plate among the two groups

圖4 2組巴馬小型豬椎間盤病理組織學變化 HE染色 ×100Fig.4 Histopathological changes of intervertebral discs in two groups of Bama miniature pigs by HE staining ×100

表3 2組豬椎間盤病理分級表Table 3 Pathological grading table of two groups ofporcine intervertebral disc

3 討論

椎間盤退變的動物模型的制作己有近百年的歷史。不同學者對椎間盤退變動物選擇不盡相同，至今已有鼠、犬、兔、羊、猴、豬等十余種動物成功建立了椎間盤退變模型[3]。根據(jù)退變的原因，模型的建立主要包括誘發(fā)性和自發(fā)性兩種[4-5]。誘發(fā)性模型既通過改變椎間盤生物力學結(jié)構、破壞椎間盤結(jié)構及進行基因敲除造成退變。自發(fā)性模型是通過特殊的飼養(yǎng)方法或者改變遺傳性狀造成的動物椎間盤退行性改變。在建立動物椎間盤退變模型中，多采用誘發(fā)性模型進行實驗，自發(fā)性退變模型因受退變機制不明確、實驗周期長等缺點在實驗中很少應用。誘發(fā)性椎間盤退變模型有手術直接損傷和化學損傷兩種方式[6]?；瘜W損傷方式相比于直接破壞來說，穩(wěn)定性較差，藥物劑量難以把握，所以目前基本以直接損傷為主。直接破壞椎間盤有3種方式：終板破壞、髓核抽吸和纖維環(huán)穿刺法。纖維環(huán)穿刺法誘發(fā)的退變相對較輕，退變的程度與穿刺損傷的程度呈正相關,適合于早期退變研究；終板破壞和髓核抽吸型退變模型造成椎間盤的破壞較重，誘發(fā)的退變出現(xiàn)時間較短,進展較快,比較適合于對中晚期退變的研究[7]。本研究實驗周期相對較長，研究手段是低強度激光進行治療，研究對象的椎間盤病變相對較輕，結(jié)構未發(fā)生特別重大改變，所以選擇的造模方式為針刺法。

在動物模型的物種選擇上,最佳的動物對象應屬靈長類及大型家畜，因為上述動物的解剖結(jié)構與人類最為接近,但由于實驗經(jīng)費和倫理等條件約束,無法得到廣泛應用。目前應用較多的模型是大鼠和兔子，但大鼠與兔子的椎間盤相對較小，椎間盤的力學結(jié)構與人類的相差較遠，無法完全滿足椎間盤的一些處置。豬的解剖結(jié)構與人類解剖相似，相比于大鼠、兔子等小型動物，豬的椎間盤較大，解剖結(jié)構差異小，容易進行較復雜的操作，是較為理想的實驗動物。國內(nèi)學者已應用豬進行椎間盤退行性變的造模，取得了良好的結(jié)果[8]。故本實驗選取巴馬小型豬作為此次的模型動物。

本實驗通過巴馬豬來模擬臨床患者，制成與臨床相似的椎間盤退變模型，穿刺造模后1個月進行MR檢查，發(fā)現(xiàn)進行穿刺的椎間盤出現(xiàn)間隙變窄，椎間盤后突，硬膜囊受壓，髓核信號缺失，纖維環(huán)變形等改變，按照Pfirrmann分級標準，處理后的椎間盤在Ⅲ～Ⅳ級。HE染色結(jié)果顯示，與Con組比較，Mod組內(nèi)的椎間盤髓核呈白色膠凍狀，穿刺部位椎間盤厚度下降，髓核發(fā)暗、含量減少，通道周圍組織廣泛硬化，纖維環(huán)結(jié)構粗糙。上述結(jié)果提示經(jīng)過細針穿刺后的椎間盤發(fā)生了明顯的的退行性改變。

總之，通過針刺破壞巴馬豬纖維環(huán)及椎間盤的方法，手術操作簡單，可以獲得一種可靠的椎間盤退行病變模型，并且MR和病理學檢查可精確地驗證模型的有效性。