人凝血酶原復(fù)合物中凝血因子活性測(cè)定的影響因素分析

陳華英，林偉華，洪 流，許景寧，高發(fā)平

（湛江中心人民醫(yī)院，廣東 湛江 524045）

歐洲藥典與英國藥典均明確規(guī)定，對(duì)于凝血酶原復(fù)合物，需測(cè)定凝血酶活性與激活凝血因子，以上兩項(xiàng)指標(biāo)，最終目的是確保人體注射制品后降低血栓的發(fā)生率。人凝血酶原復(fù)合物（PCC），是一種具有促進(jìn)血液凝固作用的靜脈注射血漿蛋白制劑，涉及有凝血因子（Coagulation factor，F(xiàn)）Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ，20 世紀(jì)60年代開始用于臨床，主要治療維生素K依賴的凝血因子缺乏癥、乙型血友病等[1]。近些年，諸多專家與學(xué)者不斷對(duì)其進(jìn)行深入研究，且關(guān)于口服香豆素類抗凝劑過量快速逆轉(zhuǎn)的研究引起了醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。自2011年以來，就國內(nèi)而言，PCC短缺現(xiàn)象日漸嚴(yán)重，現(xiàn)如今，諸多廠家致力于研究PCC的制備工藝與臨床應(yīng)用[2]。本文根據(jù)實(shí)踐，分析PCC中凝血因子活性測(cè)定的影響因素。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料（1）由華蘭公司提供的PCC。（2）由SIEMENS公司提供的 Coagulation factorⅡ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ Deficient Plasma。（3）來自SIEMENS公司的 Thromborel S、Actin、氯化鈣溶液。（4）FⅡ、FⅦ、FⅨ、FⅩ活性檢測(cè)試劑盒均由成都協(xié)和技術(shù)有限責(zé)任公司提供。（5）標(biāo)準(zhǔn)品1購自SIEMENS公司，標(biāo)準(zhǔn)品2購自NIBSC，標(biāo)準(zhǔn)品3購自成都協(xié)和技術(shù)有限責(zé)任公司。（6）Sigma p 4380硫酸魚精蛋白，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器 法國STA-R Compact血凝分析儀，金壇市醫(yī)療儀器廠生產(chǎn)的HH-W600恒溫水浴箱，Millipore公司提供的Milli-Q Advantage純水儀。

1.2 方法

1.2.1 空白測(cè)定 取1支塑料杯置凝血儀中，添加0.1 ml缺血小板血漿，再添加0.1 ml腦磷脂，混合均勻，保溫2 min，再添加0.1 ml Tris緩沖液，添加0.1 ml 0.025 mol/L CaCl2，記錄凝固時(shí)間。凝固時(shí)間≥200 s，試驗(yàn)成立，若＜200 s，表示試驗(yàn)不成立。

1.2.2 樣品測(cè)定（1）硫酸魚精蛋白。以《中國藥典》（2010版）[3]為指導(dǎo)，使用相對(duì)應(yīng)因子的乏漿（FⅨ用生理鹽水稀釋），對(duì)PCC制品進(jìn)行稀釋處理，配制成0.2 mg/ml硫酸魚精蛋白溶液，根據(jù)歐洲藥典，判定肝素鈉于PCC中最大含量。用3種不同的方法處理PCC樣品。樣本1，添加一定濃度的硫酸魚精蛋白溶液，混合均勻后，馬上測(cè)定因子活性。樣本2，不添加硫酸魚精蛋白溶液。樣品3，添加濃度相同的硫酸魚精蛋白溶液，以37℃為準(zhǔn)，將樣本2與樣本3進(jìn)行15 min溫浴處理。隨后，應(yīng)用全自動(dòng)凝血儀對(duì)4種凝血因子的活性進(jìn)行測(cè)定。

（2）鹽離子濃度。使用相應(yīng)乏漿（涉及FⅡ、FⅦ、FⅩ）與生理鹽水（涉及FⅨ），稀釋PCC制品于一定濃度后，添加NaCl，其中，1 mol/L、0.5 mol/L、0.25 mol/L分別為制備鹽離子3個(gè)梯度的濃度，在保證PCC制品中凝血因子濃度達(dá)到中國藥典標(biāo)準(zhǔn)的前提下，測(cè)定凝血因子活性。

（3）標(biāo)準(zhǔn)品。采用3種不同的標(biāo)準(zhǔn)品，制作有效的標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)中國藥典處理樣品，隨后，基于不同標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定PCC中凝血因子活性。

（4）不同廠家試劑。采用2套不同廠家的試劑，按照中國藥典處理PCC制品后，測(cè)定樣品中的凝血因子活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用Excel錄入本次研究所涉及的所有數(shù)據(jù)，采用SPSS 20.0軟件，計(jì)數(shù)資料采用百分比（%）表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用（±s）表示，進(jìn)行 t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示有顯著性。

2 結(jié)果

通過調(diào)節(jié)腦磷脂稀釋度，達(dá)到空白時(shí)間≥200 s的要求，其中，腦磷脂，按照 1∶3 000 稀釋。

2.1 硫酸魚精蛋白

PCC制品添加硫酸魚精蛋白與不加的相比凝血因子活性偏低，但差異無顯著性（P＞0.05）。添加硫酸魚精蛋白后，有無給予37℃溫浴，對(duì)凝血因子活性并無顯著性影響。PCC制品添加硫酸魚精蛋白，相比不加，F(xiàn)Ⅸ活性偏高；加硫酸魚精蛋白后，馬上進(jìn)行FⅨ活性測(cè)定，相比添加硫酸魚精蛋白且進(jìn)行37℃溫浴活性更高，但差異并不顯著（P＞0.05），見圖 1。

2.2 鹽離子濃度

在3種不同鹽離子濃度下，所測(cè)得的FⅦ、FⅨ活性不存在顯著性差異（P＞0.05）。相比高鹽離子濃度，低鹽離子濃度下，所測(cè)得的FⅡ、FⅩ活性更高，差異具有顯著性（P＜0.05），見圖2。

圖2 不同鹽離子濃度對(duì)PCC中凝血因子活性的影響

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品

對(duì)于FⅡ、FⅨ、FⅩ，不同標(biāo)準(zhǔn)品所測(cè)得的活性，標(biāo)準(zhǔn)品1＞標(biāo)準(zhǔn)品2＞標(biāo)準(zhǔn)品3；而FⅦ，則為標(biāo)準(zhǔn)品3＞標(biāo)準(zhǔn)品1＞標(biāo)準(zhǔn)品2，見圖 3。

2.4 不同廠家試劑

本次研究中，主要涉及SIEMENS公司與成都協(xié)和兩家的試劑，采用不同廠家試劑測(cè)定的凝血因子活性差異有顯著性（P＜0.05），見表 1。

3 討論

圖3 不同標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)PCC中凝血因子活性的影響

表1 采用不同廠家試劑測(cè)定PCC中凝血因子活性的比較[±s，IU/ml]

表1 采用不同廠家試劑測(cè)定PCC中凝血因子活性的比較[±s，IU/ml]

廠家 FⅦ1.6±0.0 2.8±1.0 FⅡSIEMENS成都協(xié)和7.3±0.8 3.5±0.3 FⅨ4.1±0.6 3.1±0.4 FⅩ4.1±0.3 5.9±1.0

硫酸魚精蛋白是一種硫酸鹽，屬于堿性蛋白，于體內(nèi)，中和肝素，導(dǎo)致肝素喪失抗凝活性[4]。從理論上講，硫酸魚精蛋白與肝素發(fā)生中和反應(yīng)后，所測(cè)定的凝固時(shí)間呈縮減趨勢(shì)，凝血因子活性升高。本研究中，凝血因子活性卻下降，出現(xiàn)此結(jié)果，可能與過量使用硫酸魚精蛋白有關(guān)。硫酸魚精蛋白屬于弱抗凝劑，過量使用可降低凝血因子活性。因此，臨床檢測(cè)時(shí)，可先對(duì)PCC中肝素含量進(jìn)行測(cè)定，為準(zhǔn)確測(cè)定凝血因子活性提供保障。

實(shí)踐中，乏漿較昂貴，外源因子測(cè)定時(shí)，一般未嚴(yán)格遵照藥典實(shí)施操作，使用配套稀釋劑或純水，進(jìn)行稀釋處理[5]。2005年版的《中國藥典》，明確規(guī)定FⅨ予以乏漿稀釋處理，而2010年版的《中國藥典》，規(guī)定采用生理鹽水予以稀釋，關(guān)于此變化的原因還需研究。

PCC生產(chǎn)工藝中多選用NaCl溶液、檸檬酸鈉作為洗脫劑，對(duì)于洗脫液，雖然予以了脫鹽處理，但還有些許NaCl殘留在PCC中，且濃度有所不同。因此，分析PCC中凝血因子活性受NaCl不同濃度的影響十分必要。就本次研究而言，在高濃度鹽溶液中凝血因子活性偏低，其中，在0.25 mol/L濃度下，相比其他2種濃度，F(xiàn)Ⅸ活性較低，但無顯著性差異。另外，不同標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)PCC中凝血因子活性有一定程度的影響。本研究中，分別采用SIEMENS公司與成都協(xié)和的試劑，檢測(cè)顯示，PCC中凝血因子活性差異明顯，可見，不同廠家的試劑對(duì)PCC中凝血因子活性亦有影響。

綜上所述，在實(shí)際操作中，應(yīng)綜合分析影響凝血因子活性測(cè)定的因素，采取行之有效的控制措施，減少干擾因素，保證測(cè)定結(jié)果的有效性。