右美托咪定對糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制

張世平,王 臻,金梅梅,朱 婧,常建華

糖尿病是心血管疾病并發(fā)心肌梗死的高危因素之一，可顯著增加心血管疾病的發(fā)病率及病死率[1-2]。近年來，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，全麻常用藥物對心肌缺血再灌注損傷(MIRI)有一定保護(hù)作用，但每種藥物的保護(hù)機(jī)制各不相同[3-4]。右美托咪定是一種新型鎮(zhèn)靜藥物，產(chǎn)生類似自然睡眠的鎮(zhèn)靜效果，且不會抑制呼吸，目前已在臨床得到廣泛應(yīng)用[5-6]。有研究顯示，炎性反應(yīng)在MIRI發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，右美托咪定可減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制炎性細(xì)胞因子的釋放，對MIRI有較好保護(hù)作用[7]。本研究擬通過建立糖尿病大鼠模型，旨在探討右美托咪定減輕糖尿病大鼠MIRI的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 66只SPF級健康雄性SD大鼠，年齡約為10周齡，體重為190～210 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號:SCXK(陜)2012-003；鹽酸右美托咪定注射液(江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，產(chǎn)品批號：20170102，規(guī)格：2 ml：0.2 mg)；鏈脲佐菌素(上海如吉生物科技發(fā)展有限公司，產(chǎn)品編號：UM013，規(guī)格：100 ml)；伊文思藍(lán)溶液(上海翊圣生物科技有限公司，產(chǎn)品編號：60528ES08，規(guī)格：5 g)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑溶液(上海滬震實(shí)業(yè)有限公司，CAS編號：298-96-4)。

1.2實(shí)驗(yàn)動物模型建立 將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組30只與糖尿病組36只，由專人分籠進(jìn)行飼養(yǎng)，適應(yīng)性自由進(jìn)食4周后禁食、不禁水12 h，糖尿病組大鼠將鏈脲佐菌素50 mg/kg溶解于0.1 mmol/L枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖液(pH 4.2)中，經(jīng)腹腔注射于大鼠體內(nèi)，72 h后采尾靜脈血測定血糖水平，若血糖≥16.7 mmol/L達(dá)1周并出現(xiàn)明顯多尿、多飲癥狀者表示大鼠糖尿病模型造模成功，繼續(xù)高脂高糖飼料喂養(yǎng)，期間每周測1次血糖，血糖不達(dá)標(biāo)剔除實(shí)驗(yàn)，4周后最終36只糖尿病大鼠進(jìn)入后期實(shí)驗(yàn)。正常組大鼠腹腔注射等量的緩沖液，普食喂養(yǎng)8周進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.3大鼠MIRI模型的建立方法與分組 經(jīng)腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉溶液0.005 ml/g，麻醉后記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，行氣管切開置管連接微型動物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣，呼吸頻率為80～90/min，潮氣量2 ml/100 g，吸呼比1∶2，同時(shí)記錄心率及血壓變化情況。沿胸骨左緣開胸，暴露心臟，剪開心包，在左心耳下緣與肺動脈圓錐間可見冠狀動脈左前降支起始部，將備好的帶線縫合針環(huán)繞左冠狀動脈前降支根部穿線結(jié)扎，以生理鹽水紗布覆蓋，心電圖可見ST段弓背向上抬高，提示結(jié)扎成功。缺血30 min后剪開結(jié)扎線，恢復(fù)血流使冠狀動脈再灌注，可見左心室前壁轉(zhuǎn)為紅色，心電圖可見抬高的ST段降低，提示再灌注成功，再灌注2 h后取出心臟，預(yù)冷生理鹽水沖洗后濾紙吸干，稱重全心質(zhì)量[8]。將所選大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、缺血再灌注組、右美托咪定組,每組10只，糖尿病假手術(shù)組、糖尿病缺血再灌注組、糖尿病右美托咪定組，每組12只。假手術(shù)組大鼠僅穿線而未結(jié)扎，缺血再灌注組與右美托咪定組大鼠均采用左前降支結(jié)扎30 min后再灌注2 h的方法建立MIRI模型。右美托咪定組大鼠在缺血前30 min經(jīng)股靜脈注射右美托咪定10 μg/kg，其余組大鼠在缺血前經(jīng)股靜脈給予等量生理鹽水。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1心肌梗死面積的測量：于再灌注維持2 h時(shí)，再次結(jié)扎左冠狀動脈前降支，于股靜脈緩慢注入1 ml 1%伊文思藍(lán)溶液，取出大鼠心臟，用預(yù)冷PBS溶液漂洗數(shù)次后將心臟放入-20℃冰箱冷凍2 h，沿心臟縱軸從心尖開始垂直將其均勻切成2 mm厚薄片，置于1% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑溶液、37℃水浴箱(pH值7.4)中避光染色15 min，之后將心肌切片浸于4%多聚甲醛溶液中固定10 min。采用Image-J軟件[9]測量相關(guān)區(qū)域面積，藍(lán)色染色區(qū)域?yàn)檎Ｐ募?，灰白色染色區(qū)域?yàn)楣Ｋ绤^(qū)心肌(AN)，紅色染色區(qū)域?yàn)槿毖垂Ｋ佬募?AAR)，每個處理組最終取5只大鼠心臟進(jìn)行染色，計(jì)算并統(tǒng)計(jì)AN/AAR變化。

1.4.2大鼠實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測：大鼠于缺血再灌注2 h后從頸總動脈抽取3 ml動脈血置于肝素抗凝管內(nèi)，在4℃條件中靜置60 min后以3000 r/min的速度離心10 min，取上清液分裝于Eppendorf管中并標(biāo)記，置-80℃冰箱冷凍保存，待測。通過氧化酶法測定甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)水平，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)水平，檢測儀器為奧地利公司提供的型號為ANTHOSHT11的全自動酶標(biāo)儀，具體操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1一般情況比較 糖尿病組大鼠體質(zhì)量、全心質(zhì)量小于正常組，空腹血糖(FBG)、TC及TG水平高于正常組(P<0.01)。見表1。正常組大鼠飲食、飲水、尿量正常，毛發(fā)無改變；糖尿病組大鼠“三多”癥狀明顯，毛發(fā)變黃且易脫落。

表1 正常組和糖尿病組大鼠一般情況比較

2.2血流動力學(xué)指標(biāo)的比較 6組大鼠基線平均動脈壓(MAP)、心率與心率收縮壓乘積(RPP)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；假手術(shù)組與糖尿病假手術(shù)組各時(shí)間段MAP、心率與RPP水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；除假手術(shù)組與糖尿病假手術(shù)組外，其余4組大鼠在缺血30 min與再灌注后MAP、心率與RPP水平低于基線(P<0.05)；與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組與右美托咪定組大鼠在缺血30 min與再灌注后MAP、心率與RPP水平較低(P<0.05)；與糖尿病假手術(shù)組比較，糖尿病缺血再灌注組與糖尿病右美托咪定組大鼠在缺血30 min與再灌注后MAP、心率與RPP水平降低(P<0.05)；與缺血再灌注組比較，右美托咪定組大鼠在缺血30 min及再灌注后30 min時(shí)MAP、心率與RPP水平均降低，再灌注后120 min升高(P<0.05)；與糖尿病缺血再灌注組比較，糖尿病右美托咪定組大鼠在缺血30 min及再灌注后30 min時(shí)MAP、心率與RPP水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，再灌注后120 min升高(P<0.05)。見表2。

2.3心肌梗死面積的比較 缺血再灌注組、右美托咪定組、糖尿病缺血再灌注組和糖尿病右美托咪定組AN/AAR分別為(43.47±1.12)%、(27.67±2.28)%、(46.36±1.18)%和(34.78±1.33)%。右美托咪定組AN/AAR低于缺血再灌注組，糖尿病右美托咪定組高于右美托咪定組，低于糖尿病缺血再灌注組(P<0.05)。

2.4血清TNF-α和IL-1β水平比較 糖尿病假手術(shù)組血清TNF-α和IL-1β水平與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組和右美托咪定組血清TNF-α和IL-1β水平較高(P<0.05)；與糖尿病假手術(shù)組比較，糖尿病缺血再灌注組與糖尿病右美托咪定組血清TNF-α和IL-1β水平較高(P<0.05)；與缺血再灌注組比較，右美托咪定組血清TNF-α和IL-1β水平降低(P<0.05)；糖尿病右美托咪定組血清TNF-α和IL-1β水平低于糖尿病缺血再灌注組(P<0.05)。見表3。

3 討論

MIRI是心肌梗死的病理生理學(xué)基礎(chǔ)之一。有研究報(bào)道，約75%的糖尿病患者死于冠狀動脈阻塞性疾病，當(dāng)糖尿病患者發(fā)生心肌梗死后，其心力衰竭發(fā)生率和病死率是非糖尿病患者的2～4倍[10]。由于糖尿病患者血糖水平較高，長時(shí)間的糖脂類物質(zhì)代謝紊亂會激活體內(nèi)炎性反應(yīng)與氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致多個臟器發(fā)生病理生理改變，其中心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變最常見。MIRI的發(fā)生機(jī)制目前尚未闡明，主要認(rèn)為是與氧自由基增加、心肌血流動力學(xué)改變、炎性反應(yīng)等有關(guān)[11]。針對MIRI的發(fā)生機(jī)制，廣大學(xué)者試圖尋找抑制MIRI的方法。缺血預(yù)處理是20世紀(jì)80年代提出的概念，其被證實(shí)對MIRI有很好的保護(hù)作用，但其也是一種創(chuàng)傷性操作，由于倫理學(xué)限制，在臨床應(yīng)用并不廣泛[12]。同時(shí)也有研究報(bào)道，并發(fā)糖尿病時(shí)，缺血預(yù)處理對MIRI的防護(hù)作用消失，故藥物預(yù)處理對MIRI防治作用的研究日漸增多[13]。

表2 6組大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)的比較情況

注：MAP為平均動脈壓，RPP為心率收縮壓乘積；與基線比較，aP<0.05;與假手術(shù)組比較，cP<0.05;與糖尿病假手術(shù)組比較，eP<0.05;與缺血再灌注組比較，gP<0.05;與糖尿病缺血再灌注組比較，iP<0.05

表3 6組大鼠血清TNF-α和IL-1β水平的比較情況

注：TNF-α為腫瘤壞死因子-α，IL-1β為白介素-1β；與假手術(shù)組比較，aP<0.05;與糖尿病假手術(shù)組比較，cP<0.05;與缺血再灌注組比較，eP<0.05;與糖尿病缺血再灌注組比較，gP<0.05

近年來大量研究表明，臨床常用的麻醉藥物具有保護(hù)缺血心肌的作用，其中靜脈麻醉藥比吸入麻醉藥的保護(hù)作用更強(qiáng)[7，14]。右美托咪定是一種高選擇性α2腎上腺素受體激動劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮、降低應(yīng)激反應(yīng)和穩(wěn)定血流動力學(xué)等作用，且不存在呼吸抑制，在減輕MIRI方面有著廣泛前景[15]。本研究結(jié)果顯示，除假手術(shù)組與糖尿病假手術(shù)組外，其余4組大鼠在缺血后與再灌注后的MAP、心率與RPP水平低于基線水平，提示發(fā)生MIRI后，正常大鼠的心功能明顯降低。右美托咪定組大鼠在缺血后及再灌注后30 min時(shí)MAP、心率與RPP水平均低于缺血再灌注組，再灌注后120 min時(shí)高于缺血再灌注組，提示通過右美托咪定預(yù)處理可以有效改善非糖尿病大鼠的心功能，對心肌有明顯保護(hù)作用。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，糖尿病右美托咪定組在缺血后及再灌注后30 min MAP、心率與RPP水平與糖尿病缺血再灌注組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在再灌注后120 min高于糖尿病缺血再灌注組，提示右美托咪定對糖尿病模型大鼠的心功能也有一定改善作用。

炎性反應(yīng)是參與MIRI過程的機(jī)制之一，通過降低炎性細(xì)胞因子水平，抑制炎性反應(yīng)，可以有效減少心肌梗死的面積，改善心功能[16-17]。TNF-α是活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的、一種能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞因子，是炎性反應(yīng)中出現(xiàn)最早的一種細(xì)胞因子，同時(shí)其對其他炎性因子的合成、釋放有促進(jìn)作用，當(dāng)TNF-α濃度較高時(shí)，會增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，促進(jìn)氧自由基生成，加重MIRI病情[18]。IL-1β是缺血再灌注損傷早期炎性介質(zhì)，缺血再灌注可誘發(fā)心肌產(chǎn)生IL-1β，從而導(dǎo)致相關(guān)的急性炎性反應(yīng)發(fā)生，同時(shí)IL-1β分泌也加重MIRI[19]。本研究結(jié)果顯示，與缺血再灌注組比較，右美托咪定組血清TNF-α和IL-1β水平較低，提示右美托咪定可有效抑制正常大鼠MIRI引起的炎性反應(yīng)，降低炎性因子水平。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，糖尿病右美托咪定組血清TNF-α和IL-1β水平均低于糖尿病缺血再灌注組，提示右美托咪定可有效抑制糖尿病大鼠MIRI引起的炎性反應(yīng)，有抗炎作用。

心肌梗死面積可一定程度反映MIRI的損傷程度[20-21]。本研究結(jié)果顯示，與缺血再灌注組比較，右美托咪定組大鼠的AN/AAR明顯降低，提示右美托咪定可以明顯縮小正常大鼠的心肌梗死面積，對非糖尿病大鼠的MIRI具有一定防護(hù)作用。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，與糖尿病缺血再灌注組比較，糖尿病右美托咪定組AN/AAR降低，提示右美托咪定對糖尿病大鼠的心肌梗死面積有縮小作用，說明在并發(fā)糖尿病的基礎(chǔ)上，對大鼠的MIRI仍能起到一定的防護(hù)作用。

綜上所述，對于非糖尿病大鼠，右美托咪定可以有效改善MIRI引起的血流動力學(xué)改變，降低炎性因子水平，抑制炎性反應(yīng)，從而縮小心肌梗死面積，對大鼠的MIRI有明顯防護(hù)作用。而對于糖尿病大鼠，右美托咪定對MIRI引起的血流動力學(xué)改變、炎性因子水平均有明顯改善作用，且能縮小心肌梗死面積，故右美托咪定預(yù)處理對糖尿病大鼠MIRI亦有一定的防護(hù)作用。