• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定血管緊張素的氨基酸組成

    2018-07-26 15:55:20丁金國(guó)李曉倩黃臻輝
    上海醫(yī)藥 2018年11期
    關(guān)鍵詞:血管緊張素

    丁金國(guó) 李曉倩 黃臻輝

    摘 要 目的:建立一種測(cè)定血管緊張素氨基酸組成的柱前衍生高效液相色譜法。方法:血管緊張素經(jīng)酸水解產(chǎn)生的游離氨基酸,用AQC衍生后,以醋酸鈉溶液和乙腈作為流動(dòng)相,流速為1.0 ml/min,經(jīng)AccQ·Tag色譜柱梯度洗脫,于波長(zhǎng)254 nm處測(cè)定。通過外標(biāo)法計(jì)算樣品中氨基酸組成。結(jié)果:His、Arg、Pro、Tyr、Val、Phe在濃度范圍0.02~1.00 mmol/ml內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系,Asp在0.02~0.75 mmol/ml濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)建立的分析方法分離效果較好,可用于血管緊張素氨基酸組成測(cè)定和肽含量測(cè)定。

    關(guān)鍵詞 血管緊張素 氨基酸組成 肽含量 HPLC

    中圖分類號(hào):O657.72; TQ460.72 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1006-1533(2018)11-0098-05

    Determination of amino acid composition of angiotensin amide by HPLC with precolumn derivation

    DING Jinguo*, LI Xiaoqian, HUANG Zhenhui(SPH NO.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., Ltd., Shanghai 200240, China)

    ABSTRACT Objective: To establish an HPLC method with precolumn derivation to determine amino acid composition and peptide content of angiotensin amide. Methods: The free amino acids were derivatized with AQC after angiotensin amide was hydrolyzed by hydrochloric acid. The derivatives were eluted by gradient solutions composed of sodium acetate solution and acetonitrile on HPLC at flow rate of 1.0 ml/min and detective wavelength of 254 nm. The contents of amino acids in angiotensin amide were calculated based on external standard. Results: The standard curves were linear over the concentration range of 0.02~1.00 mmol/ml for His, Arg, Pro, Tyr, Val, and 0.02~0.75 mmol/ml for Asp. Conclusion: The method is suitable for the analysis of amino acid composition and peptide content of angiotensin amide.

    KEy WORDS angiotensin amide; amino acid composition; peptide content; HPLC

    氨基酸是多肽藥物最基本的組成單位,氨基酸組成分析可以測(cè)定多肽藥物的氨基酸組成,確定多肽的肽含量,初步確定多肽藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu),對(duì)評(píng)價(jià)多肽藥物質(zhì)量具有重要意義[1]。進(jìn)行多肽類藥物的氨基酸組成分析,需先將樣品水解成游離氨基酸,但大多數(shù)氨基酸不含有生色基團(tuán),無法用常規(guī)的紫外檢測(cè)器直接檢測(cè)。在此情況下,通??刹捎酶咝ш庪x子交換色譜-積分脈沖安培法直接分離、測(cè)定[2],或?qū)⒂坞x氨基酸轉(zhuǎn)化為具有較強(qiáng)紫外或熒光吸收的衍生物,使其有利于測(cè)定或分離。AQC(6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺碳酸鹽)能與一、二級(jí)氨基酸在柱前進(jìn)行衍生化,反應(yīng)迅速、產(chǎn)物穩(wěn)定,并可通過紫外檢測(cè)器檢測(cè)。

    血管緊張素能直接作用于動(dòng)脈血管平滑肌上的特異性受體,使小動(dòng)脈強(qiáng)力收縮,升壓活性高于去甲腎上腺素[3-6];它也是一種超短效的靜脈注射用血管收縮劑,起效快,作用消除也快??煽焖倬_地控制血壓,而治療劑量無快速耐受性,注射部位滲漏不會(huì)引起組織壞死,給藥期間無心悸、心律失常、尿量減少等不良反應(yīng)。因此,它在手術(shù)麻醉,特別是產(chǎn)科麻醉、高血壓患者麻醉、心臟手術(shù)、敗血性休克急救及血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑中毒治療中有重要作用[7-11]。我們對(duì)血管緊張素進(jìn)行了質(zhì)量研究,建立了基于多肽工作對(duì)照品的HPLC含量測(cè)定方法,但不能測(cè)定氨基酸組分[12]。氨基酸組成分析研究是評(píng)價(jià)多肽藥物結(jié)構(gòu)的重要手段,血管緊張素是由7種氨基酸組成的8肽藥物,鑒于其不含Cys(半胱氨酸)和Try(色氨酸),可采用酸水解法進(jìn)行水解,并以AQC為柱前衍生化試劑,應(yīng)用HPLC-UV法建立血管緊張素的氨基酸組成分析方法。氨基酸組成分析方法也可用于含量測(cè)定,無需多肽工作對(duì)照品,可豐富血管緊張素含量測(cè)定手段。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    血管緊張素(自制);混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(各氨基酸含量除Cys為1.25 mmol/ml外,余均為2.5 mmol/ml)、AccQ·Tag色譜流動(dòng)相A、B和衍生試劑盒(包括AQC衍生試劑粉末及稀釋劑、硼酸緩沖液)均購(gòu)自Waters科技有限公司。

    1.2 儀器

    Waters 2695高效液相色譜儀、自動(dòng)進(jìn)樣器、Waters 2489型UV/Vis檢測(cè)器和Empower 2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(Waters科技有限公司);XS-205 DU十萬分之一天平(梅特勒-托利多公司);TYXH-1旋渦混合器(上海比朗儀器有限公司);CS101-2E鼓風(fēng)干燥烘箱(重慶四達(dá)科學(xué)儀器有限公司);真空干燥箱(上海一恒科技有限公司)。

    1.3 方法

    1.3.1 色譜條件

    色譜柱:AccQ·Tag(3.9 mm×150 mm, 5 mm);檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm;柱溫34 ℃;進(jìn)樣量10 ml。流動(dòng)相A:140 mmol/L醋酸鈉水溶液(磷酸和三乙胺調(diào)節(jié)pH為5.0);流動(dòng)相B:乙腈。線性梯度洗(v/v)脫程序?yàn)椋? min,0% B;16 min,8% B;18 min,9% B;24 min,18% B;32 min,33% B;34 min,33% B;35 min,100% B;37 min,100% B;38 min,0% B;45 min,0% B。流速:1 ml/min。

    1.3.2 樣品水解

    精密稱取血管緊張素樣品15.0 mg,置試管中,加6 mol/L鹽酸溶液(含0.1%苯酚[2])6 ml,并在冰鹽浴中放置,反復(fù)充氮?dú)夂蟪檎婵諏⒃嚬苋鄯?,?10 ℃水解24 h后,取出放冷,加高純水定容至50 ml。精密量取1 ml水解液,真空干燥并清洗除去殘余的酸液后,用高純水溶解定容至10 ml。

    1.3.3 氨基酸衍生方法

    1)衍生劑溶液 將烘箱預(yù)熱至55 ℃。輕彈衍生試劑盒中2A瓶,確保所有的AQC衍生試劑粉末完全落在瓶底,移取2B瓶中衍生試劑稀釋劑1 ml加入2A瓶中,加蓋密封,振搖10 s,置烘箱中加熱,直至衍生試劑粉末完全溶解,備用。取清潔衍生管1根,加硼酸鹽緩沖液80 ml,再加上述制備的衍生劑溶液20 ml,渦旋混合10 s即得。

    2)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生 吸取100 ml混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,加0.9 ml高純水稀釋,混勻備用。取清潔衍生管,加入已稀釋的混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液10 ml,再加硼酸鹽緩沖液70 ml,渦旋混合,在渦旋狀態(tài)下加入衍生劑溶液20 ml,并保持渦旋混合10 s,在室溫放置1 min,將衍生管封口置55 ℃烘箱中10 min,取出備用。

    3)樣品水解溶液衍生 取清潔衍生管,加入樣品水解溶液20 ml、硼酸鹽緩沖液60 ml,渦旋混合,在渦旋狀態(tài)下加入衍生劑溶液20 ml,并保持渦旋混合10 s,在室溫放置1 min,將衍生管封口置55 ℃烘箱中10 min,取出備用。

    2 結(jié)果

    2.1 色譜條件優(yōu)化及適用性評(píng)價(jià)

    對(duì)混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液和空白進(jìn)行衍生處理后,分別進(jìn)樣,如圖1所示,從從左至右依次為衍生劑水解的AMQ峰、Asp、Ser、Glu、Gly、His、NH3、Arg、Thr、Ala、Pro、Cys、Tyr、Val、Met、Lys、Ile、Leu、Phe。依1.3.1項(xiàng)下色譜條件,各氨基酸峰的理論塔板數(shù)均不低于20 000,分離度均大于1.5。在該色譜系統(tǒng)條件中除流動(dòng)相配比的變化外,柱溫對(duì)各氨基酸色譜峰之間的分離度有很大的影響。在研究中發(fā)現(xiàn),柱溫37 ℃條件下,Cys和Tyr色譜峰完全重合。通過柱溫的改變發(fā)現(xiàn)柱溫較高時(shí),Gly/His的分離度有所增加,但Cys/Tyr間的分離度變差,甚至完全不能分離,溫度降低,Gly/His的分離度降低,但Cys/Tyr的分離度增加,通過不斷的摸索發(fā)現(xiàn)在34 ℃條件下,各氨基酸色譜峰的分離度均能達(dá)到要求(表1)。

    2.2 線性關(guān)系、重復(fù)性與樣品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

    配制濃度為0.02、0.25、0.50、0.75、1.00 mmol/ml的系列混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。對(duì)各濃度溶液進(jìn)行衍生化處理后,進(jìn)樣測(cè)定峰面積。以氨基酸濃度對(duì)峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(表2)。結(jié)果表明,除天冬氨酸(Asp)之外,其余6種氨基酸在0.02~1.00 mmol/ml濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系;天冬氨酸在濃度較高的時(shí)候線性關(guān)系較差,而在0.02~0.75 mmol/ml濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

    取供試品溶液,衍生,重復(fù)進(jìn)樣6針,測(cè)定峰面積,以Asp、His、Arg、Pro、Tyr、Val、Phe氨基酸的峰面積計(jì)算RSD,分別為1.09%、1.11%、1.17%、1.07%、1.10%、1.10%、1.07%。結(jié)果表明本法對(duì)同一樣品重復(fù)測(cè)定的精密度良好。將衍生后的同一混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別于0、3、6、9、12、15 h進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,計(jì)算得各氨基酸的RSD分別為1.09%、1.11%、1.17%、1.07%、1.10%、1.10%、1.07%。結(jié)果顯示衍生后的混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在15 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

    2.3 樣品水解條件優(yōu)化與氨基酸組成測(cè)定

    多肽水解的目的是破壞肽鍵,產(chǎn)生游離的氨基酸。在試驗(yàn)過程中考察16 h和24 h時(shí)各氨基酸的水解情況(表3)。結(jié)果表明,在16 h時(shí),His和Val水解程度較低,達(dá)不到理論值。因此仍采用24 h。分別取各批次血管緊張素樣品衍生溶液10 ml注入液相色譜儀,記錄色譜圖(圖2),按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算各氨基酸的摩爾數(shù)。血管緊張素以Asp、Arg、His、Pro和Phe的摩爾數(shù)之和除以5作為1,計(jì)算各氨基酸的相對(duì)比值(表4)。

    2.4 樣品肽含量測(cè)定

    根據(jù)上述氨基酸比值的數(shù)據(jù)以及美國(guó)藥典氨基酸組成分析方法中所述,其中Asp、Arg、Phe這三個(gè)氨基酸水解情況更好,以這三個(gè)氨基酸摩爾數(shù)之和的平均數(shù),計(jì)算肽含量。按美國(guó)藥典氨基酸組成分析方法[13]中的公式100 × m/ms(其中m為測(cè)得值,ms為稱量值),結(jié)果如表5所示。

    3 討論

    氨基酸組成分析中干擾性因素較多,在試驗(yàn)之前應(yīng)充分清洗鈍化液相色譜,盡量減少液相系統(tǒng)對(duì)測(cè)定的干擾。取下色譜柱,將各管路中的有機(jī)相用高純水進(jìn)行過渡沖洗,用30%磷酸清洗1 h左右,再換高純水沖洗至出水管路口pH為6~7。將清洗好的管路進(jìn)行鈍化,用6 mol/L硝酸溶液沖洗1 h左右,再換高純水沖洗至出水管路口pH為6~7,完成鈍化。除色譜儀器的準(zhǔn)備之外,試驗(yàn)中所用玻璃器具如樣品水解管、衍生管等,應(yīng)在試驗(yàn)前用1 mol/L鹽酸溶液煮1 h或在濃硝酸中浸泡后,用高純水沖洗數(shù)次,烘干放置于密閉器具中備用。試驗(yàn)過程應(yīng)盡量無塵,并戴無塵手套和口罩,防止雜蛋白的影響。

    氨基酸分析中常見的柱前衍生試劑主要有OPA(鄰苯二甲醛)、FMOC-Cl(氯甲酸芴甲酯)、FITC(異硫氰酸熒光素)、AQC(6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺碳酸鹽),其中OPA不能與仲氨酸反應(yīng);FMOC-Cl衍生產(chǎn)物干擾測(cè)定,需用戊烷將反應(yīng)過程中剩余的衍生試劑萃取出,以終止衍生反應(yīng)并避免衍生物的水解;FITC要求高溫和較長(zhǎng)時(shí)間的反應(yīng);因此選用AQC,其能與一、二級(jí)氨基酸進(jìn)行快速衍生化反應(yīng),且衍生產(chǎn)物穩(wěn)定,可通過UV檢測(cè),剩余試劑在衍生化反應(yīng)過程中水解,不干擾測(cè)定[1]。研究結(jié)果表明,采用AQC作衍生化試劑的柱前衍生化高效液相色譜法具有分離度良好、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),能較好地測(cè)定多肽藥物中氨基酸的相對(duì)比值,對(duì)多肽藥物的質(zhì)量控制和結(jié)構(gòu)確定都有一定的意義。

    在氨基酸組成測(cè)定結(jié)果已知時(shí),如已知多肽的分子量,可通過氨基酸分析的方法進(jìn)行肽含量標(biāo)定。通常在氨基酸水解過程中,Trp、Cys、Thr、Ser、Met容易完全或部分破壞,Ile、Val不容易完全裂解,而有些氨基酸如Gly、Ser容易被污染而使結(jié)果發(fā)生偏差。其中能較好、穩(wěn)定水解的氨基酸主要有Asp、Glu、Ala、Leu、Phe、Lys、Arg,可以用這些穩(wěn)定水解的氨基酸的摩爾數(shù)計(jì)算肽含量。在研究中發(fā)現(xiàn),通過液相法[12]測(cè)定血管緊張素的肽含量與氨基酸組成測(cè)定的結(jié)果稍有不同,其中通過氨基酸組成測(cè)定得到的肽含量相對(duì)較低,分析原因認(rèn)為,樣品在酸水解過程,以及清洗去除酸液和殘?jiān)倪^程中,發(fā)生了一定程度的損失,而混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液因本身由游離氨基酸組成,未經(jīng)過酸水解和后處理清洗過程,故使樣品測(cè)得的值較低。在之后的研究中,預(yù)采取將混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液經(jīng)過酸水解過程,來校正樣品的損失,或通過已知肽含量的標(biāo)準(zhǔn)肽,經(jīng)酸水解處理做回收率試驗(yàn),以校正樣品的損失。

    在多肽藥物質(zhì)量研究的過程中,液相法測(cè)定藥物含量需要對(duì)照品,有些藥物含量測(cè)定用對(duì)照品不能獲得,肽含量的確定存在困難。而氨基酸組成分析的方法,能很好地用于多肽藥物肽含量的測(cè)定,因此在多肽藥物的質(zhì)量控制中有十分重要的作用。

    致謝:感謝霍建麗、耿敏對(duì)本文的貢獻(xiàn)。

    參考文獻(xiàn)

    [1] Kaspar H, Dettmer K, Gronwald W, et al. Advances in amino acid analysis[J]. Anal Bioanal Chem, 2009, 393(2): 445-452.

    [2] Zhou YH, Xin N, Hu YZ. HPLC with precolumn derivatization determination of amino acid composition of oxytocin[J]. Chin J Pharm Anal, 2011, 31(8): 1541-1544.

    [3] Hidaka T, Tsuneyoshi I, Boyle WA, et al. Marked synergism between vasopressin and angiotensin II in a human isolated artery[J]. Crit Care Med, 2005, 33(11): 2613-2620.

    [4] Paiva TB, Paiva AC. Some pharmacological actions of synthetic analogues of angiotensin amide[J]. Br J Pharmacol Chemother, 1960, 15(4): 557-560.

    [5] Wray GM, Coakley JH. Severe septic shock unresponsive to noradrenaline[J]. Lancet, 1995, 346(8990): 1604.

    [6] Yunge M, Petros A. Angiotensin for septic shock unresponsive to noradrenaline[J]. Arch Dis Child, 2000, 82(5): 388-389.

    [7] McKinnon RP, Sinclair CJ. Angiotensinamide in the treatment of probable anaphylaxis to succinylated gelatin (Gelofusine)[J]. Anaesthesia, 1994, 49(4): 309-311.

    [8] Vincent RD Jr, Werhan CF, Norman PF, et al. Prophylactic angiotensin II infusion during spinal anesthesia for elective cesarean delivery[J]. Anesthesiology, 1998, 88(6): 1475-1479.

    [9] Eyraud D, Mouren S, Teugels K, et al. Treating anesthesiainduced hypotension by angiotensin II in patients chronically treated with angiotensin-converting enzyme inhibitors[J]. Anesth Analg, 1998, 86(2): 259-263.

    [10] Newby DE, Lee MR, Gray AJ, et al. Enalapril overdose and the corrective effect of intravenous angiotensin II[J]. Br J Clin Pharmacol, 1995, 40(1): 103-104.

    [11] Thaker U, Geary V, Chalmers P, et al. Low systemic vascular resistance during cardiac surgery: case reports, brief review, and management with angiotensin II[J]. J Cardiothorac Anesth, 1990, 4(3): 360-363.

    [12] 霍建麗, 耿敏, 丁金國(guó), 等. RP-HPLC法測(cè)定血管緊張素的肽含量及有關(guān)物質(zhì)[J]. 藥物生物技術(shù), 2012, 19(6): 521-524.

    [13] United States Pharmacopeial Convention. U. S. Pharmacopeia USP40 [M]. Rockville: United States Pharmacopeial Convention, Inc. 2017: 1093-1105.

    猜你喜歡
    血管緊張素
    白藜蘆醇對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞
    坎地沙坦聯(lián)合貝那普利治療心梗合并心力衰竭患者的療效探討
    腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)與妊娠高血壓病的關(guān)系
    替米沙坦對(duì)血管緊張素Ⅱ所致血管內(nèi)皮細(xì)胞游離鈣離子的抑制作用
    丹參注射液對(duì)39例急性腦梗死患者內(nèi)皮素和血管緊張素Ⅱ的影響
    血漿PRAAngⅡ在ALI/ARDS患者中的變化和意義
    亚洲精品美女久久av网站| 一级作爱视频免费观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 免费观看人在逋| 极品教师在线免费播放| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产一区二区三区视频了| av欧美777| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 在线观看免费日韩欧美大片| av福利片在线| 欧美一级a爱片免费观看看 | 久久国产精品影院| 久久狼人影院| 18禁美女被吸乳视频| 精品无人区乱码1区二区| 免费观看精品视频网站| 国产一区二区三区视频了| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久九九热精品免费| 国产精品 欧美亚洲| www日本在线高清视频| 亚洲精品在线观看二区| 俄罗斯特黄特色一大片| 久久久国产成人精品二区| 丝袜美足系列| 亚洲成人精品中文字幕电影| 精品免费久久久久久久清纯| 操美女的视频在线观看| 中文字幕精品免费在线观看视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲伊人色综图| av有码第一页| 性少妇av在线| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 日韩精品青青久久久久久| 久久亚洲精品不卡| 亚洲少妇的诱惑av| 国产精品野战在线观看| 看免费av毛片| 窝窝影院91人妻| 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美性长视频在线观看| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲精品国产区一区二| 91字幕亚洲| 久久人人精品亚洲av| 色在线成人网| 91av网站免费观看| 精品久久久久久成人av| 一区二区三区激情视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 久久久国产成人免费| 欧美一级a爱片免费观看看 | 亚洲中文字幕日韩| 久久人人精品亚洲av| 国产av精品麻豆| 欧美色欧美亚洲另类二区 | 啪啪无遮挡十八禁网站| 久久人妻av系列| 成人特级黄色片久久久久久久| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产成人影院久久av| 国产精品 欧美亚洲| 午夜激情av网站| 亚洲片人在线观看| 禁无遮挡网站| 久久久久精品国产欧美久久久| 一级毛片女人18水好多| 两个人看的免费小视频| 久久久国产成人免费| 久久人妻av系列| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产xxxxx性猛交| 99在线人妻在线中文字幕| 日日干狠狠操夜夜爽| 69av精品久久久久久| 日韩欧美三级三区| 中国美女看黄片| 成人三级做爰电影| 国内精品久久久久精免费| 国产精品99久久99久久久不卡| 久久婷婷成人综合色麻豆| 精品人妻1区二区| 日本五十路高清| 美女免费视频网站| 一区二区日韩欧美中文字幕| АⅤ资源中文在线天堂| 黄频高清免费视频| 波多野结衣一区麻豆| 老司机午夜福利在线观看视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 精品久久久久久久人妻蜜臀av | 亚洲 国产 在线| 国产精品久久久av美女十八| 国产成年人精品一区二区| 日韩av在线大香蕉| 少妇的丰满在线观看| 精品国产国语对白av| 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久精品成人免费网站| 黄色毛片三级朝国网站| 男人舔女人下体高潮全视频| 久久久久国内视频| 免费观看精品视频网站| 美女大奶头视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产片内射在线| 国产一区二区三区视频了| 国产三级黄色录像| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 久久九九热精品免费| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 在线免费观看的www视频| www.999成人在线观看| 国产精品av久久久久免费| 亚洲五月天丁香| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久精品91蜜桃| 亚洲av成人av| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 成年版毛片免费区| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲久久久国产精品| 无人区码免费观看不卡| 九色亚洲精品在线播放| 午夜福利,免费看| 中文字幕人妻熟女乱码| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲男人天堂网一区| 热99re8久久精品国产| 搞女人的毛片| 久久久水蜜桃国产精品网| 老司机午夜十八禁免费视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久精品影院6| x7x7x7水蜜桃| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 精品国产乱码久久久久久男人| √禁漫天堂资源中文www| 一区二区三区激情视频| 一夜夜www| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲精品国产区一区二| av视频在线观看入口| 天堂影院成人在线观看| 色在线成人网| 国产精华一区二区三区| 老司机深夜福利视频在线观看| av视频免费观看在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 成人精品一区二区免费| 宅男免费午夜| 国产单亲对白刺激| 悠悠久久av| 午夜亚洲福利在线播放| 99精品在免费线老司机午夜| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 老司机靠b影院| 国产精品精品国产色婷婷| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲精品在线美女| 大型av网站在线播放| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 男人舔女人的私密视频| 十八禁人妻一区二区| 国产精品野战在线观看| 久久天堂一区二区三区四区| 欧美黄色淫秽网站| 不卡一级毛片| 亚洲国产精品成人综合色| 中文字幕久久专区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 日韩有码中文字幕| 亚洲欧美激情在线| 99国产精品一区二区蜜桃av| 精品国产国语对白av| 国产精品久久久人人做人人爽| 可以在线观看的亚洲视频| 岛国在线观看网站| 一个人免费在线观看的高清视频| 久久人妻av系列| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 999久久久国产精品视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 亚洲免费av在线视频| 少妇 在线观看| 国产成人精品在线电影| 最近最新中文字幕大全电影3 | 午夜a级毛片| 香蕉国产在线看| 一级毛片精品| 午夜福利一区二区在线看| tocl精华| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产激情久久老熟女| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 色精品久久人妻99蜜桃| 91九色精品人成在线观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 9热在线视频观看99| 国产欧美日韩精品亚洲av| 狂野欧美激情性xxxx| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产伦人伦偷精品视频| 91精品国产国语对白视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲专区国产一区二区| 久久精品国产亚洲av高清一级| 脱女人内裤的视频| 黄片小视频在线播放| 桃色一区二区三区在线观看| 丝袜在线中文字幕| 又大又爽又粗| 亚洲国产精品合色在线| 国产精品精品国产色婷婷| 9色porny在线观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲人成伊人成综合网2020| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 99国产综合亚洲精品| 91大片在线观看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 精品国产一区二区三区四区第35| 一本久久中文字幕| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国内精品久久久久精免费| 亚洲最大成人中文| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 9热在线视频观看99| 亚洲 国产 在线| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 高清毛片免费观看视频网站| 久久久久久久久中文| 午夜福利欧美成人| 亚洲精品久久国产高清桃花| 免费一级毛片在线播放高清视频 | a在线观看视频网站| 精品第一国产精品| 18禁观看日本| 亚洲五月婷婷丁香| 麻豆一二三区av精品| 免费少妇av软件| 黄片大片在线免费观看| 国产精品国产高清国产av| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 成人国语在线视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲一区中文字幕在线| 久久久久久大精品| 国产成人av激情在线播放| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产国语露脸激情在线看| av免费在线观看网站| 黄色视频不卡| 九色国产91popny在线| 午夜免费成人在线视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 欧美一级a爱片免费观看看 | 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲一区二区三区不卡视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 久9热在线精品视频| 欧美激情久久久久久爽电影 | 亚洲一区二区三区不卡视频| 女性生殖器流出的白浆| 国产精品一区二区免费欧美| 国产不卡一卡二| 日本一区二区免费在线视频| 在线观看www视频免费| 18禁美女被吸乳视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| av在线播放免费不卡| 国产成人av教育| 久久香蕉精品热| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产精品久久视频播放| 欧美性长视频在线观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 一级毛片精品| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产片内射在线| 村上凉子中文字幕在线| 在线观看日韩欧美| 国产99白浆流出| 人成视频在线观看免费观看| 午夜福利影视在线免费观看| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲天堂国产精品一区在线| 精品一品国产午夜福利视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 久久久国产欧美日韩av| 很黄的视频免费| 亚洲欧美激情在线| 母亲3免费完整高清在线观看| 9191精品国产免费久久| av有码第一页| 精品国产乱子伦一区二区三区| 午夜a级毛片| aaaaa片日本免费| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 国产在线精品亚洲第一网站| 国产精品久久久人人做人人爽| 精品欧美一区二区三区在线| 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 黄色 视频免费看| 1024视频免费在线观看| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲七黄色美女视频| 级片在线观看| 99国产精品一区二区三区| 欧美精品亚洲一区二区| 香蕉国产在线看| 91大片在线观看| 久久精品国产综合久久久| 天天一区二区日本电影三级 | 视频在线观看一区二区三区| 成人国语在线视频| 最新美女视频免费是黄的| 9色porny在线观看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产99白浆流出| 久久人人精品亚洲av| 亚洲av美国av| 国产伦人伦偷精品视频| 在线观看日韩欧美| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲专区国产一区二区| 一区二区三区高清视频在线| 成人三级黄色视频| 日韩三级视频一区二区三区| 亚洲精华国产精华精| 99久久综合精品五月天人人| 91九色精品人成在线观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 欧美午夜高清在线| 精品免费久久久久久久清纯| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲精品av麻豆狂野| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 男人舔女人下体高潮全视频| 大陆偷拍与自拍| 欧美一级a爱片免费观看看 | 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 91麻豆av在线| 国产xxxxx性猛交| 国产97色在线日韩免费| 在线视频色国产色| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 亚洲精品中文字幕在线视频| 麻豆国产av国片精品| 日韩中文字幕欧美一区二区| 黄片大片在线免费观看| 色哟哟哟哟哟哟| 午夜免费激情av| 亚洲专区国产一区二区| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 十八禁人妻一区二区| 黄色成人免费大全| 在线观看午夜福利视频| 日本黄色视频三级网站网址| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 人人妻人人澡人人看| 12—13女人毛片做爰片一| 一区在线观看完整版| 一区二区三区激情视频| 一进一出好大好爽视频| 午夜免费观看网址| 亚洲成人久久性| 欧美av亚洲av综合av国产av| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 自线自在国产av| 99精品欧美一区二区三区四区| 老鸭窝网址在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国内精品久久久久精免费| 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲av美国av| 中文字幕人妻熟女乱码| 丁香六月欧美| 日韩精品青青久久久久久| 国产欧美日韩精品亚洲av| 午夜老司机福利片| 国产亚洲精品av在线| 99国产极品粉嫩在线观看| 日韩有码中文字幕| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲成国产人片在线观看| 亚洲美女黄片视频| 大码成人一级视频| 美女大奶头视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 精品久久久久久,| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 亚洲国产精品成人综合色| 午夜亚洲福利在线播放| www日本在线高清视频| 国产成人精品久久二区二区91| 免费无遮挡裸体视频| 久久人妻熟女aⅴ| 成年版毛片免费区| cao死你这个sao货| 一级黄色大片毛片| 嫁个100分男人电影在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 免费在线观看黄色视频的| 97碰自拍视频| 首页视频小说图片口味搜索| 村上凉子中文字幕在线| 国产成人啪精品午夜网站| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产在线精品亚洲第一网站| 露出奶头的视频| 亚洲一区二区三区不卡视频| av超薄肉色丝袜交足视频| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 后天国语完整版免费观看| www.自偷自拍.com| 成熟少妇高潮喷水视频| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲第一青青草原| 中文字幕av电影在线播放| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 成人国产综合亚洲| 给我免费播放毛片高清在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 精品无人区乱码1区二区| 丁香欧美五月| 伦理电影免费视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲午夜理论影院| 最近最新中文字幕大全免费视频| 午夜激情av网站| 久久久久九九精品影院| 欧美一区二区精品小视频在线| 很黄的视频免费| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| svipshipincom国产片| 亚洲,欧美精品.| 看免费av毛片| 俄罗斯特黄特色一大片| 老司机在亚洲福利影院| 欧美乱妇无乱码| 好男人电影高清在线观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 久99久视频精品免费| 久久久国产欧美日韩av| 级片在线观看| 午夜福利免费观看在线| 国产精品乱码一区二三区的特点 | ponron亚洲| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 一a级毛片在线观看| av天堂久久9| 国产亚洲欧美在线一区二区| 午夜福利影视在线免费观看| 99riav亚洲国产免费| 一进一出抽搐gif免费好疼| 女人被狂操c到高潮| 他把我摸到了高潮在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 可以在线观看的亚洲视频| 久久久国产欧美日韩av| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 久久久水蜜桃国产精品网| 精品久久久精品久久久| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产一区二区三区视频了| 两人在一起打扑克的视频| 午夜a级毛片| 免费观看精品视频网站| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲在线自拍视频| 久久久精品欧美日韩精品| 岛国在线观看网站| 成年人黄色毛片网站| 午夜影院日韩av| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 久久精品成人免费网站| 自线自在国产av| 亚洲国产中文字幕在线视频| АⅤ资源中文在线天堂| 女性被躁到高潮视频| 久久性视频一级片| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 国产一区二区激情短视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 在线观看免费日韩欧美大片| 日本五十路高清| 多毛熟女@视频| 亚洲中文av在线| 岛国在线观看网站| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 高潮久久久久久久久久久不卡| 久久人妻熟女aⅴ| 国产99白浆流出| 国产单亲对白刺激| 99热只有精品国产| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| www.www免费av| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产精品永久免费网站| 亚洲中文av在线| 国语自产精品视频在线第100页| 一区在线观看完整版| 啦啦啦免费观看视频1| 免费观看精品视频网站| 久久久久久久精品吃奶| 男人舔女人的私密视频| www.精华液| 久久久水蜜桃国产精品网| 亚洲一区中文字幕在线| 国产国语露脸激情在线看| 精品人妻在线不人妻| 黄色毛片三级朝国网站| 中亚洲国语对白在线视频| 好男人电影高清在线观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 午夜两性在线视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 少妇被粗大的猛进出69影院| 色综合婷婷激情| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲 国产 在线| 国产av一区在线观看免费| videosex国产| 亚洲欧美激情在线| 少妇的丰满在线观看| 深夜精品福利| 又黄又爽又免费观看的视频| 女警被强在线播放| 一区二区日韩欧美中文字幕| 男男h啪啪无遮挡| www.www免费av| 精品久久久久久,| 怎么达到女性高潮| 日日干狠狠操夜夜爽| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲av电影在线进入| 亚洲五月色婷婷综合| 日本vs欧美在线观看视频| 久久精品国产清高在天天线| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 久久午夜亚洲精品久久| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 国产精品国产高清国产av| 人人妻人人澡人人看| 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 欧美一级a爱片免费观看看 | 亚洲av第一区精品v没综合| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲精品国产一区二区精华液| av有码第一页| 午夜两性在线视频| 99久久综合精品五月天人人| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| av片东京热男人的天堂| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲一区中文字幕在线| 国产麻豆69| 日本精品一区二区三区蜜桃| 欧美日韩精品网址| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 久久精品国产清高在天天线| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 在线观看日韩欧美| 午夜免费观看网址| 欧美国产精品va在线观看不卡| 在线观看日韩欧美| 亚洲视频免费观看视频| 亚洲专区字幕在线| 国产熟女午夜一区二区三区| 在线永久观看黄色视频| 精品久久久精品久久久| 一级作爱视频免费观看| 亚洲视频免费观看视频| www日本在线高清视频| 精品无人区乱码1区二区| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲成a人片在线一区二区| 欧美日本中文国产一区发布| 少妇 在线观看|