不同強度超聲波對多孔鈦合金支架上成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

秦麗梅，吳琳，吳鎮(zhèn)先

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院修復(fù)一科，遼寧省口腔醫(yī)學(xué)研究所，沈陽 110002）

低強度脈沖超聲 （low-intensity pulsed ultrasound stimulation，LIPUS） 是一種以超聲波為形式的機械波，其強度范圍通常在5～100 mW/cm2之間，主要通過機械作用調(diào)節(jié)人體局部微環(huán)境從而促進成骨［1-2］。美國食品和藥品管理部門于1994年和2000年相繼批準(zhǔn)了在臨床上應(yīng)用LIPUS治療新鮮骨折和骨不連，2017年英國醫(yī)學(xué)期刊出版了LIPUS治療骨折愈合的最新臨床實用指南［3］。LIPUS與人工骨修復(fù)材料聯(lián)合應(yīng)用對骨缺損修復(fù)的作用近年來日益受到關(guān)注。醫(yī)用多孔鈦合金支架具有良好的生物相容性、骨傳導(dǎo)性和機械性能，已應(yīng)用于臨床多領(lǐng)域。微弧氧化（micro-arc oxidation，MAO） 技術(shù)能在金屬材料表面構(gòu)建具有多孔結(jié)構(gòu)的氧化膜層，該層富含鈣、磷等離子，可提高材料的抗腐蝕性和生物活性，有利于成骨，是鈦金屬表面處理的新技術(shù)［4-5］。因此，表面經(jīng)MAO處理的多孔鈦合金 （micro-arc oxidation treated titanium alloy，MT） 支架可能會是一種是非常適宜修復(fù)骨缺損的支架材料。LIPUS的生物學(xué)效應(yīng)與其作用的時間、強度、頻率等參數(shù)密切相關(guān)。因此，在研究LIPUS聯(lián)合多孔MT材料用于大面積骨缺損修復(fù)時明確最優(yōu)的超聲參數(shù)非常重要。本研究將多孔MT與MC3T3-E1成骨細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)，從細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化幾個方面評價不同強度LIPUS刺激對支架材料上成骨細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響，篩選出最適宜的LIPUS強度參數(shù)，為進一步研究LIPUS作用下高強韌多孔鈦人工骨材料的生物學(xué)作用及機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 多孔MT：由中國科學(xué)院金屬研究所制作提供，樣品為直徑10 mm、高度2 mm的圓柱體，孔徑400～500 μm，孔隙率65%～70%。依次用丙酮、75%乙醇、去離子水清洗樣品，并高溫高壓滅菌后備用。細(xì)胞接種前4 h將多孔MT材料放入培養(yǎng)液中抽真空4 h，吸除材料內(nèi)氣體并使材料達(dá)到預(yù)濕潤狀態(tài)。

1.1.2 細(xì)胞：小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞由中國醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院中心實驗室提供。

1.1.3 主要儀器與試劑：Sonicator 740型超聲波發(fā)生器 （美國Mettler Electronics公司），LSRFortessa 流式細(xì)胞儀 （美國BD公司） ，Hitachi S-3400N掃描電子顯微鏡 （scanning electron microscope，SEM） （日本HITACHI公司） ，超聲耦合劑 （美國Sonic Relief公司） ，ALP試劑盒 （南京建成有限公司） ，MTT和DMSO （美國Sigma公司） ，碘化丙啶染液和BCA總蛋白試劑盒（北京鼎國試劑公司） 。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組：將多孔MT支架材料隨機分為5組（0 MT、10 MT、30 MT、60 MT、100 MT組） ，分別加載不同的超聲強度。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%融合時，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，吹打細(xì)胞成單細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞懸液密度［用于SEM、MTT、細(xì)胞增殖指數(shù)（proliferation index，PI）、堿性磷 酸 酶（alkaline phosphate，ALP）檢測的細(xì)胞懸液密度分別為8×105/mL、8×105/mL、2×106/mL、2×106/mL］，將50 μL細(xì) 胞 懸 液 緩 慢 均勻地接種到支架材料上，靜置孵育2 h后，每孔加入1 mL培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置24 h使細(xì)胞貼壁穩(wěn)定。將細(xì)胞脫落較多的樣本丟棄，其余樣本隨機分為實驗組和對照組，每2 d換液1次，每組保證3個樣本。

1.2.3 超聲加載：超聲加載參數(shù)為頻率1 MHz，脈沖寬度1 ms，脈沖重復(fù)頻率100 Hz，20 min/次，1次/d，5組材料加載強度分別為0、10、30、60、100 mW/cm2。其中，強度0 mW/cm2組為不開功率源的假輻照。超聲波輻照時，在超聲探頭和孔板間使用超聲耦合劑，避免二者間產(chǎn)生氣泡引起超聲波的反射和衰減。

1.2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：各組細(xì)胞培養(yǎng)4 d后，清洗試件，2.5%戊二醛4 ℃固定 24 h，然后將各試件乙醇梯度逐級脫水，干燥，表面噴金后用SEM觀察材料表面細(xì)胞的附著情況。

1.2.5 MTT檢測：各組細(xì)胞培養(yǎng)1、4、7 d后，吸棄培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，每孔加入200 μL MTT液及800 μL無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱孵育4 h，吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入1 mL DMSO，于震蕩器上震蕩10 min后移入96孔板中，每孔200 μL，在490 nm波長下測其OD值。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測：各組細(xì)胞培養(yǎng)5 d后取出，吸棄培養(yǎng)基，PBS沖洗2次，消化細(xì)胞并離心收集細(xì)胞沉淀，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞沉淀2次，然后以預(yù)冷的70%乙醇溶液輕吹混勻沉淀細(xì)胞，4 ℃固定過夜。次日再次離心固定的細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞1次，重懸細(xì)胞后再次離心，去除上清。每管細(xì)胞中加入400 μL碘化丙啶染液，于37 ℃下避光靜置染色30 min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 （波長488 nm） ，計算細(xì)胞PI。

1.2.7 ALP檢測：各組細(xì)胞培養(yǎng)1、4、7 d后，棄除原培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，胰酶消化，離心，再次加入PBS吹打材料上剩余細(xì)胞，收集并離心，棄除上清液，采用化學(xué)、物理雙重裂解法裂解細(xì)胞，低溫高速離心5 min，取上清液備用，按照總蛋白試劑盒和ALP定量檢測試劑盒說明書分別對樣品進行檢測，按公式計算細(xì)胞內(nèi)ALP含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SEM觀察結(jié)果

細(xì)胞接種4 d后，在各組多孔MT材料表面均伸展良好，細(xì)胞間靠偽足相互連接，并可見細(xì)胞長入材料孔徑內(nèi)部 （圖1） 。

2.2 MTT

各組細(xì)胞MTT值均隨著培養(yǎng)時間的延長而增加。在培養(yǎng)1、3、7 d時，100 MT組的MTT值低于其他4組，有統(tǒng)計學(xué)差異 （P ＜ 0.05） ，而其他4組間無統(tǒng)計學(xué)差異 （圖2） 。

2.3 PI值

圖1 SEM觀察培養(yǎng)4 d后材料表面成骨細(xì)胞的形態(tài)Fig.1 SEM images of osteoblasts at 4 days post seeding on scaffold materials

圖2 不同超聲強度刺激下各組MTT值Fig.2 The MTT content in each group with stimulation at different ultrasound intensities

在共培養(yǎng)、超聲加載5 d后，100 MT的PI值低于其他4組，有統(tǒng)計學(xué)差異 （P ＜ 0.05） ，而其他4組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。進一步表明100 mW/cm2的LIPUS超聲強度更加不利于MC3T3成骨細(xì)胞的增殖，而不同的超聲強度參數(shù)并未對其他4組成骨細(xì)胞的增殖造成顯著的影響 （圖3） 。

2.3 ALP值

圖3 培養(yǎng)5 d時各組材料表面細(xì)胞的增殖指數(shù)Fig.3 The cell proliferation index in the different groups at 5 days post seeding on scaffold materials

各組細(xì)胞的ALP值隨著培養(yǎng)時間的延長都有一個先增高再降低的趨勢，在同一時間點上，30 MT組的ALP值高于其他4組，有統(tǒng)計學(xué)差異 （P ＜ 0.05） 。表明當(dāng)LIPUS的超聲強度為30 mW/cm2時，更有利于促進MC3T3細(xì)胞的成骨向分化 （圖4） 。

3 討論

圖4 不同超聲強度刺激下每組ALP活性結(jié)果Fig.4 ALP content in each group with stimulation at different ultrasound intensities

LIPUS對骨折和骨不連愈合的促進作用已經(jīng)被逐漸認(rèn)可，它能通過作用于不同的生物成分促進骨再生的整個過程，目前已被廣泛應(yīng)用于輔助促進大面積骨缺損愈合［6］。LIPUS發(fā)射的脈沖式超聲波能克服一般超聲波的致熱不良反應(yīng)，產(chǎn)生的直接和間接的機械作用力可通過聲流、聲波的輻射、液體流動等引起微循環(huán)改變，利于細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的交換，制造更有利于細(xì)胞生長的生物學(xué)微環(huán)境，從而引發(fā)細(xì)胞的一系列生物行為變化。近年來，將LIPUS與多孔三維支架材料聯(lián)合應(yīng)用于體外細(xì)胞培養(yǎng)的研究受到越來越多的關(guān)注。WU等［7］將碳化硅支架材料與成骨細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)LIPUS能夠增加細(xì)胞在支架材料內(nèi)部的長入深度，促進細(xì)胞增殖。

LIPUS作用的結(jié)果受到超聲波的強度、頻率、輻照時間等參數(shù)設(shè)置、加載裝置、細(xì)胞類型、組織類型等多重因素的影響［8-13］。ZHOU等［10］通過動物實驗發(fā)現(xiàn)40 mW/cm2的超聲能明顯促進新骨形成，提高骨質(zhì)疏松小鼠的骨結(jié)合能力。XU等［11］研究發(fā)現(xiàn)，60 mW/cm2的超聲強度對造血干細(xì)胞增殖的作用最為顯著。安恒遠(yuǎn)等［12］的研究表明不同強度的LIPUS均可促進兔軟骨細(xì)胞增殖，其中以40 mW/cm2的促進作用最顯著。而AKAGI等［13］的研究認(rèn)為LIPUS對細(xì)胞的增殖無影響，但能促進分化，且輻照時間和頻率的差異會影響分化結(jié)果。在LIPUS對小鼠前成骨細(xì)胞生物行為影響的研究［14-15］中，常用的超聲參數(shù)為強度30 mW/cm2，時間20 min，頻率1～1.5 MHz，但這一參數(shù)也沒有受到國內(nèi)外學(xué)者的一致認(rèn)可。KATIYAR等［16］通過體外研究得出結(jié)論，不同大小的超聲強度會不同程度地影響MC3T3-E1細(xì)胞的增殖，而不同頻率和輻照時間對細(xì)胞增殖的影響無統(tǒng)計學(xué)差異。ANGLE等［8］發(fā)現(xiàn)低于30 mW/cm2的強度對成骨細(xì)胞依然有效，并且在各個強度組中2 mW/cm2組的礦化效果最好。綜上所述，LIPUS的作用效果受到多種因素的影響，為了今后能更好地研究LIPUS聯(lián)合多孔鈦合金支架材料對修復(fù)大面積骨缺損中各種生物學(xué)行為的影響，明確最佳的超聲參數(shù)是非常必要的。

本研究通過SEM觀察各組材料表面成骨細(xì)胞的黏附狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)各組材料上細(xì)胞均伸展良好，并長入至材料孔徑內(nèi)部，表明LIPUS不會影響成骨細(xì)胞在多孔MT上的黏附。本研究中LIPUS強度為100 mW/cm2組的MTT值低于其他組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.05） ，而其他組之間無統(tǒng)計學(xué)差異，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果進一步驗證了MTT的檢測結(jié)果。提示當(dāng)超聲強度達(dá)到100 mW/cm2時，會在一定程度上抑制MC3T3細(xì)胞的增殖。值得注意的是，與假輻照的0 MT組相比，10 MT、30 MT和60 MT這3個組的細(xì)胞在增殖方面的檢測結(jié)果均不具有統(tǒng)計學(xué)差異，表明在本實驗條件下，LIPUS對MC3T3細(xì)胞增殖沒有促進作用。關(guān)于LIPUS對細(xì)胞增殖的影響，目前國內(nèi)外研究尚無統(tǒng)一定論，大部分研究［9，15］認(rèn)為它能促進細(xì)胞增殖，然而部分研究［17］認(rèn)為它對細(xì)胞增殖無明顯影響，甚至還有研究［18］顯示LIPUS能夠抑制細(xì)胞的增殖。LIPUS對細(xì)胞增殖產(chǎn)生不同結(jié)果的具體機制尚不清楚，可能與細(xì)胞、材料或者超聲參數(shù)有關(guān)，還有待于進一步研究。

ALP是成骨細(xì)胞分泌的一種蛋白酶，是成骨細(xì)胞早期分化的特異性標(biāo)志之一。本實驗對各組材料上細(xì)胞的ALP含量進行了定量檢測，結(jié)果顯示，在檢測的各個時間點上30 MT組的ALP值均高于其他組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.05） 。表明強度為30 mW/cm2的LIPUS能顯著促進MC3T3細(xì)胞的成骨向分化，與之前國內(nèi)外的大量研究［13-15］結(jié)果一致。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，30 mW/cm2的強度是促進MC3T3細(xì)胞成骨向分化的最優(yōu)超聲強度參數(shù)。本研究組將采用此超聲強度參數(shù)進行后續(xù)的深入研究。