鍶對(duì)脂肪干細(xì)胞成骨分化中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及Notch1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

趙崇如，郭澍，呂夢(mèng)竹，陳欣，王婷，朱夢(mèng)茹

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院整形外科，沈陽(yáng) 110001）

創(chuàng)傷、感染等原因?qū)е碌牟荒茏杂墓侨睋p是臨床醫(yī)生面臨的一大難題。組織工程技術(shù)的發(fā)展為修復(fù)骨缺損提供了有效的解決策略［1］。然而，組織工程骨移植后的血管生成緩慢，很難達(dá)到大塊移植物的高度血管化，誘導(dǎo)骨缺損修復(fù)過(guò)程的血管生成仍然是臨床上所面臨的一大挑戰(zhàn)。

鍶 （strontium，Sr） 是人體內(nèi)重要的微量元素之一［2］，不僅可以促進(jìn)干細(xì)胞成骨，還可以刺激血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)成骨過(guò)程中的血管生成［3］，為實(shí)現(xiàn)骨組織工程血管化提供新方法。Notch信號(hào)通路在血管生成過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。研究［4］發(fā)現(xiàn)，不同于其在其他器官及腫瘤細(xì)胞血管生成過(guò)程中的負(fù)向調(diào)節(jié)作用，Notch信號(hào)通路可以促進(jìn)長(zhǎng)骨內(nèi)皮細(xì)胞增殖以及血管生成。

目前對(duì)于Sr促組織工程骨血管化的研究，主要集中于證明Sr可上調(diào)種子細(xì)胞釋放血管生成因子進(jìn)而促進(jìn)血管生成，而缺乏這一過(guò)程相關(guān)機(jī)制的研究。本研究應(yīng)用Sr對(duì)健康女性的脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs） 進(jìn)行干預(yù)，運(yùn)用DAPT阻斷Notch1信號(hào)通路，探究在Sr上調(diào)成骨分化ADSCs表達(dá)VEGF的過(guò)程中是否有Notch1信號(hào)通路參與，為構(gòu)建血管化組織工程骨奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

皮下脂肪組織來(lái)源于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院整形外科行吸脂術(shù)的28歲健康女性患者 （無(wú)內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)疾病病史、無(wú)家族遺傳病及其他傳染病病史，手術(shù)近期未服用激素類(lèi)藥物）。本研究已獲得患者知情同意及中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的許可。Ⅰ型膠原酶、胎牛血清、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基 （美國(guó)Gibco公司）；DMEM/F12 （1∶1） 、青-鏈霉素、PBS （美國(guó)Hyclone公司）；成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基 （中國(guó)廣州賽業(yè)生物技術(shù)有限公司）；氯化鍶 （中國(guó)上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；DAPT （美國(guó)Selleck公司）；BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒 （中國(guó)碧云天生物技術(shù)公司）；抗VEGF抗體、抗NICD抗體 （美國(guó) Abcam公司） 。

1.2 方法

1.2.1 ADSCs的體外提取及培養(yǎng)：采用I型膠原酶對(duì)脂肪組織進(jìn)行消化［5］，簡(jiǎn)要步驟為取雙側(cè)大腿皮下吸出的約150 mL脂肪組織以無(wú)菌NaCl溶液反復(fù)洗滌，同時(shí)清除大部分血細(xì)胞，可見(jiàn)血管及大塊纖維組織，剪碎清洗后的脂肪組織形成1 mm3組織塊，加入終濃度為0.1%Ⅰ型膠原酶，并在37 ℃水浴條件下震蕩消化45 min。等量加入已配好的含10%FBS的DMEM/F12中和停止消化，1 200 r/min、25 ℃下離心5 min。棄去油脂、脂肪組織及上清，加入含10%FBS的DMEM/F12重懸細(xì)胞后，1 200 r/min、25℃離心5 min棄上清，反復(fù)2遍以洗去殘留的紅細(xì)胞及油脂。加入含15%FBS和1%青-鏈霉素的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于75 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。置于37 ℃，5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，72 h后更換基礎(chǔ)培養(yǎng)基去除未貼壁血細(xì)胞，每3 d換1次液，至ADSCs融合約80%時(shí)用含EDTA胰酶消化傳代，至P3備用。

1.2.2 ADSCs成脂向分化誘導(dǎo)及鑒定：取細(xì)胞融合度達(dá)80%的第3代ADSCs，以2×104/cm2的細(xì)胞密度接種于6孔板中，改用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每3 d換1次液，誘導(dǎo)14 d進(jìn)行油紅O染色；PBS沖洗后加入多聚甲醛固定15 min，再用PBS沖洗1次，加入2%油紅O染液，室溫下染色30 min，PBS沖洗1次，倒置相差顯微鏡下觀(guān)察染色情況。

1.2.3 ADSCs成骨向分化誘導(dǎo)及鑒定：取細(xì)胞融合度達(dá)80%的第3代ADSCs，以2×104/cm2的細(xì)胞密度接種于6孔板中，改用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每3 d換1次液，誘導(dǎo)20 d后進(jìn)行茜素紅染色；PBS沖洗后加入多聚甲醛固定15 min，再用PBS沖洗1次，加入1%茜素紅染液，室溫下染色5 min，PBS沖洗1次，倒置相差顯微鏡下觀(guān)察鈣化結(jié)節(jié)行成情況。

1.2.4 分組處理：研究［6］表明，ADSCs在Sr濃度為100 μmol/L的條件下誘導(dǎo)6 d時(shí)的成骨效應(yīng)最顯著。DAPT在終濃度為10 μmol/L，持續(xù)誘導(dǎo)條件下抑制Notch1信號(hào)通路作用較強(qiáng)［7］。本研究實(shí)驗(yàn)組分別給予氯化鍶 （終濃度為100 μmol/L） 、DAPT （終濃度為10 μmol/L） ，同時(shí)設(shè)空白立對(duì)照組。具體分組如下：（1） 空白對(duì)照組，成骨誘導(dǎo)液；（2） Sr組，成骨誘導(dǎo)液+100 μmol/L氯化鍶；（3） Sr+DAPT組，成骨誘導(dǎo)液+100μmol/L氯化鍶+10 μmol/L DAPT；（4） DAPT組，成骨誘導(dǎo)液+10 μmol/L DAPT。

1.2.5 Western blotting 檢測(cè) Notch1信號(hào)通路因子（Notch 1 intracellular domain，NICD） 及VEGF蛋白表達(dá)水平：P3代的ADSCs在含10%FBS的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)融合至80%左右時(shí)，將培養(yǎng)基更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)。培養(yǎng)6 d后，上述各組細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液，采用BCA試劑盒法進(jìn)行蛋白定量，100 ℃金屬浴10 min使蛋白變性，取各組蛋白樣品各20 μg等質(zhì)量上樣，10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h后，抗NICD抗體 （1∶500稀釋?zhuān)?，抗VEGF抗體 （1∶1 000稀釋?zhuān)?，β-actin （1∶1 000稀釋?zhuān)?室溫?fù)u床孵育90 min，4 ℃過(guò)夜。加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記抗體 （1∶20 000稀釋?zhuān)梗?，室溫?fù)u床孵育1 h。將PVDF膜均勻浸入ECL發(fā)光液中，置入凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

Western blotting條帶結(jié)果用Image-J圖像分析軟件進(jìn)行灰度掃描后，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行半定量分析。各組結(jié)果數(shù)據(jù)均以表示。采用GraphPad Prism 5.0及SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)組間差異進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs形態(tài)學(xué)觀(guān)察

原代ADSCs分離提取接種后24 h，于倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)大多數(shù)ADSCs已貼壁，形態(tài)呈圓形。48 h觀(guān)察可見(jiàn)ADSCs基本貼壁，形態(tài)逐漸變成短梭形或多角形，72 h觀(guān)察可見(jiàn)ADSCs分裂增殖呈長(zhǎng)梭形并成簇生長(zhǎng)，7 d時(shí)觀(guān)察可見(jiàn)ADSCs長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底部，呈集落樣生長(zhǎng)，方向性明顯 （圖1A） 。待細(xì)胞融合至80%～90%，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代后的ADSCs分裂增殖速度加快，可在5 d時(shí)融合至80%，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞形態(tài)均一，呈明顯方向性 （圖1B） 。

2.2 ADSCs鑒定

圖1 ADSCs形態(tài)學(xué)觀(guān)察Fig.1 Morphological observation of ADSCs

ADSCs成脂化誘導(dǎo)后，細(xì)胞體積逐漸變大，胞體逐漸變圓，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)明顯的脂滴并逐漸增多，14 d油紅O染色倒置相差顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果顯示，所培養(yǎng)細(xì)胞胞漿內(nèi)脂滴被染成紅色 （圖2A） ，證明ADSCs具有成脂向分化潛能。ADSCs成骨化誘導(dǎo)后，細(xì)胞體積逐漸增大，胞體由長(zhǎng)梭形變成橢圓形和多角形，細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)鈣結(jié)晶，20 d茜素紅染色倒置顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果顯示，細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)鈣結(jié)節(jié)被染成紅色 （圖2B） ，證明ADSCs具有成骨向分化潛能。

2.3 Western blotting 檢測(cè) NICD及VEGF蛋白表達(dá)結(jié)果

與空白對(duì)照組的NICD （0.671 5±0.050 5）和VEGF（0.688 9±0.039 4） 相比，Sr組的NICD （1.187 7±0.089 2）和VEGF （1.320 0±0.075 5） 蛋白表達(dá)水平顯著提高 （P ＜0.01，P ＜ 0.001） ，DAPT組的NICD （0.348 3±0.026 2） 和VEGF （0.465 6±0.026 6） 蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.01） ；與Sr組相比，Sr＋DAPT組的NICD （0.386 7±0.029 1） 和VEGF （1.057 5±0.060 5） 蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.001，P ＜0.01） ，見(jiàn)圖3。

圖2 ADSCs鑒定Fig.2 Identification of ADSCs

圖3 Western blotting檢測(cè) NICD及VEGF蛋白表達(dá)水平Fig.3 Detection of protein expressions by Western blotting analysis of NICD and VEGF in osteogenically induced ADSCs

3 討論

近數(shù)十年，作為間充質(zhì)干細(xì)胞的豐富來(lái)源，ADSCs已成為再生組織工程技術(shù)的研究熱點(diǎn)。與其他種類(lèi)的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，ADSCs因其來(lái)源廣，取材易，增殖能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)具有潛在的優(yōu)勢(shì)［8］。目前存在多種提高ADSCs多向分化潛能的方法，其中Sr已被證實(shí)具有促進(jìn)ADSCs增殖和增強(qiáng)其成骨分化能力的作用。此外，Sr還可以通過(guò)上調(diào)VEGF的表達(dá)促進(jìn)成骨過(guò)程的血管生成［3］。在本研究中，相對(duì)于空白對(duì)照組而言，Sr組VEGF表達(dá)上調(diào)，再次證實(shí)了Sr上調(diào)ADSCs成骨分化過(guò)程中VEGF表達(dá)的作用。

VEGF是調(diào)控血管發(fā)生及形成的最重要的生長(zhǎng)因子之一，參與血管新生及內(nèi)皮細(xì)胞增殖過(guò)程，其在骨的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也起著重要的作用［9］。有研究［10］表明，成骨細(xì)胞分化過(guò)程中釋放的VEGF可促進(jìn)血管生成。KIM等［11］發(fā)現(xiàn)在褐藻糖膠成骨分化誘導(dǎo)下，間充質(zhì)干細(xì)胞的VEGF分泌增加，作用于內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生成血管作用并可加快骨缺損修復(fù)。因此，調(diào)節(jié)骨組織中的VEGF水平為修復(fù)骨愈合不良和促進(jìn)骨再生提供了潛在的治療策略。目前，大多數(shù)研究的內(nèi)容主要是關(guān)于VEGF局部表達(dá)水平變化對(duì)于骨缺損修復(fù)結(jié)果的影響，對(duì)于其作用機(jī)制的詳細(xì)研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)在Sr上調(diào)成骨誘導(dǎo)的ADSCs表達(dá)VEGF的過(guò)程中，NICD表達(dá)明顯提升。由此推測(cè)，Notch1信號(hào)通路參與了Sr促成骨誘導(dǎo)ADSCs表達(dá)VEGF這一過(guò)程。

Notch信號(hào)通路在調(diào)節(jié)胚胎及成體器官細(xì)胞增殖分化及決定細(xì)胞命運(yùn)過(guò)程中起到了重要作用［12］。RAMASAMY等［4］的研究證實(shí)，Notch信號(hào)通路可正向調(diào)控骨組織內(nèi)的血管生成，這一作用與DLL4/Notch信通路所介導(dǎo)的抑制其他器官內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用明顯相反。本研究為證實(shí)Notch1信號(hào)通路參與了Sr上調(diào)成骨誘導(dǎo)ADSCs表達(dá)VEGF這一推測(cè)，采用DAPT干預(yù)成骨誘導(dǎo)的ADSCs，發(fā)現(xiàn)NICD顯著下降，證明DAPT發(fā)揮了其阻斷Notch1信通路的作用。同時(shí)，與對(duì)照組相比DAPT干預(yù)組的VEGF表達(dá)量顯著降低，與LIAO等［13］的研究結(jié)論相一致，提示干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中VEGF的表達(dá)受Notch1信號(hào)通路調(diào)控。采用氯化鍶干預(yù)后，VEGF表達(dá)顯著上調(diào)的同時(shí)NICD表達(dá)顯著增加；為排除其他信號(hào)通路的干擾作用，采用氯化鍶和DAPT共同干預(yù)成骨誘導(dǎo)的ADSCs，發(fā)現(xiàn)VEGF及NICD表達(dá)較Sr組均顯著下降，進(jìn)一步證實(shí)Notch1信號(hào)通路作用有效。以上結(jié)果說(shuō)明ADSCs成骨過(guò)程中VEGF表達(dá)受Notch1信號(hào)通路調(diào)控，Sr可通過(guò)調(diào)控Notch1信號(hào)通路的傳導(dǎo)作用，上調(diào)成骨分化的ADSCs表達(dá)VEGF。

綜上所述，本研究證實(shí)了Sr能上調(diào)ADSCs成骨過(guò)程中表達(dá)VEGF。在Sr促ADSCs成骨分化過(guò)程中，Notch1信號(hào)通路被激活，并對(duì)VEGF的表達(dá)起正向調(diào)控作用。為Sr促ADSCs修復(fù)骨缺損過(guò)程中血管形成機(jī)制的進(jìn)一步研究鑒定了基礎(chǔ)。