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    鍶對(duì)脂肪干細(xì)胞成骨分化中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及Notch1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    2018-07-26 02:05:34趙崇如郭澍呂夢(mèng)竹陳欣王婷朱夢(mèng)茹
    關(guān)鍵詞:成骨分化培養(yǎng)基

    趙崇如,郭澍,呂夢(mèng)竹,陳欣,王婷,朱夢(mèng)茹

    (中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院整形外科,沈陽(yáng) 110001)

    創(chuàng)傷、感染等原因?qū)е碌牟荒茏杂墓侨睋p是臨床醫(yī)生面臨的一大難題。組織工程技術(shù)的發(fā)展為修復(fù)骨缺損提供了有效的解決策略[1]。然而,組織工程骨移植后的血管生成緩慢,很難達(dá)到大塊移植物的高度血管化,誘導(dǎo)骨缺損修復(fù)過(guò)程的血管生成仍然是臨床上所面臨的一大挑戰(zhàn)。

    鍶 (strontium,Sr) 是人體內(nèi)重要的微量元素之一[2],不僅可以促進(jìn)干細(xì)胞成骨,還可以刺激血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)成骨過(guò)程中的血管生成[3],為實(shí)現(xiàn)骨組織工程血管化提供新方法。Notch信號(hào)通路在血管生成過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。研究[4]發(fā)現(xiàn),不同于其在其他器官及腫瘤細(xì)胞血管生成過(guò)程中的負(fù)向調(diào)節(jié)作用,Notch信號(hào)通路可以促進(jìn)長(zhǎng)骨內(nèi)皮細(xì)胞增殖以及血管生成。

    目前對(duì)于Sr促組織工程骨血管化的研究,主要集中于證明Sr可上調(diào)種子細(xì)胞釋放血管生成因子進(jìn)而促進(jìn)血管生成,而缺乏這一過(guò)程相關(guān)機(jī)制的研究。本研究應(yīng)用Sr對(duì)健康女性的脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSCs) 進(jìn)行干預(yù),運(yùn)用DAPT阻斷Notch1信號(hào)通路,探究在Sr上調(diào)成骨分化ADSCs表達(dá)VEGF的過(guò)程中是否有Notch1信號(hào)通路參與,為構(gòu)建血管化組織工程骨奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    皮下脂肪組織來(lái)源于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院整形外科行吸脂術(shù)的28歲健康女性患者 (無(wú)內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)疾病病史、無(wú)家族遺傳病及其他傳染病病史,手術(shù)近期未服用激素類(lèi)藥物)。本研究已獲得患者知情同意及中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的許可。Ⅰ型膠原酶、胎牛血清、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (美國(guó)Gibco公司);DMEM/F12 (1∶1) 、青-鏈霉素、PBS (美國(guó)Hyclone公司);成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (中國(guó)廣州賽業(yè)生物技術(shù)有限公司);氯化鍶 (中國(guó)上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);DAPT (美國(guó)Selleck公司);BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒 (中國(guó)碧云天生物技術(shù)公司);抗VEGF抗體、抗NICD抗體 (美國(guó) Abcam公司) 。

    1.2 方法

    1.2.1 ADSCs的體外提取及培養(yǎng):采用I型膠原酶對(duì)脂肪組織進(jìn)行消化[5],簡(jiǎn)要步驟為取雙側(cè)大腿皮下吸出的約150 mL脂肪組織以無(wú)菌NaCl溶液反復(fù)洗滌,同時(shí)清除大部分血細(xì)胞,可見(jiàn)血管及大塊纖維組織,剪碎清洗后的脂肪組織形成1 mm3組織塊,加入終濃度為0.1%Ⅰ型膠原酶,并在37 ℃水浴條件下震蕩消化45 min。等量加入已配好的含10%FBS的DMEM/F12中和停止消化,1 200 r/min、25 ℃下離心5 min。棄去油脂、脂肪組織及上清,加入含10%FBS的DMEM/F12重懸細(xì)胞后,1 200 r/min、25℃離心5 min棄上清,反復(fù)2遍以洗去殘留的紅細(xì)胞及油脂。加入含15%FBS和1%青-鏈霉素的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,接種于75 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。置于37 ℃,5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng),72 h后更換基礎(chǔ)培養(yǎng)基去除未貼壁血細(xì)胞,每3 d換1次液,至ADSCs融合約80%時(shí)用含EDTA胰酶消化傳代,至P3備用。

    1.2.2 ADSCs成脂向分化誘導(dǎo)及鑒定:取細(xì)胞融合度達(dá)80%的第3代ADSCs,以2×104/cm2的細(xì)胞密度接種于6孔板中,改用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),每3 d換1次液,誘導(dǎo)14 d進(jìn)行油紅O染色;PBS沖洗后加入多聚甲醛固定15 min,再用PBS沖洗1次,加入2%油紅O染液,室溫下染色30 min,PBS沖洗1次,倒置相差顯微鏡下觀(guān)察染色情況。

    1.2.3 ADSCs成骨向分化誘導(dǎo)及鑒定:取細(xì)胞融合度達(dá)80%的第3代ADSCs,以2×104/cm2的細(xì)胞密度接種于6孔板中,改用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),每3 d換1次液,誘導(dǎo)20 d后進(jìn)行茜素紅染色;PBS沖洗后加入多聚甲醛固定15 min,再用PBS沖洗1次,加入1%茜素紅染液,室溫下染色5 min,PBS沖洗1次,倒置相差顯微鏡下觀(guān)察鈣化結(jié)節(jié)行成情況。

    1.2.4 分組處理:研究[6]表明,ADSCs在Sr濃度為100 μmol/L的條件下誘導(dǎo)6 d時(shí)的成骨效應(yīng)最顯著。DAPT在終濃度為10 μmol/L,持續(xù)誘導(dǎo)條件下抑制Notch1信號(hào)通路作用較強(qiáng)[7]。本研究實(shí)驗(yàn)組分別給予氯化鍶 (終濃度為100 μmol/L) 、DAPT (終濃度為10 μmol/L) ,同時(shí)設(shè)空白立對(duì)照組。具體分組如下:(1) 空白對(duì)照組,成骨誘導(dǎo)液;(2) Sr組,成骨誘導(dǎo)液+100 μmol/L氯化鍶;(3) Sr+DAPT組,成骨誘導(dǎo)液+100μmol/L氯化鍶+10 μmol/L DAPT;(4) DAPT組,成骨誘導(dǎo)液+10 μmol/L DAPT。

    1.2.5 Western blotting 檢測(cè) Notch1信號(hào)通路因子(Notch 1 intracellular domain,NICD) 及VEGF蛋白表達(dá)水平:P3代的ADSCs在含10%FBS的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)融合至80%左右時(shí),將培養(yǎng)基更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)。培養(yǎng)6 d后,上述各組細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液,采用BCA試劑盒法進(jìn)行蛋白定量,100 ℃金屬浴10 min使蛋白變性,取各組蛋白樣品各20 μg等質(zhì)量上樣,10%SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h后,抗NICD抗體 (1∶500稀釋?zhuān)?,抗VEGF抗體 (1∶1 000稀釋?zhuān)?,β-actin (1∶1 000稀釋?zhuān)?室溫?fù)u床孵育90 min,4 ℃過(guò)夜。加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記抗體 (1∶20 000稀釋?zhuān)梗?,室溫?fù)u床孵育1 h。將PVDF膜均勻浸入ECL發(fā)光液中,置入凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行曝光。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    Western blotting條帶結(jié)果用Image-J圖像分析軟件進(jìn)行灰度掃描后,以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行半定量分析。各組結(jié)果數(shù)據(jù)均以表示。采用GraphPad Prism 5.0及SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)組間差異進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析,P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 ADSCs形態(tài)學(xué)觀(guān)察

    原代ADSCs分離提取接種后24 h,于倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)大多數(shù)ADSCs已貼壁,形態(tài)呈圓形。48 h觀(guān)察可見(jiàn)ADSCs基本貼壁,形態(tài)逐漸變成短梭形或多角形,72 h觀(guān)察可見(jiàn)ADSCs分裂增殖呈長(zhǎng)梭形并成簇生長(zhǎng),7 d時(shí)觀(guān)察可見(jiàn)ADSCs長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底部,呈集落樣生長(zhǎng),方向性明顯 (圖1A) 。待細(xì)胞融合至80%~90%,進(jìn)行傳代培養(yǎng),傳代后的ADSCs分裂增殖速度加快,可在5 d時(shí)融合至80%,生長(zhǎng)狀態(tài)良好,細(xì)胞形態(tài)均一,呈明顯方向性 (圖1B) 。

    2.2 ADSCs鑒定

    圖1 ADSCs形態(tài)學(xué)觀(guān)察Fig.1 Morphological observation of ADSCs

    ADSCs成脂化誘導(dǎo)后,細(xì)胞體積逐漸變大,胞體逐漸變圓,胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)明顯的脂滴并逐漸增多,14 d油紅O染色倒置相差顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果顯示,所培養(yǎng)細(xì)胞胞漿內(nèi)脂滴被染成紅色 (圖2A) ,證明ADSCs具有成脂向分化潛能。ADSCs成骨化誘導(dǎo)后,細(xì)胞體積逐漸增大,胞體由長(zhǎng)梭形變成橢圓形和多角形,細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)鈣結(jié)晶,20 d茜素紅染色倒置顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果顯示,細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)鈣結(jié)節(jié)被染成紅色 (圖2B) ,證明ADSCs具有成骨向分化潛能。

    2.3 Western blotting 檢測(cè) NICD及VEGF蛋白表達(dá)結(jié)果

    與空白對(duì)照組的NICD (0.671 5±0.050 5)和VEGF(0.688 9±0.039 4) 相比,Sr組的NICD (1.187 7±0.089 2)和VEGF (1.320 0±0.075 5) 蛋白表達(dá)水平顯著提高 (P <0.01,P < 0.001) ,DAPT組的NICD (0.348 3±0.026 2) 和VEGF (0.465 6±0.026 6) 蛋白表達(dá)顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P < 0.01) ;與Sr組相比,Sr+DAPT組的NICD (0.386 7±0.029 1) 和VEGF (1.057 5±0.060 5) 蛋白表達(dá)顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P < 0.001,P <0.01) ,見(jiàn)圖3。

    圖2 ADSCs鑒定Fig.2 Identification of ADSCs

    圖3 Western blotting檢測(cè) NICD及VEGF蛋白表達(dá)水平Fig.3 Detection of protein expressions by Western blotting analysis of NICD and VEGF in osteogenically induced ADSCs

    3 討論

    近數(shù)十年,作為間充質(zhì)干細(xì)胞的豐富來(lái)源,ADSCs已成為再生組織工程技術(shù)的研究熱點(diǎn)。與其他種類(lèi)的間充質(zhì)干細(xì)胞相比,ADSCs因其來(lái)源廣,取材易,增殖能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)具有潛在的優(yōu)勢(shì)[8]。目前存在多種提高ADSCs多向分化潛能的方法,其中Sr已被證實(shí)具有促進(jìn)ADSCs增殖和增強(qiáng)其成骨分化能力的作用。此外,Sr還可以通過(guò)上調(diào)VEGF的表達(dá)促進(jìn)成骨過(guò)程的血管生成[3]。在本研究中,相對(duì)于空白對(duì)照組而言,Sr組VEGF表達(dá)上調(diào),再次證實(shí)了Sr上調(diào)ADSCs成骨分化過(guò)程中VEGF表達(dá)的作用。

    VEGF是調(diào)控血管發(fā)生及形成的最重要的生長(zhǎng)因子之一,參與血管新生及內(nèi)皮細(xì)胞增殖過(guò)程,其在骨的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也起著重要的作用[9]。有研究[10]表明,成骨細(xì)胞分化過(guò)程中釋放的VEGF可促進(jìn)血管生成。KIM等[11]發(fā)現(xiàn)在褐藻糖膠成骨分化誘導(dǎo)下,間充質(zhì)干細(xì)胞的VEGF分泌增加,作用于內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生成血管作用并可加快骨缺損修復(fù)。因此,調(diào)節(jié)骨組織中的VEGF水平為修復(fù)骨愈合不良和促進(jìn)骨再生提供了潛在的治療策略。目前,大多數(shù)研究的內(nèi)容主要是關(guān)于VEGF局部表達(dá)水平變化對(duì)于骨缺損修復(fù)結(jié)果的影響,對(duì)于其作用機(jī)制的詳細(xì)研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)在Sr上調(diào)成骨誘導(dǎo)的ADSCs表達(dá)VEGF的過(guò)程中,NICD表達(dá)明顯提升。由此推測(cè),Notch1信號(hào)通路參與了Sr促成骨誘導(dǎo)ADSCs表達(dá)VEGF這一過(guò)程。

    Notch信號(hào)通路在調(diào)節(jié)胚胎及成體器官細(xì)胞增殖分化及決定細(xì)胞命運(yùn)過(guò)程中起到了重要作用[12]。RAMASAMY等[4]的研究證實(shí),Notch信號(hào)通路可正向調(diào)控骨組織內(nèi)的血管生成,這一作用與DLL4/Notch信通路所介導(dǎo)的抑制其他器官內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用明顯相反。本研究為證實(shí)Notch1信號(hào)通路參與了Sr上調(diào)成骨誘導(dǎo)ADSCs表達(dá)VEGF這一推測(cè),采用DAPT干預(yù)成骨誘導(dǎo)的ADSCs,發(fā)現(xiàn)NICD顯著下降,證明DAPT發(fā)揮了其阻斷Notch1信通路的作用。同時(shí),與對(duì)照組相比DAPT干預(yù)組的VEGF表達(dá)量顯著降低,與LIAO等[13]的研究結(jié)論相一致,提示干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中VEGF的表達(dá)受Notch1信號(hào)通路調(diào)控。采用氯化鍶干預(yù)后,VEGF表達(dá)顯著上調(diào)的同時(shí)NICD表達(dá)顯著增加;為排除其他信號(hào)通路的干擾作用,采用氯化鍶和DAPT共同干預(yù)成骨誘導(dǎo)的ADSCs,發(fā)現(xiàn)VEGF及NICD表達(dá)較Sr組均顯著下降,進(jìn)一步證實(shí)Notch1信號(hào)通路作用有效。以上結(jié)果說(shuō)明ADSCs成骨過(guò)程中VEGF表達(dá)受Notch1信號(hào)通路調(diào)控,Sr可通過(guò)調(diào)控Notch1信號(hào)通路的傳導(dǎo)作用,上調(diào)成骨分化的ADSCs表達(dá)VEGF。

    綜上所述,本研究證實(shí)了Sr能上調(diào)ADSCs成骨過(guò)程中表達(dá)VEGF。在Sr促ADSCs成骨分化過(guò)程中,Notch1信號(hào)通路被激活,并對(duì)VEGF的表達(dá)起正向調(diào)控作用。為Sr促ADSCs修復(fù)骨缺損過(guò)程中血管形成機(jī)制的進(jìn)一步研究鑒定了基礎(chǔ)。

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