烏索酸對高糖誘導(dǎo)人系膜細(xì)胞損傷的作用

岳媛，范秋靈，都姝妍，遠(yuǎn)方，徐莉，李琳，劉楠，姜奕，王力寧

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，沈陽 110001；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，沈陽 110032；3.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110001）

糖尿病腎病 （diabetic nephropathy，DN） 是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎臟病的最常見原因［1］，其發(fā)病機(jī)制尚未明確，尚無有效藥物可以逆轉(zhuǎn)或阻止其進(jìn)展，已成為世界范圍內(nèi)亟待解決的公共衛(wèi)生問題。系膜細(xì)胞是腎小球固有細(xì)胞，也是腎小球內(nèi)最活躍的細(xì)胞，正常情況下無明顯增殖，而在病理?xiàng)l件下則出現(xiàn)異常增殖，導(dǎo)致腎小球硬化。機(jī)械因素、代謝因素以及多種調(diào)節(jié)分子 （包括某些血管活性物質(zhì)、細(xì)胞因子） 等與腎小球硬化的啟動(dòng)及進(jìn)展密切相關(guān)［2］，若不給予適當(dāng)治療腎小球硬化將進(jìn)一步加重［3］，最終導(dǎo)致終末期腎病。烏索酸 （ursolic acid，UA） 是一種來源于植物的五環(huán)三萜類化合物，廣泛存在于漿果、水果及中草藥中，具有抗腫瘤、降血糖、降血脂及抗動(dòng)脈粥樣硬化作用［4-6］。本研究探討UA對高糖狀態(tài)下系膜細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

人腎小球系膜細(xì)胞和HMC4201培養(yǎng)基購自美國Sciencell公司；烏索酸 （89797） 購自美國Sigma公司；MTT粉、AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒購于北京寶賽生物技術(shù)有限公司；TrizolRNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司；Go Taqq PCR Master Mix購自美國Promega公司；兔抗Bcl-xl多克隆抗體購自美國Cell Signal Technology；兔 抗TGF-β1、FN、Bax、survivin多 克隆抗體、兔抗GAPDH多克隆抗體購自美國Proteintech公司；HRP標(biāo)記羊抗兔IgG購自美國Abcam公司。Power Wave XS2全波長酶標(biāo)儀 （美國Bio-Tek公司） 、FACS Calibur流式細(xì)胞儀 （美國BD公司） 、Mini Transblot 電轉(zhuǎn)膜系統(tǒng) （美國Bio-Blot公司） 、相差倒置顯微鏡 （日本Olympus公司） 、 Rotor-Gene 3000 PCR儀 （美國Agilent公司） 。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人系膜細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于培養(yǎng)瓶中，用MCM 4201完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，置于37 ℃、飽和濕度5% CO2的孵箱內(nèi)貼壁傳代培養(yǎng)，隔天換液1次，取5～9代對數(shù)生長期細(xì)胞，消化后制成單細(xì)胞懸液，分為正常糖組、高糖組、高滲對照組、UA治療A、B、C組。正常糖組5.5 mmol·L-1葡萄糖培養(yǎng)；高糖組30.0 mmol·L-1葡萄糖培養(yǎng)；高滲對照組5.5 mmol·L-1葡萄糖+24.5 mmol·L-1甘露醇培養(yǎng)；UA治療A、B、C組分別30.0 mmol·L-1葡 萄 糖+0.5、1.0、2.0 μmol·L-1UA培養(yǎng)。6組均培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。

1.3 方法

1.3.1 MTT法檢測細(xì)胞增殖：收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入150 μL培養(yǎng)液，鋪板，5%CO2，37 ℃孵育至細(xì)胞單層鋪滿孔底 （96孔板） ，每孔加入刺激因素150 μL，分別孵育24 h、48 h后鏡下觀察。每孔加入20 μL 0.5%MTT溶液培養(yǎng)4 h后加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，于570 nm處用酶聯(lián)免疫檢測儀測量各孔光密度 （OD） 值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡：采用Annexin-V/PI雙染法。收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每瓶加入5 mL培養(yǎng)液，調(diào)細(xì)胞密度至5×105/瓶。5%CO2，37 ℃孵育至細(xì)胞貼壁，換含有不同刺激因素的培養(yǎng)液，孵育48 h后每孔加600 μL胰蛋白酶消化，離心5 min后棄上清液，加入緩沖液（500 μL）懸浮細(xì)胞并移入流式管，同時(shí)加入PI （5 μL） 和AnnexinV-FITC（5 μL） 避光反應(yīng)10 min，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析。

1.3.3 實(shí)時(shí)PCR檢測Bcl-xl、survivin、Bax、轉(zhuǎn)化生長因子β1 （transforming growth factor β1，TGF-β1） 、纖連蛋白 （fibronectin，F(xiàn)N） mRNA水平：按照總RNA提取試劑盒說明書提取各組細(xì)胞總NRA，紫外分光光度計(jì)測量RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄以及擴(kuò)增反應(yīng)按試劑盒說明書進(jìn)行。FN正義鏈，5’-CCGCCATTAATGAGAGT GAT-3’，反 義 鏈，5’-AGTTAGTTGCGGCAGGAGAA G-3’，長度133bp；TGF-β1正義鏈，5’-GCCCTGGACA CCAACTATTGC-3’，反義鏈，5’-AGGCTCCAAATGT AGGGGCAGG-3’，長度161bp；survivin正義鏈，5’-GC TGGCTTCATCCATCCACTGC-3’，反義鏈，5’-CAATT TTGTTCTTGGCTCT-3’， 長度220bp； Bcl-xl正義鏈，5’-CCCAGAAAGGATACAGCTGG-3’，反義鏈，5’-GC GATCCGACTCACCAATAC-3’，長度448bp；Bax正義鏈，5’-GACGAGGATTGCTGATA-3’，反義鏈，5’-CTC AGCCCATATTCTTCCAG-3’，長度354bp；β-actin正義鏈，5’-CCATGTACGTTGCTATCCAGG-3’，反 義 鏈，5’-TCTCCTTAATGTCACGCACGA-3’，長 度252 bp；引物由日本TaKaRa公司合成。β-actin作為內(nèi)參對照基因，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理用2-ΔΔCT方法進(jìn)行，計(jì)算樣本mRNA/β-actin mRNA的比值。

1.3.4 Western blotting檢測各組細(xì)胞Bcl-xl、survivin、Bax、TGF-β1、FN蛋白表達(dá)：收集各組細(xì)胞，加入60μL蛋白裂解液及0.6 μL蛋白酶抑制劑，超聲破碎20 min后離心5 min，吸取上清液，BCA法測定蛋白濃度，并調(diào)整至5 μg/μL；7.5%、10%、12% SDS-PAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜2 h，一抗4 ℃孵育過夜。TBST洗膜加二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜，滴加ECL發(fā)光液后觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 UA對系膜細(xì)胞增殖的抑制作用

結(jié)果顯示，24 h各組系膜細(xì)胞增殖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＞ 0.05） ，48 h高糖組系膜細(xì)胞增殖率明顯高于正常糖組 （P ＜ 0.05）；0.5、1.0、2.0 μmol·L-1UA治療組系膜細(xì)胞的增殖率呈劑量依賴性下降，1.0μmol·L-1UA治療組系膜細(xì)胞增殖率明顯低于高糖組 （P ＜ 0.05） ，細(xì)胞生長狀態(tài)良好；2.0 μmol·L-1UA治療組大部分系膜細(xì)胞已經(jīng)死亡，增殖率明顯低于高糖組 （P ＜ 0.05） 。高滲對照組與正常糖組及0.5μmol·L-1UA治療組系膜細(xì)胞增殖率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＞ 0.05） 。提示1.0 μmol·L-1UA能明顯抑制高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖且細(xì)胞狀態(tài)良好，可作為后續(xù)試驗(yàn)的最佳治療劑量。見表1。

2.2 UA對系膜細(xì)胞凋亡的影響

表1 UA對系膜細(xì)胞增殖的影響 Tab.1 Effect of ursolic acid on mesangial cell proliferation

表1 UA對系膜細(xì)胞增殖的影響 Tab.1 Effect of ursolic acid on mesangial cell proliferation

1） P ＜ 0.05 compared with normal glucose group；2） P ＜ 0.05 compared with high glucose group.

Proliferation of mesangial cells 24 h 48 h Normal glucose group 2.66±0.04 3.66±0.32 High glucose group 2.70±0.02 4.33±0.231）High osmotic group 2.61±0.02 3.50±0.22 0.5 μmol·L-1 ursolic acid group 2.69±0.03 3.93±0.11 1.0 μmol·L-1 ursolic acid group 2.66±0.02 3.59±0.062）2.0 μmol·L-1 ursolic acid group 1.69±0.062） 0.67±0.162）Group

48 h各組系膜細(xì)胞凋亡率如圖1所示。正常糖組、高糖組、高滲對照組、UA治療組凋亡率分別為（12.21±0.51） %、 （12.98±0.27） %、 （15.04±0.33） %、（23.02±0.45） %。高糖組與正常糖組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＞ 0.05） ，而UA治療組系膜細(xì)胞凋亡率顯著高于高糖組 （P ＜ 0.05） 。提示UA促進(jìn)系膜細(xì)胞凋亡，抑制系膜細(xì)胞增殖。

圖1 流式細(xì)胞儀分析UA對系膜細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Flow cytometry was performed to analyze the effect of ursolic acid on apoptosis in mesangial cells

2.3 UA對系膜細(xì)胞FN、TGF-β1、Bcl-xl、survivin、Bax表達(dá)的影響

圖2 各組系膜細(xì)胞FN、TGF-β1、Bcl-xl、survivin、Bax mRNA的表達(dá)Fig.2 Effects of ursolic acid on the expression of FN，TGF-β1，Bcl-xl，survivin，and Bax mRNA in mesangial cells

結(jié)果顯示，與正常糖組比較，高糖組FN、TGF-β1、Bcl-xl、survivin表達(dá)明顯增高 （P ＜ 0.05） ，Bax的表達(dá)無明顯變化；與高糖組比較，UA治療組FN、TGF-β1、Bcl-xl、survivin表達(dá)明顯降低 （P ＜ 0.05） ，Bax表達(dá)明顯增高 （P ＜ 0.05） 。見圖2、3。

圖3 各組系膜細(xì)胞FN、TGF-β1、Bcl-xl、survivin、Bax蛋白的表達(dá)Fig.3 Effects of ursolic acid on the expression of FN，TGF-β1，Bcl-xl，survivin，and Bax proteins in mesangial cells

3 討論

DN是糖尿病最重要的并發(fā)癥，同時(shí)也是一個(gè)連續(xù)的病理變化過程，早期階段包括系膜細(xì)胞增殖、腎小球肥大、基底膜增厚及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白聚集，晚期階段為腎小球硬化及間質(zhì)纖維化，最終導(dǎo)致腎臟功能的喪失［7-10］，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（FN）、Ⅳ型膠原的過多沉積是DN腎臟進(jìn)展性纖維化的病理基礎(chǔ)。前期研究［7］發(fā)現(xiàn)高糖刺激人系膜細(xì)胞48 h，系膜細(xì)胞明顯增殖，伴有細(xì)胞因子（TGF-β1）、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（FN）的表達(dá)增強(qiáng)，提示高糖介導(dǎo)了系膜細(xì)胞的增殖與細(xì)胞外基質(zhì)聚集，誘導(dǎo)系膜細(xì)胞損傷。近年研究［11-12］提示在DN早期細(xì)胞凋亡有利于清除過多的增殖細(xì)胞，延緩DN進(jìn)程。

既往研究［13-14］發(fā)現(xiàn)UA誘導(dǎo)Bax/Bcl-2途徑使線粒體釋放細(xì)胞色素C （cytochrome C，CytC） 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。吳斌等［5］研究發(fā)現(xiàn)UA通過抑制AKt磷酸化促進(jìn)線粒體釋放CytC，誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞Jurkat凋亡。劉玲等［14］研究發(fā)現(xiàn)三萜類化合物 （齊墩果酸）可使肝癌細(xì)胞Bcl-2表達(dá)減少，Bax表達(dá)增加，CytC在線粒體中表達(dá)降低而在胞質(zhì)中表達(dá)增加，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可能與其影響線粒體功能和能量代謝有關(guān)。本研究同樣發(fā)現(xiàn)UA抑制Bcl-xL表達(dá)、促進(jìn)Bax表達(dá)，Bax可與線粒體膜上的電壓依賴性陰離子通道蛋白孔道形成復(fù)合物，釋放CytC，參與并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，緩解細(xì)胞損傷。因此UA可能通過促進(jìn)Bax表達(dá)，參與并誘導(dǎo)線粒體釋放CytC，啟動(dòng)系膜細(xì)胞凋亡，維持系膜細(xì)胞正常增殖水平。

綜上所述，UA可以誘導(dǎo)系膜細(xì)胞早期凋亡，緩解高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞損傷，為UA對DN的早期治療提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。