大黃酒炙前后配伍山楂水煎液中7種成分含量測(cè)定

趙娟　沈建平　楊月東　王新東

摘要：目的 建立大黃酒炙前后配伍山楂水煎液中7種成分含量測(cè)定的方法，為大黃酒炙前后配伍山楂的臨床應(yīng)用提供參考。方法 采用HPLC，Thermo-C18 endcapped 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），流動(dòng)相為0.1%磷酸水-乙腈，梯度洗脫，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果 水煎液中沒食子酸、綠原酸、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚7種成分均能達(dá)到基線分離、線性關(guān)系良好，平均回收率分別為104.2%、100.3%、99.8%、102.8%、103.5%、98.5%、99.5%，RSD均小于2.7%。該方法的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好。酒大黃較生大黃除沒食子酸含量升高外，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚均不同程度下降。山楂與生大黃、酒大黃配伍后，水煎液中綠原酸含量有所上升。結(jié)論 該方法可以用于大黃酒炙前后配伍山楂水煎液中7種成分的含量測(cè)定，為其臨床應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞：大黃；酒炙；山楂；高效液相色譜法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.04.018

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）04-0087-04

Abstract： Objective To establish a content determination method for 7 components of water decoction of compatibility of Crataegi Fructus and Rhei Radix et Rhizoma before and after stir-frying with wine； To provide a reference for the clinical compatibility of Rhei Radix et Rhizoma and Crataegi Fructus. Methods HPLC was performed on the column of Thermo-C18 endcapped column （250 mm×4.6 mm， 5 ?m）. The mobile phase was 0.1% phosphoric acid water-acetonitrile system and a linear gradient elution was used. The column temperature was 25 ℃， and the injection volume was 10 μL. The detection wavelength was set at 254 nm. Results The seven markers including gallic acid， chlorogenic acid， aloe-emodin， rheinic acid， rheum emodin， chrysophanic acid and emodin monomethyl ether， reached baseline separation. The linearity was good， and the average recovery was 104.2%， 100.3%， 99.8%， 102.8%， 103.5%， 98.5%， and 99.5%. RSDs of 7 components were all less than 2.7%. The method showed high precision， stability and reproducibility. After prepared with wine， gallic acid content increased in Rhei Radix et Rhizoma， while aloe emodin， rhein， emodin， chrysophanol and physcion decreased to varying degrees. The content of chlorogenic acid increased in water decoction of compatibility of Crataegi Fructus Rhei Radix et Rhizoma. Conclusion The method can be used for the content determination of 7 components of water decoction of the compatibility of Rhei Radix et Rhizoma and Crataegi Fructus before and after stir-frying with wine， providing references for clinical application.

Keywords： Rhei Radix et Rhizoma； stir-frying with wine； Crataegi Fructus； HPLC

化濁活血方是南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院用于治療冠心病經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）術(shù)后再發(fā)胸痛的有效驗(yàn)方，由江蘇省首批著名中西醫(yī)結(jié)合專家高丙麟老先生結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而來。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，冠心病PCI術(shù)后發(fā)生胸痛的根本原因是本虛，即心陽(yáng)氣虛；直接原因是標(biāo)實(shí)，即實(shí)濁內(nèi)生，痹阻心脈。形成實(shí)濁的病理因素是寒、痰、瘀、毒、濕[1]。本方由酒大黃、山楂、黃芪、丹參組成，藥少而精，專攻化濁補(bǔ)氣活血，具有抗血小板、降脂、穩(wěn)定斑塊、止痛作用[2-4]，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)防治冠心病PCI術(shù)后再狹窄引起胸痛的原則不謀而合。根據(jù)中醫(yī)“急則治標(biāo)，緩則治本”原則，方以酒大黃為君藥，配伍山楂，活血化濁，以治其標(biāo)，在方中發(fā)揮主要功效；黃芪與丹參配伍，補(bǔ)氣以行津血，絕痰瘀之源，治其本?，F(xiàn)代藥理研究表明，酒大黃配伍山楂具有降低血清膽固醇及三酰甘油、改善血液流變學(xué)、抗血小板聚集、抗氧化和抗炎作用[5-6]，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)通過改善冠脈血供同時(shí)治療冠脈粥樣硬化來防治冠心病PCI術(shù)后再狹窄引起胸痛的治療原則相符[7]。因此，酒大黃與山楂配伍在本方中發(fā)揮主要功效。本方用于臨床數(shù)十年，療效顯著。曹寧[8]通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方中大黃功效的發(fā)揮方向受配伍環(huán)境、劑量、劑型、炮制、煎服方法等因素影響，其中以配伍環(huán)境為最主要的影響因素。本研究采用HPLC對(duì)大黃酒炙前后與山楂水煎液中沒食子酸、綠原酸、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚7種成分進(jìn)行含量測(cè)定，為化濁活血方的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

Waters 2695高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)WATERS公司），BT25S型十萬分之一電子天平（德國(guó)Sartorius公司），As3120型超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

沒食子酸、綠原酸、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚對(duì)照品（批號(hào)161223、161438、13030701、130312103、13022715、14031711、13022005，純度均≥98%），成都瑞芬思生物科技有限公司。乙腈為色譜純，水為雙蒸水，磷酸為優(yōu)級(jí)純。

生大黃、山楂購(gòu)自貴州同德藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為20170101-02、20170305-02。酒大黃按2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（四部）0213炮制通則酒炙法[9]炮制：取凈大黃片，用黃酒拌勻，悶潤(rùn)至酒被吸盡，置預(yù)熱適度的炒制容器內(nèi)，用文火炒至顏色加深，炒干，略有酒香氣后取出晾涼，篩去碎屑。每100 kg大黃片用黃酒10 kg。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo-C18 endcapped（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動(dòng)相：0.1%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～8 min，95%A；8～25 min，95%～60%A；25～45 min，60%～25%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸、綠原酸、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚對(duì)照品適量于容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得各對(duì)照品溶液。精密量取適量對(duì)照品溶液至容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制得混合對(duì)照品溶液，各對(duì)照品濃度分別為：沒食子酸150 ?g/mL，綠原酸98 ?g/mL，蘆薈大黃素12.8 ?g/mL，大黃酸12 ?g/mL，大黃素15.6 ?g/mL，大黃酚10.0 ?g/mL，大黃素甲醚3.24 ?g/mL。

2.3 供試品溶液的制備

取生、酒大黃飲片各5 g，山楂5 g，用10倍量水（100 mL）浸泡30 min后，回流提取15 min，紗布過濾，藥渣再加8倍量水（80 mL）回流提取15 min，紗布過濾，合并濾液，即得生、酒大黃配伍山楂水煎液。13 000 r/min離心10 min，吸取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

將混合對(duì)照品溶液分別稀釋0、2、4、8、16倍，將稀釋液注入液相色譜儀，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度（?g/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算7種成分峰面積RSD分別為1.6%、0.1%、1.0%、1.9%、2.0%、1.7%、1.5%。均符合含量測(cè)定要求。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“2.1.3 ”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 精密吸取10 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算7種成分峰面積RSD分別為2.1%、0.3%、1.2%、0.5%、2.5%、1.1%、1.9%。均符合含量測(cè)定要求。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定7種成分含量，計(jì)算RSD分別為1.5%、1.8%、0.9%、2.0%、1.2%、2.5%、0.7%。均符合含量測(cè)定要求。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取生大黃飲片2.5 g、山楂2.5 g，分別精密加入沒食子酸、綠原酸、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚6.6、0.8、0.7、0.8、0.2、0.2、0.05 mg。按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6份，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算7種成分的平均回收率和RSD，結(jié)果沒食子酸、綠原酸、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均回收率分別為104.2%、100.0%、99.8%、102.8%、103.5%、98.5%、99.5%，RSD分別為1.1%、1.7%、1.6%、1.5%、0.9%、2.7%、1.9%。

2.9 樣品含量測(cè)定

稱取山楂及生、酒大黃樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行3份，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算7種成分的含量，結(jié)果見表3。

3 討論

大黃、山楂經(jīng)常在臨床中配伍使用，以活血化濁為主要功用。本研究建立了大黃酒炙前后配伍山楂水煎液中7種成分HPLC含量測(cè)定方法，其中包括藥典中大黃測(cè)定項(xiàng)下規(guī)定的5種成分及沒食子酸，同時(shí)測(cè)定了山楂中綠原酸的含量，為大黃配伍山楂的質(zhì)量控制以及臨床應(yīng)用提供了參考。

大黃味苦，性寒，歸脾、胃、大腸、肝、心包經(jīng)。功能瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)。生大黃苦寒，瀉下作用峻烈，經(jīng)酒炙后可以緩和其苦寒之性，增強(qiáng)活血化瘀功效，兼可引藥上行。山楂味酸、甘，性微溫，入脾、胃、肝經(jīng)，功能消食化積、活血散瘀。山楂善于消食積與散瘀血、祛脂化濁。山楂通過調(diào)控多種脂肪代謝酶的機(jī)制調(diào)節(jié)血脂[10]。從本研究結(jié)果可以看出，與生大黃比較，酒大黃山楂水煎液中除沒食子酸含量升高外，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚均不同程度下降。山楂與酒大黃配伍的水煎液中，綠原酸含量有所上升。其中，溶出增多的沒食子酸在心血管疾病的防治中有著重要作用，可抗高血壓、抗心肌梗死、抗血管鈣化[11]。山楂中的綠原酸具有保護(hù)心血管、降糖、降脂、抗菌、抗病毒、抗白血病、抗誘變、抗癌等藥理作用[12]。

本研究建立的HPLC方法可以同時(shí)測(cè)定生、酒大黃配伍山楂水煎液中7種成分含量，為化濁活血方的質(zhì)量控制及臨床應(yīng)用提供參考。本研究顯示，酒大黃較生大黃配伍山楂的水煎液更有利于有效成分溶出，并減少峻下成分析出?；瘽峄钛街羞\(yùn)用酒大黃可增強(qiáng)活血化瘀功效，有效預(yù)防冠心病PCI術(shù)后再發(fā)胸痛。

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（收稿日期：2017-10-17）

（修回日期：2017-11-20；編輯：陳靜）