柳茶總三萜提取富集工藝優(yōu)化及抗缺氧活性研究

王昕　葸慧榮　楊芳芳　何蕾　馬慧萍

摘要：目的 優(yōu)選藏藥柳茶總三萜的提取富集工藝并研究其抗缺氧活性。方法 通過小鼠常壓密閉缺氧實驗篩選柳茶總三萜的提取溶劑；再以總三萜含量、提取率為評價指標，采用正交試驗考察提取時間、提取次數(shù)、料液比，優(yōu)選柳茶總三萜的提取工藝；然后考察大孔吸附樹脂類型、上樣濃度、洗脫劑濃度、洗脫劑體積，優(yōu)選其富集工藝；最后通過小鼠常壓密閉缺氧實驗和急性減壓缺氧實驗研究其抗缺氧活性。結果 優(yōu)選的提取工藝為：70%乙醇提取，料液比為1∶20，提取2次，每次1.5 h，平均總三萜含量可達32.25%；優(yōu)選的富集工藝為：AB-8型大孔吸附樹脂，上樣濃度為2 mg/mL，80%乙醇5 BV洗脫，總三萜含量可達61.09%；柳茶總三萜抗缺氧活性較強，且存在一定的劑量依賴性。結論 本研究優(yōu)選的柳茶總三萜提取富集工藝穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，所得柳茶總三萜具有顯著的抗缺氧活性。

關鍵詞：柳茶；總三萜；提取工藝；富集工藝；抗缺氧

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.04.015

中圖分類號：R284.2；R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）04-0071-06

Abstract： Objective To optimize the extraction and enrichment process of total triterpenes from Sibiraea Angustata； To study its anti-hypoxia activity. Methods The extraction solvent of total triterpenoids of Sibiraea Angustata was screened by atmospheric pressure anti-hypoxia test. The content of total triterpenes and extraction rate were set as evaluation indexes. The effects of extraction time， extraction times and ratio of material to liquid on extraction were investigated by orthogonal test. The extraction process was optimized. Resin type， concentration of sample， eluent concentration and eluent volume were investigated to optimize the enrichment process of total triterpenes of Sibiraea Angustata. Finally， the anti-hypoxia activity was studied by atmospheric pressure test and acute decompression test. Results The optimum extraction process was as follows： 70% ethanol extraction， the ratio of material to liquid was 1：20， extrat 2 times with 1.5 h for each time， and the content of total triterpenes was 32.25%. The optimum enrichment process was： AB-8-type macroporous adsorption resin， the loading concentration of 2 mg/mL， 80% ethanol 5 BV elution， and total triterpenes content was up to 61.09%； Sibiraea Angustata total triterpenes anti-hypoxia activity test was strong， and had a certain dose dependency. Conclusion The extraction and enrichment process of total triterpenes from Sibiraea Angustata is stable， reproducible and has significant anti-hypoxia activity.

Keywords： Sibiraea Angustata； total triterpenes； extraction process； enrichment process； anti-hypoxia

柳茶是薔薇科Rosaceae鮮卑花屬Sibiraea Maxim植物窄葉鮮卑花Sibiraea angustata（Rehd.）Hand-Mazz.的葉和嫩枝，是我國藏族民間傳統(tǒng)藥材，生長在海拔3000～5000 m的高原地帶，分布在青海、西藏、云南及甘肅等地區(qū)，資源豐富。民間將窄葉鮮卑花作為茶飲，因其形狀似柳葉，故稱“柳茶”。其功效為疏散風熱，治療食積居多[1]。由于特殊的生長環(huán)境，長期地理氣候的劇變導致柳茶體內(nèi)的微量元素種類和數(shù)量的分布也發(fā)生了一些新的變化[2]。柳茶中的化學成分以三萜類為主[3]，主要包括熊果酸、齊墩果酸。此外，還含有部分單萜[4-8]、黃酮類和揮發(fā)油等成分。有研究報道齊墩果酸和熊果酸均具有清除超氧陰離子、羥自由基和DPPH自由基的作用[9-10]，臨床主要用于消炎、保肝[11]、抗菌、抗病毒、降血壓、降血脂[12-13]、抗腫瘤[14]等，這些作用大多與其清除自由基與抗氧化活性相關。但是，關于柳茶三萜類化合物的抗缺氧作用目前尚未見相關報道。本研究首先通過常壓密閉缺氧實驗篩選柳茶總三萜的提取溶劑，采用正交試驗優(yōu)選其提取工藝，然后采用大孔吸附樹脂優(yōu)選富集工藝，最后通過常壓密閉缺氧實驗和急性減壓缺氧實驗研究其抗氧化活性，為藏藥柳茶的深入研究奠定基礎。

1 儀器、試藥與動物

UV2800SPC紫外可見分光光度計（上海舜宇恒平科學儀器公司），Spectramax i3多功能酶標儀（Molecular Devices公司），AE240型萬分之一分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），SK3300L超聲清洗儀器（上海精密儀器儀表有限公司），RE-3000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），BHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司），HH-4電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司），AFX20501-P超純水機（重慶艾科浦外貿(mào)頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司），800型離心機（上海手術器械廠）。

柳茶藥材購于甘肅省甘南藏族自治州合作市郊（海拔3200 m以上），經(jīng)蘭州大學藥學院生藥學研究所楊永建教授鑒定其為薔薇科Rosaceae鮮卑花屬植物窄葉鮮卑花Sibiraea angustata（Rehd.）Hand-Mazz.的葉。乙酰唑胺原料藥（武漢遠城科技發(fā)展有限公司，批號100114，純度≥98%），熊果酸對照品（北京索萊寶科技有限公司，批號20161213，純度≥98%）；HPD500、AB-8、DA201、D101、LX-60大孔吸附樹脂（北京索萊寶科技有限公司）。乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等試劑均為分析純。

清潔級BABL/C雄性小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，5周齡，蘭州軍區(qū)陸軍總醫(yī)院動物實驗科提供，動物許可證號SYXK（軍）2014-0029。動物自由攝食飲水。飼養(yǎng)室保持良好通風，控制環(huán)境溫度24～26 ℃、相對濕度50%～60%，12 h循環(huán)光照。

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行分析。

2 方法與結果

2.1 柳茶總三萜含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備

取熊果酸標準品2.00 mg，用甲醇超聲溶于20 mL容量瓶中，即得0.1 mg/mL對照品溶液。

2.1.2 標準曲線的制備

取0.1、0.2、0.3、0.6、0.8、1.0 mL對照品溶液，水浴揮干溶劑，依次加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL，搖勻，加入高氯酸1.2 mL，60 ℃水浴15 min，取出，冷卻至室溫，加入5 mL冰乙酸，混勻后以顯色劑為空白于546 nm波長處測定吸光度（顯色30 min內(nèi)測定）。以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，其回歸方程為：Y=3.264 5X+0.043 7（r=0.999 2）。

2.1.3 供試品溶液的制備

精密稱取柳茶提取樣品4 mg于10 mL容量瓶中，甲醇超聲溶解。取0.5 mL各供試品，按“2.1.2”項下方法進行測定，于546 nm波長處測定吸光度，計算總三萜含量。

2.2 吸水率考察

稱取藥材5.0 g，分別稱取3份，加25 mL水完全浸潤，過濾，稱重，計算吸水率。吸水率（%）=（藥材濕重-藥材干重）÷藥材干重×100%。結果見表1。吸水率為187.44%，因此初次加水需加2倍量的水。

2.3 小鼠常壓密閉缺氧實驗篩選提取溶劑

稱取柳茶藥材25 g，分別加入水、70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇提取，提取溫度為80 ℃，每次提取2 h，提取2次，合并提取液。減壓濃縮后揮發(fā)去溶劑，采用真空冷凍干燥制成細粉待用。將小鼠隨機分成缺氧模型組、水提取物組、70%乙醇提取物組、80%乙醇提取物組和95%乙醇提取物組，各給藥組灌胃劑量為500 mg/kg（藥液濃度10 mg/mL，灌胃體積1 mL），缺氧模型組給予等量生理鹽水，各組均灌胃5 d。最后一次給藥后60 min，將各組小鼠放入250 mL廣口瓶（瓶中事先放入5 g堿石灰，用于吸收二氧化碳與水分，并且在瓶底放入適量濾紙吸取尿液與糞便），在瓶口涂抹凡士林進行密閉，隨后開始計時，當小鼠呼吸停止時結束計時，記錄小鼠在密閉實驗瓶中的存活時間。延長率（%）=（藥物組存活時間-模型組存活時間）÷模型組存活時間×100%，結果見表2?？梢?，70%乙醇提取物抗缺氧活性最好，因此確定70%乙醇為提取溶劑。

2.4 正交試驗優(yōu)選提取工藝

以總三萜含量、提取率為評價指標，采用L9（34）正交試驗，根據(jù)預試驗確定的提取溫度為80 ℃，考察料液比（A）、提取時間（B）、提取次數(shù)（C）3個因素對提取結果的影響。提取因素水平見表3。

2.4.1 正交試驗結果及分析

正交試驗采用多指標進行統(tǒng)計分析，評分采用加權法進行處理。綜合評分=總三萜含量×0.5+提取率×0.5。正交試驗結果見表4，方差分析見表5。各因素對提取結果的影響大小為B>A>C，其中B（提取溫度）對結果影響最大，因此，確定最佳工藝為A1B2C2，即提取溫度為80 ℃，加入20倍量70%乙醇，提取2次，每次1.5 h。

2.4.2 提取工藝驗證試驗

精確稱取柳茶25 g，根據(jù)優(yōu)化的提取工藝進行提取，重復工藝條件3次，計算總三萜含量和提取率，再將提取物以500 mg/kg予小鼠灌胃，通過常壓密閉缺氧實驗驗證抗缺氧活性，結果見表6。結果表明正交試驗所得的工藝穩(wěn)定，重復性好，結果可靠。

2.5 大孔吸附樹脂優(yōu)化富集工藝

2.5.1 不同型號大孔吸附樹脂篩選

將預處理過的5種大孔吸附樹脂（型號分別為D101、HPD200、HPD500、AB-8、LX-60）分別稱取2.00 g，置于100 mL具塞三角瓶中，加入樣品溶液40 mL，以一定的速度振搖，每隔5 min搖30 s，持續(xù)振搖1 h，靜置8 h后進行過濾。取濾液0.5 mL，按“2.1.2”項下方法進行測定，計算總三萜的剩余量和吸附量。

將過濾后的樹脂置于125 mL容量瓶中，加入95%乙醇40 mL，于20 ℃以一定速度振搖，每隔5 min搖30 s，持續(xù)振搖1 h，靜置4 h充分解吸附，收集濾液，取濾液0.5 mL，按“2.1.2”項下方法進行測定，計算總三萜的剩余量和吸附量，結果見表7。

結果表明，AB-8型和D101型樹脂的吸附率較高，而AB-8型樹脂的解析率較高，因此選用AB-8型樹脂進行柳茶總三萜的富集。

2.5.2 上樣濃度對柳茶總三萜吸附的影響

將提取的柳茶粉末配成濃度分別為0.8、1、2、4、5 mg/mL的溶液，選用AB-8型樹脂，各濃度溶液上樣量200 mL，吸附2 h后，用95%乙醇同條件洗脫，收集洗脫液，測定總三萜含量。結果見圖1。可見，上樣濃度為2 mg/mL時，AB-8樹脂對藥材的吸附率最高，因此選用2 mg/mL為上樣濃度。

2.5.3 洗脫劑濃度對柳茶總三萜解析的影響

取AB-8型樹脂，上樣量200 mL，濃度為2 mg/mL，吸附2 h后，以2 BV蒸餾水沖洗，再分別以2 BV的濃度分別為10%、30%、50%、80%、95%乙醇梯度洗脫，收集不同濃度的洗脫液，測定總三萜含量。結果見圖2?？梢?，80%乙醇洗脫液中總三萜的含量最高，因此選擇80%乙醇進行洗脫。

2.5.4 乙醇洗脫體積對柳茶總三萜解析的影響

取等量的AB-8樹脂濕法上柱，上樣量為200 mL，上樣濃度為2 mg/mL，分別吸附2 h后，以2 BV蒸餾水洗脫，再用80%乙醇以1、2、3、4、5、6、7 BV體積洗脫，收集所有洗脫液，測定總三萜含量，結果見圖3?？梢?，當以5 BV體積洗脫樹脂時，總三萜的洗脫率最大，而當再增加洗脫劑體積時，總三萜的洗脫率基本無變化，因此選擇以5 BV體積的80%乙醇進行洗脫。

2.6 抗缺氧活性驗證

2.6.1 小鼠常壓密閉缺氧實驗

將小鼠，隨機分為缺氧模型組、陽性藥組（乙酰唑胺，灌胃劑量為350 mg/kg）及柳茶總三萜高、中、低劑量組（灌胃劑量分別為375、250、125 mg/kg），每組10只。各組均連續(xù)灌胃5 d。按“2.3”項下方法進行常壓密閉缺氧實驗，驗證柳茶總三萜的抗缺氧活性，結果見表8。與缺氧模型組比較，柳茶總三萜高、中、低劑量組差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01），表明其抗缺氧活性較強。

2.6.2 小鼠急性減壓缺氧實驗

小鼠分組方法與“2.6.1”項下相同，各組小鼠灌胃5 d，最后一次灌胃結束后50 min，將小鼠置于高原低壓低氧模擬氧艙中，將海拔升至10 000 m，停留1 h后，計算小鼠死亡率，結果見表9?？梢?，柳茶總三萜富集物具有較強的抗缺氧活性，并且其抗缺氧活性呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

3 討論

傳統(tǒng)溶劑提取方法主要包括煎煮法、浸漬法、回流法和滲漉法[15]，選擇不同的提取方法需要從經(jīng)濟、提取效率、實驗周期等多方面考慮。中藥提取時合理的提取工藝和指標的選擇能夠有效地評價工藝的優(yōu)良[16]。本試驗在前期預試驗基礎上，采用回流法提取柳茶總三萜，選擇提取溫度為80 ℃，正交試驗對料液比、提取時間、提取次數(shù)3個常見影響因素進行考察。在這3種因素中，料液比的增加可以提高溶劑與藥材的接觸面積，加速有效成分的浸出，基于前期試驗結果，本試驗從有效成分的浸出率以及經(jīng)濟方面考慮，選取料液比為1∶10、1∶15、1∶20進行考察；提取時間可以改變藥物的有效成分從細胞壁中分離的時速，但是，提取時間過長會使藥物中有效成分的結構發(fā)生改變而被破壞。一般藥材在提取2 h以上藥液中有效成分的濃度不會再顯著提高，因此，從保護有效成分的角度出發(fā)，選取提取時間為2、1.5、1 h進行考察；提取次數(shù)增多可以提高有效成分在藥液中的濃度，根據(jù)前期試驗結果分析，藥材提取3次以上其藥液濃度變化不明顯，因此，從節(jié)約溶劑成本與提高藥液濃度出發(fā)，選取提取次數(shù)為1、2、3次進行考察。根據(jù)正交試驗結果的直觀分析及方差分析，3種因素對柳茶總三萜提取的影響大小依次為：提取時間>料液比>提取次數(shù)，其中提取時間的影響具有統(tǒng)計學意義。

在3種因素中，提取時間的影響最大，筆者推測柳茶中三萜化合物的環(huán)狀結構會隨著提取時間的延長發(fā)生重排，結構改變會導致其有效成分被破壞。此外，料液比和提取次數(shù)為次要影響因素，這可能是在提取柳茶總三萜時，溶劑和提取次數(shù)改變對結果的影響較小。最終確定的工藝為：提取溫度為80 ℃，加入20倍量70%乙醇，提取2次，每次1.5 h，柳茶總三萜含量可達32.25%。

大孔吸附樹脂對天然藥物成分的吸附具有一定選擇性，最終可達到富集純化的目的。為了能夠制備符合要求的中藥有效部位原料藥，在確定提取工藝的基礎上以柳茶總三萜含量為評價指標進行富集工藝的優(yōu)化，最后確定的富集工藝為：AB-8型大孔吸附樹脂濕法上柱，上樣濃度為2 mg/mL，吸附2 h，以2 BV體積的蒸餾水沖洗，10%乙醇洗去雜質(zhì)，再以5 BV的80%乙醇以2 BV/h速度洗脫，總三萜含量可達61.09%，將總三萜含量較提取物提高了0.9倍，其抗缺氧活性也提高了1倍，表明AB-8型樹脂對柳茶總三萜的富集效果良好。

小鼠在缺氧條件下體內(nèi)的能量代謝出現(xiàn)障礙，生理功能紊亂，表現(xiàn)為一些蛋白質(zhì)如缺氧誘導因子-1α、血管內(nèi)皮生長因子、Nrf2等代謝出現(xiàn)異常，產(chǎn)生自由基的蓄積，氧化應激系統(tǒng)障礙[17]，影響其各項生理活動且體內(nèi)的自我調(diào)節(jié)系統(tǒng)紊亂以致死亡。常壓密閉缺氧實驗以小鼠存活時間延長率為指標，判斷藥物抗缺氧活性的優(yōu)劣[18]。小鼠在常壓密閉條件下產(chǎn)生過氧化應激，自由基大量堆積，使心肌受到嚴重損害[19]，最終導致小鼠死亡。實驗結果表明，柳茶總三萜各劑量組均能不同程度地延長小鼠缺氧狀態(tài)下的存活時間，抗缺氧作用顯著，且柳茶總三萜的抗缺氧活性呈劑量依賴性。急性減壓缺氧實驗模擬高原低壓缺氧環(huán)境，根據(jù)小鼠的存活率判斷其抗急性缺氧能力的強弱，從而評定藥效優(yōu)劣。低壓氧艙模擬10 000 m缺氧環(huán)境造成的缺氧模型實驗表明，3種劑量均能使缺氧狀態(tài)下小鼠的存活率提高，且柳茶總三萜高劑量組存活率最高。常壓密閉缺氧實驗及急性減壓缺氧實驗結果均表明，柳茶總三萜具有較強的抗缺氧活性，其抗缺氧活性呈劑量依賴性。但是其抗缺氧作用的機制還有待進一步研究。

本試驗將評價藥材提取富集工藝的理化指標（提取率、總三萜含量）與藥效學指標（小鼠抗缺氧活性）綜合進行評價，方法科學合理，重復性好，可以為進一步開發(fā)藏藥柳茶提供依據(jù)。

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（收稿日期：2017-05-24）

（修回日期：2017-06-12；編輯：陳靜）