一種具有磷酸酶活性的金黃色葡萄球菌蛋白的初步鑒定

于立權(quán) 呂茂麗 吳志軍 劉振華 李玉環(huán) 崔玉東

摘 要：金黃色葡萄球菌是一種人畜重要的致病微生物，尋找新型藥物靶標(biāo)是及時(shí)有效治療金黃色葡萄球菌感染的潛在途徑。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)數(shù)據(jù)庫，體外設(shè)計(jì)并合成了一對(duì)特異引物，應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增出一種新的磷酸酶基因，并將該基因克隆至表達(dá)載體pET2a上。經(jīng)測(cè)序、酶切和PCR鑒定正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21中，經(jīng)IPTG體外誘導(dǎo)表達(dá)出重組蛋白并對(duì)其進(jìn)行了磷酸酶活性測(cè)定。結(jié)果表明：該基因編碼蛋白具有更多依賴于鎂離子的磷酸酶活性，這種酶活性受到特異性抑制劑氟化鈉的抑制。研究結(jié)果為進(jìn)一步挖掘該蛋白作為金黃色葡萄球菌感染有效治療藥物靶點(diǎn)提供了數(shù)據(jù)資料。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌；磷酸酶；酶活性

中圖分類號(hào) R378 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2018）07-0028-3

Elementary Identification of Activity of Phosphatase of Protein from Staphylococcus aureus

Yu Liquan et al.

（College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，China）

Abstract：Staphylococcus aureus is an important pathogenic microorganism，and the exploration of novel drug targets is a potential way to effective timely conduct the infection of Staphylococcus aureus. Based on the database，a pair of special primers were designed and synthesized in vitro. A new phosphatase gene was amplified by PCR，and the target gene was cloned to the vector pET2a. After sequencing，enzyme digestion and PCR identification，the recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli BL21. The recombinant protein was induced by IPTG in vitro and the activity of enzyme was determined. The results showed that the protein coded by the target gene had activity of phosphatase which was more dependent on magnesium ion. The activity of protein enzyme was specific inhibited by sodium fluoride. The results provide data for the further excavation of this protein as an effective therapeutic drug target for Staphylococcus aureus infection.

Key words：Staphylococcus aureus；Phosphatase；Enzyme activity

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是人畜重要的致病微生物，能引起廣泛的人畜局部或全身感染而導(dǎo)致疾病發(fā)生[1，2]，如畜牧業(yè)上奶牛乳房炎和子宮內(nèi)膜炎[3]、醫(yī)院或社區(qū)內(nèi)肺炎[4]、敗血癥和膿毒癥[5]等感染性疾病。隨著大量頭孢菌素尤其是第三代頭孢菌素等高效廣譜抗菌藥物的大量使用和濫用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌菌株頻現(xiàn)，多重耐藥性增加，給人類公共衛(wèi)生安全造成了極大的威脅[6]。因此，迫切需要尋找一種替代預(yù)防或治療金黃色葡萄球菌感染的新型藥物。

金黃色葡萄球菌含有很多致病因子，如溶血素、殺白細(xì)胞素、腸毒素等毒素[7]和凝固酶、耐熱核酸酶、酚可溶性調(diào)節(jié)蛋白（PSM）等侵襲性酶類[8]。目前，雖然國(guó)內(nèi)外對(duì)于金黃色葡萄球菌這些致病因子的分子特征、作用機(jī)制、臨床應(yīng)用潛能等方面研究較多[9-11]，但對(duì)于具有免疫抑制性和耐藥性的金黃色葡萄球菌研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，需要進(jìn)一步深入挖掘。

由磷酸激酶和磷酸酶控制的底物可逆磷酸化是細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界刺激的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制，可以使靶蛋白在活化與失活之間轉(zhuǎn)換，從而實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活或失活，進(jìn)而調(diào)控著細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和脅迫響應(yīng)[12]。越來越多的研究表明，磷酸酶在金黃色葡萄球菌中調(diào)控著壓力脅迫感應(yīng)和生物膜形成等許多細(xì)胞過程，并與毒力密切相關(guān)[13-15]。為深入探索磷酸酶在金黃色葡萄球菌可逆磷酸化信號(hào)通路中的功能和識(shí)別新藥靶標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)體外克隆表達(dá)了一種具有磷酸酶活性的金黃色葡萄球菌蛋白并進(jìn)行了活性測(cè)定，研究結(jié)果可為將來新型抗菌藥物開發(fā)提供更多的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒 實(shí)驗(yàn)中所用的金黃色葡萄球菌菌株Newman、大腸桿菌DH5α和BL21、質(zhì)粒pET32a為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 工具酶和生化試劑等 限制性內(nèi)切酶購自Thermo scientific公司，Taq DNA聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，PMD18-T和T4 DNA連接酶購自大連寶生物公司?；蚪M提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒及膠回收試劑盒購自Axygen公司，蛋白磷酸酶測(cè)定試劑盒購自Promega公司。

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Pubmed數(shù)據(jù)庫中一個(gè)假定的金黃色葡萄球菌磷酸酶的基因序列，利用Primer5軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物F1和R1，上游引物F1引入BamH I位點(diǎn)，下游引物R1引入Sal I位點(diǎn)。引物委托蘇州金唯智生物科技有限公司合成。引物序列如下：

F1：5'-GCCGGATCCAAGATAGGGACAATCGCCG-3'，

R1：5'-GCGGTCGACAATTTCTATTATTTGTATCGTC

TC-3'。

1.4 磷酸酶基因的克隆和驗(yàn)證 以基因組試劑盒提取的金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，用引物F1和R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，然后95℃ 30s，60.3℃ 30s，72℃ 1min，共30個(gè)循環(huán)，末次循環(huán)后72℃延伸5min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。將用PMD18-T載體進(jìn)行TA克隆的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒和載體pET32a分別進(jìn)行BamH I/Sal I雙酶切，回收純化后進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌。用酶切和PCR方法驗(yàn)證陽性克隆。

1.5 磷酸酶基因的原核表達(dá) 以1：100稀釋過夜培養(yǎng)的重組菌，接種于含有100μg/ml氨芐的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當(dāng)菌液OD600達(dá)到0.5時(shí)，加入終濃度為1mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。將菌體離心收集后超聲裂解，SDS-PAGE電泳分析。在進(jìn)行酶活性測(cè)定時(shí)，大量表達(dá)的蛋白是以包涵體形式存在的。實(shí)驗(yàn)中用含8M尿素的緩沖液溶解包涵體，再緩慢稀釋至溶液中尿素終濃度為2M。

1.6 酶活性測(cè)定 按照磷酸酶測(cè)定試劑盒的說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)中分別設(shè)置組別為：酶、底物、酶+底物、酶+底物+氯化鎂、酶+底物+氯化鎂+氟化鈉、酶+底物+氯化錳、酶+底物+氯化錳+氟化鈉。每組樣品加入緩沖液后37℃反應(yīng)3min，隨后加入終止液室溫作用15min。酶標(biāo)儀測(cè)定OD600nm值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成磷酸根濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷酸酶基因的PCR擴(kuò)增與重組質(zhì)粒的酶切鑒定 以金黃色葡萄球菌Newman基因組為模板，PCR擴(kuò)增得到約800bp的目的條帶（圖1）。將TA克隆的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序后，顯示序列全長(zhǎng)為804bp，其核苷酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫上相對(duì)應(yīng)的核苷酸序列同源性達(dá)100%。將用pET32a載體亞克隆得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，小量培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，BamH I/Sal I雙酶切后獲得約0.8kb和約5.9kb大小兩條條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖2），說明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 磷酸酶的大腸桿菌異源表達(dá) 將構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21菌株，以1M濃度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。同時(shí)設(shè)未轉(zhuǎn)入空載體空菌和轉(zhuǎn)入空載體的BL21做對(duì)照。結(jié)果顯示，通過設(shè)定的不同誘導(dǎo)時(shí)間誘導(dǎo)，重組蛋白均有很好表達(dá)，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，重組蛋白表達(dá)量并沒有發(fā)生顯著變化。在空菌和含有表達(dá)載體pET32a的菌體中，均可見在約在34kDa左右有菌體本身的一種蛋白存在。我們表達(dá)的目標(biāo)蛋白的電泳行為正好與該蛋白的電泳行為相似（圖3）?？梢耘袛啵贗PTG誘導(dǎo)的重組菌體中，實(shí)際重組蛋白是誘導(dǎo)表達(dá)的，這在后續(xù)的酶活性測(cè)定中可以間接說明這一點(diǎn)。

2.3 磷酸酶的酶活性體外測(cè)定 大量表達(dá)的包涵體蛋白用尿素溶解稀釋后，應(yīng)用商品化試劑盒，對(duì)合適濃度的蛋白進(jìn)行了酶活性測(cè)定。當(dāng)僅僅加入酶或和底物時(shí)，反應(yīng)體系中游離磷酸的含量很低。但加入Mg2+后，酶與底物寡肽反應(yīng)釋放的游離磷酸量增高，達(dá)到0.34%，加入磷酸酶特異性抑制劑NaF后，反應(yīng)體系中的酶活性受到抑制，降到僅僅加入酶或和底物時(shí)的水平。加入Mn2+后，酶與底物寡肽反應(yīng)釋放的游離磷酸量增高，達(dá)到0.36%，增高的量略大于加入Mg2+增高的量的水平，加入磷酸酶特異性抑制劑NaF后，反應(yīng)體系中的酶活性受到稍微抑制，說明該蛋白的酶活性主要依賴于Mg2+（圖4）。

3 結(jié)論與討論

因金黃色葡萄球菌感染導(dǎo)致的疾病類型多樣，病情復(fù)雜。同時(shí)，由于當(dāng)今臨床上激素、抗生素等的過度應(yīng)用，金黃色葡萄球菌耐藥菌株特別是多重耐藥菌株的頻現(xiàn)，迫切需要新型的金黃色葡萄球菌感染預(yù)防治療藥物和全新的治療方案[16，17]。

雖然對(duì)于金黃色葡萄球菌的致病機(jī)理等研究較多[8，10]，但對(duì)于關(guān)乎金黃色葡萄球菌致病力的磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究依然很少[13，15]，需要深入挖掘磷酸化相關(guān)節(jié)點(diǎn)蛋白[18]，進(jìn)而研究這些蛋白在金黃色葡萄球菌致病力中的貢獻(xiàn)，來發(fā)現(xiàn)和識(shí)別新型藥物靶標(biāo)。

本研究對(duì)Pubmed數(shù)據(jù)庫中一種生物信息學(xué)分析具有磷酸酶活性的金黃色葡萄球菌蛋白進(jìn)行了體外克隆表達(dá)并進(jìn)行了酶活性分析，初步鑒定為一種更多依賴Mg2+活性的磷酸酶，這種酶活性受到特異性抑制劑NaF的抑制。研究結(jié)果為將來開展一系列針對(duì)金黃色葡萄球菌磷酸酶為藥物靶點(diǎn)的篩選工作奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)編：施婷婷）