藍(lán)莓嫩莖不同提取物抗氧化能力的比較研究

劉靜 李曉英

摘 要：該研究以藍(lán)莓嫩莖為原料，分別使用水、甲醇和乙醇3種提取劑，在固定條件下（提取溫度70℃、提取時(shí)間1h、料液比為1∶20g/mL、提取劑濃度為70%），對(duì)藍(lán)莓嫩莖的多酚類物質(zhì)進(jìn)行提取，研究不同提取劑對(duì)藍(lán)莓嫩莖粗多酚類和粗黃酮類的提取效率差異，并在設(shè)置的濃度梯度下，對(duì)3種提取液的抗氧化活性進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，在相同的條件下，乙醇作為提取劑的提取效果最好，甲醇次之，水相對(duì)最差。同樣地，在還原力、羥基清除能力、DPPH清除能力、總抗氧化能力4個(gè)方面，3種提取液的順序皆為：乙醇>甲醇>水。因此，乙醇作為提取劑可對(duì)藍(lán)莓嫩莖的抗氧化活性有最大程度的保留，可用于天然抗氧化物的開發(fā)和利用。

關(guān)鍵詞：藍(lán)莓嫩莖；提?。欢喾?；黃酮；抗氧化活性

中圖分類號(hào) TS255.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2018）10-0020-04

Comparison of Antioxidant Capacity of Different Extracts from Blueberry Leaves Tender Stem

Liu Jing et al.

（College of Forestry and Life Science，Chongqing University of Arts and Science，Chongqing 402160，China）

Abstract：With comminuted blueberry leaves tender stem as raw material，using the water，methanol and ethanol three kinds of extraction agent，in a fixed condition （extracting temperature 75 ℃，extracting time 1 h，ratio of solid-liquid 1∶20g/mL and extraction agent concentration 50%），extracting the polyphenols and flavonoids from blueberry leaves tender stem and the extraction efficiency of polyphenols and flavonoids from blueberry leaves tender stem with different extracting agents were researched，the antioxidant activity of hree kinds of extract were evaluated in the fixed concentration gradient. The extraction effect of ethanol is the best as a extraction agent，methanol is the second and the water is the worst under the same conditions.Similarly，the reducing power，hydroxyl radical scavenging ability，DPPH scavenging abilities，total antioxidant capacity of three kinds of extract are all decreased in the order of ethanol>methanol> water. Experimental results showed that ethanol could preserve the antioxidant activity of blueberry leaves tender stem to the maximum extent as an extraction agent，which could be used for the development and utilization of natural antioxidants.

Key words：Blueberry tender stem；Extract；Polyphenol；Flavone；Antioxidant activity

藍(lán)莓，屬杜鵑花科越橘屬多年生落葉或常綠灌木。藍(lán)莓果實(shí)中有大量的黃酮、多酚、花青素等活性物質(zhì)，且有較高的抗氧化活性，但其昂貴的價(jià)格限制了藍(lán)莓的廣泛應(yīng)用，進(jìn)而人們把注意力轉(zhuǎn)移到藍(lán)莓葉上[1]。藍(lán)莓葉中含有粗纖維、粗蛋白、脂肪酸、萜類、甾醇、礦質(zhì)元素、有機(jī)酸、氨基酸、糖類、維生素和大量多酚類化合物。作為一種藥用植物，藍(lán)莓以葉入藥，性溫、味苦，有利尿、消炎、解毒之功效，并可用于風(fēng)濕、痛風(fēng)[2]。藍(lán)莓葉中含有豐富的多酚類和黃酮類化合物，大量研究證明，多酚類和黃酮類化合物具有抗氧化、清除自由基、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎癥等廣泛的生物活性[3]。目前，市場(chǎng)上的抗氧化劑主要分為天然抗氧化劑和化學(xué)合成抗氧化劑。由于化學(xué)合成抗氧化劑具有一定的毒性、致畸性和潛在的致癌性，使用過多會(huì)對(duì)人體健康造成重大危害。因此，尋找安全、高效的天然抗氧化劑成為近年來的一大研究熱點(diǎn)。天然抗氧化劑主要來源于植物，具有化學(xué)合成抗氧化劑所沒有的諸多優(yōu)點(diǎn)[4]。因此，將藍(lán)莓進(jìn)行綜合利用，既能產(chǎn)生很好的經(jīng)濟(jì)效益，又能減少環(huán)境污染[5]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 藍(lán)莓葉嫩莖：重慶文理學(xué)院星湖校區(qū)黃瓜山產(chǎn)，藍(lán)莓品種為南金3#（兔眼高叢藍(lán)莓），樹齡3a；經(jīng)40℃烘干8～10h使水分含量低于8%以下，粉粹過60目篩密封-80℃保藏備用。實(shí)驗(yàn)前將樣品置于干燥器中平衡過夜。DPPH、ABTS采購(gòu)于上海金穗生物科技有限公司，其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備 RRH-200型高速多功能粉粹機(jī)：上海緣沃工貿(mào)有限公司；FA2104電子天平：上海精科天平有限公司；DK-98-I電子恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；RZ-50高速微量離心機(jī)：長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；754型紫外可見分光光度計(jì)：上海舜宇恒平開學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藍(lán)莓葉水提取物的制備 準(zhǔn)確稱取1g試樣，于150mL錐形瓶中，加入酸化過的水20mL，置于70℃水浴中浸提1h，每15min取出搖晃1次。浸提液經(jīng)抽提過濾并定容至50mL，做3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 乙醇提取物的制備 準(zhǔn)確稱取1g試樣，于150mL錐形瓶中，加入酸化過的70%乙醇20mL，置于70℃水浴中浸提1h，每15min取出搖晃1次。浸提液經(jīng)抽提過濾并定容至50mL，做3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 甲醇提取物的制備 準(zhǔn)確稱取1g磨碎試樣，于150mL錐形瓶中，加入酸化過的70%甲醇20mL，置于70℃水浴中浸提1h，每15min取出搖晃1次。提液經(jīng)抽提過濾并定容至50mL，做3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 提取物多酚含量的測(cè)定[6] 取1mL試液于25mL的容量瓶中，再加入1mL經(jīng)稀釋過的Folin-Ciocalteu試劑，用7.5%的碳酸鈉溶液定容至刻度，搖勻，在765nm處，用1cm比色皿，試劑空白作參比，測(cè)定吸光度。根據(jù)藍(lán)莓葉嫩莖的總多酚平均含量按下列公式計(jì)算：y=3.99x+0.0913。其中：y為吸光度值；x為多酚含量（mg/mL）。

1.3.5 提取物黃酮含量的測(cè)定[7] 分別取樣液2mL、加入1mL5%的亞硝酸鈉混勻，6min后加入1mL10%硝酸鋁，6分鐘后加10mL4%氫氧化鈉混勻，用去離子水定容到25mL，靜置15min，反應(yīng)液充分混勻，15min后在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。藍(lán)莓葉嫩莖的總黃酮平均含量按下列公式計(jì)算：y=0.4772x+0.0406。其中：y為吸光度值；x為黃酮含量（mg/mL）。

1.3.6 抗氧化能力的測(cè)定

1.3.6.1 鐵離子還原力的測(cè)定[8] 1mL提取液中加入2.5mLPH6.6濃度為0.2mol/L的磷酸緩沖液（即磷酸二氫鈉-磷酸一氫鈉緩沖液pH6.6）以及2.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的K3Fe（CN）6溶液，于50℃水浴中反應(yīng)20min后迅速冷卻，并加入2.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸（TCA）溶液，以3000r/min離心10min后取上清液2.5mL，并加入2.5mL蒸餾水以及0.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的FeCl3溶液，混合均勻，10min后于700nm處測(cè)定氣吸光度?？瞻捉M以等體積的樣液提取溶劑代替樣液；以抗壞血酸作為陽性對(duì)照。還原力按如下公式計(jì)算：還原力=A-A0。其中，A為混合液的吸光度值；A0為體積的樣液提取溶劑代替樣液所得吸光度值。

1.3.6.2 清除羥基自由基的能力測(cè)定[9] 向試管中加入1.00mL不同濃度的樣液，1mL10mmol/L硫酸亞鐵，1mL10mmol/L水楊酸-乙醇，1mL8.8mmol/L的H2O2，震蕩反應(yīng)，37℃水浴30min，以蒸餾水調(diào)零于510nm處測(cè)定吸光值，以抗壞血酸作為陽性對(duì)照。羥自由基清除率計(jì)算公式為：

[D（%）=A0-（A1-A2）A0×100]

式中：A0為蒸餾水代替樣液作為空白管吸光度，A1為樣品管吸光度，A2為不加顯色劑H2O2樣品溶液的吸光度。

1.3.6.3 清除DPPH自由基的測(cè)定[10] 分別量取不同濃度的提取液2mL及2mL的DPPH溶液（0.2mmol/L，該溶液避光保存溫度為4℃，現(xiàn)用現(xiàn)配，19.7mgDPPH用少量乙醇溶解，再定容至250mL，低溫避光保存，并于3.5h內(nèi)用完）加入同一試管中，搖勻后，在37℃暗處放置30min，分別在517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以抗壞血酸作為陽性對(duì)照。根據(jù)公式計(jì)算其清除率：

[清除（%）=[1-Ai-AjA0]×100]

式中：Ai為加入2mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液后DPPH溶液的吸光度；Aj為加入2mL不同質(zhì)量濃度樣品溶液和2mL乙醇的吸光度；A0為加入乙醇后DPPH溶液的吸光度。

1.3.6.4 ABTS自由基清除法測(cè)定總抗氧化能力[11] 在濃度為7mmol/L的ABTS溶液中加入過硫酸鉀使其終濃度為2.45mmol/L，充分混合均勻，將混合反應(yīng)液在室溫避光的條件下放置12～16h（ABTS反應(yīng)液須新鮮配制，保留的最長(zhǎng)時(shí)間為3d）。在EP管中加入200μL樣品溶液，300μL的ABTS反應(yīng)液，然后加入0.5mL50%甲醇溶液，充分振蕩均勻，反應(yīng)2min后，在745nm處測(cè)定吸光度。以不加樣品為空白對(duì)照，以抗壞血酸作為陽性對(duì)照，對(duì)ABTS自由基的清除率按以下式子來計(jì)算：

[清除率（%）=A0-AsA0×100]

式中：A0為空白樣品吸光度；AS為待測(cè)樣品吸光度。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理與分析 用Microsoft Excel 2010和SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚和黃酮的含量 分別按照1.3.1至1.3.5所述方法，藍(lán)莓嫩莖水、乙醇、甲醇3種提取物的多酚和黃酮含量結(jié)果見表1。由表1可以看出，在相同條件下，水、乙醇和甲醇作為提取劑，從樣品中提取多酚含量乙醇>甲醇>水，提取的黃酮含量也是乙醇>甲醇>水。而在這3種提取液中，黃酮含量都明顯大于多酚含量。

2.2 3種提取液及對(duì)應(yīng)濃度Vc鐵離子還原力比較 使用提取液原液及其稀釋2倍、4倍、8倍、16倍的提取液，其以原料質(zhì)量分?jǐn)?shù)為基礎(chǔ)的樣品濃度分別為20mg/mL、10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL，比較不同提取劑所提取溶液的還原力，結(jié)果見圖1。通過圖1可以看出，在相同濃度下，Vc溶液的鐵離子還原力均高于3種提取液，而在3種提取液中，乙醇提取液的鐵離子還原力高于甲醇提取液，而甲醇提取液的鐵離子還原力高于水提液。另外，這3種提取液及Vc溶液的鐵離子還原力，都隨著濃度的減小而呈下跌趨勢(shì)，而3種提取液還原力的差異也隨著濃度的減小而減小，在樣品濃度為20mg/mL時(shí)有最大差異，其中水提液的還原力為1.06，甲醇提取液的還原力為1.60，乙醇提取液為1.94；在樣品濃度為1.25mg/mL時(shí)的差異最小，水提液、甲醇提取液和乙醇提取液的還原力分別為0.07、0.09、0.11。

2.3 3種提取液及對(duì)應(yīng)濃度Vc清除羥基自由基的能力比較 使用濃度為0.6g/mL的提取液液及其稀釋2倍、4倍、8倍、16倍的提取液，其以原料質(zhì)量分?jǐn)?shù)為基礎(chǔ)的樣品濃度分別為60mg/mL、30mg/mL、15mg/mL、7.5mg/mL、3.75mg/mL。按照1.3.2.2所述方法，比較不同提取劑所提取溶液的羥基清除能力，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，在相同濃度下，Vc溶液的羥基自由基清除能力均高于3種提取液，而在這3種提取液中，乙醇提取液的羥基自由基清除能力強(qiáng)于甲醇提取液和水提溶液，而水提取液在樣品濃度7.5mg/mL及以上時(shí)的羥基自由基清除能力強(qiáng)于甲醇提取液，在樣品濃度為3.75mg/mL時(shí)卻弱于甲醇提取液。另外，3種提取液及Vc溶液的羥基自由基清除能力，都隨著濃度的減小而呈下跌趨勢(shì)，且3種提取液的羥基自由基清除能力差異，也隨著樣品濃度的減小而呈增大趨勢(shì)，在樣品濃度為60mg/mL時(shí)，3種提取液無太大差異，其中水提液的還原力為78.54%，甲醇提取液的還原力為77.32%，乙醇提取液為79.79%；在樣品濃度為3.75mg/mL時(shí)的差異最大，水提液、甲醇提取液和乙醇提取液的還原力分別為21.59%、27.90%、42.85%。由此可以看出，乙醇提取液所含抗氧化物質(zhì)的量相對(duì)最大，且濃度的稀釋，對(duì)其抗氧化性影響相對(duì)最小。

2.4 3種提取液及對(duì)應(yīng)濃度Vc的DPPH自由基清除能力比較 使用提取液原液及其稀釋2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍的提取液，其以原料質(zhì)量分?jǐn)?shù)為基礎(chǔ)的樣品濃度分別為20mg/mL、10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL。按照1.3.2.3所述方法，比較不同提取劑所提取溶液的DPPH清除能力，結(jié)果見圖3。通過圖3可知，在相同濃度下的Vc溶液和這3種提取液中，乙醇提取液的DPPH自由基清除能力強(qiáng)于甲醇提取液、水提溶液和Vc溶液，甲醇提取液強(qiáng)于水提溶液和Vc溶液，而Vc溶液的DPPH自由基清除能力強(qiáng)于水提取液。另外，這3種提取液提取液和Vc溶液的DPPH清除能力，隨著濃度的減小而呈下跌趨勢(shì)。在樣品濃度在5mg/mL以上時(shí)，3種提取液和Vc溶液的DPPH清除能力無明顯差異，且均在90%以上，具有較強(qiáng)的DPPH清除能力；在樣品濃度稀釋到2.5mg/mL時(shí)，水提取液的DPPH清除能力開始明顯下降，而甲醇提取液、乙醇提取液和Vc溶液的DPPH清除能力仍無明顯變化；在樣品濃度稀釋到1.25mg/mL時(shí)，甲醇提取液和Vc溶液的DPPH清除能力開始明顯下降，而乙醇提取液的DPPH清除能力仍無明顯變化；在樣品濃度稀釋到0.625mg/mL時(shí)，乙醇提取液的DPPH清除能力開始明顯下降。由此可以看出，乙醇提取液所含抗氧化物質(zhì)的量相對(duì)最大，且濃度的稀釋，對(duì)其抗氧化性影響相對(duì)最小。

2.5 3種提取液及對(duì)應(yīng)濃度Vc的總抗氧化能力比較 使用提取液原液及其稀釋2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍的提取液，其以原料質(zhì)量分?jǐn)?shù)為基礎(chǔ)的樣品濃度分別為20mg/mL、10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL。按照1.3.2.4所述方法，比較不同提取劑所提取溶液的總抗氧化能力，結(jié)果見圖4。通過圖4可知，在相同濃度下的Vc溶液和這3種提取液中，乙醇提取液的總抗氧化能力強(qiáng)于甲醇提取液、水提溶液和Vc溶液，甲醇提取液則強(qiáng)于水提溶液和Vc溶液，而Vc溶液的總氧化能力強(qiáng)于水提取液。另外，這3種提取液和Vc溶液的總抗氧化能力，均隨著濃度的減小而呈下跌趨勢(shì)。在樣品濃度在5mg/mL以上時(shí)，3種提取液和Vc溶液的總抗氧化能力無明顯差異，且清除率均接近于100%；當(dāng)提取液稀釋到2.5mg/mL時(shí)，水提取液和Vc溶液的清除率開始明顯下降，而甲醇提取液和乙醇提取液的清除率仍無明顯變化；當(dāng)提取液稀釋到1.25mg/mL時(shí)，甲醇提取液的清除率開始明顯下降，而乙醇提取液的清除率仍無明顯變化，保持在接近于100%的清除率。直到提取液稀釋到0.625mg/mL時(shí)，乙醇提取液的清除率才開始明顯下降。由此可以看出，乙醇提取液所含抗氧化物質(zhì)的量相對(duì)最大，且濃度的稀釋，對(duì)其抗氧化性影響相對(duì)最小。

3 結(jié)論

水、乙醇和甲醇分別作為提取劑，在藍(lán)莓葉嫩莖中提取多酚和黃酮的效率具有顯著性差異，在相同條件下，乙醇提取液中所含多酚和黃酮的含量都是最高的，其次是甲醇提取液，水提取液所含多酚和黃酮含量最低。另外，這3種提取液中，黃酮的含量均大于多酚含量。

用抗壞血酸作陽性對(duì)照，通過4個(gè)方面評(píng)價(jià)水、乙醇和甲醇作為提取劑所得提取液的抗氧化能力。在鐵離子還原力和羥基清除能力2個(gè)方面，Vc溶液的表現(xiàn)強(qiáng)于3種提取液；而在DPPH清除能力、總抗氧化能力2個(gè)方面，這3種提取液和Vc溶液的表現(xiàn)順序?yàn)橐掖继崛∫?gt;甲醇提取液>Vc溶液提取液>水提取液。而在3種提取液中，在鐵離子還原力、DPPH清除能力和總抗氧化能力3個(gè)方面，乙醇提取液所表現(xiàn)的抗氧化能力最強(qiáng)，且隨著濃度的稀釋乙醇提取液保持抗氧化性的的能力也是最強(qiáng)的，其次是甲醇提取液，水提取液在這3個(gè)方面的抗氧化能力表現(xiàn)相對(duì)最差。而在羥基清除能力上，乙醇提取液所表現(xiàn)的抗氧化能力仍然是最強(qiáng)的，且濃度的稀釋對(duì)其影響最低，在實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的濃度梯度中，除了最低濃度，水提取液的羥基清除能力強(qiáng)于甲醇提取液。

根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得知，乙醇是最適合作為提取藍(lán)莓葉嫩莖抗氧化物質(zhì)的提取劑，其所得提取液保留了相對(duì)最大化的抗氧化能力，且其提取液隨著濃度的稀釋，抗氧化能力的保持能力最強(qiáng)。乙醇作為提取劑，具有開發(fā)天然抗氧化產(chǎn)品的價(jià)值。

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