趙 娜,羅孟亞男
肺癌是惡性腫瘤中發(fā)病率和死亡率最高的癌癥之一[1],全世界每年新增的肺癌病例大約120萬,嚴(yán)重威脅著人類的身體健康和生命安全。目前臨床上常用的治療肺癌的方法有化學(xué)治療、放射治療和外科手術(shù)治療,化療和放療在殺死癌細(xì)胞的同時(shí),也會(huì)殺死對(duì)機(jī)體有益的細(xì)胞,不良反應(yīng)較多,包括放射性食管炎和放射性肺炎[2];手術(shù)治療主要適用于肺癌早期患者,而且肺癌根治術(shù)后2年內(nèi)復(fù)發(fā)率在80%左右,遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率高于局部復(fù)發(fā)率[3]。因此,采用安全有效的藥物治療肺癌成為研究的熱點(diǎn)問題,植物來源的藥物已經(jīng)普遍應(yīng)用于癌癥治療中,而紫杉醇是目前最有前景的植物抗癌藥物,與其他抗癌藥物相比具有抗癌范圍廣、藥物效應(yīng)強(qiáng)的特點(diǎn)。本試驗(yàn)旨在研究紫杉醇在肺癌治療中的優(yōu)勢和療效。
1.1 材料
1.1.1 細(xì)胞株 具有高自發(fā)肺轉(zhuǎn)移潛能的Lewis肺癌瘤株,移植100%,來源:國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)(China Infrastructure of Cell Line Resource)。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6近交系小鼠,7~8周齡,體重23~25 g,雌雄各半,購自第一軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心(合格證號(hào):P7A03)。
1.1.3 主要試劑與儀器 恩度(15 mg/支,國藥準(zhǔn)字S20050088,山東先聲麥得津生物制藥有限公司);紫杉醇(30 mg/支,國藥準(zhǔn)字H20053837,安徽大東方藥業(yè)有限責(zé)任公司);DAB顯色試劑盒均購自北京中杉公司;免疫組化試劑盒購于福州邁新公司;小鼠缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)和碳酸酐酶Ⅸ(CA Ⅸ)ELISA試劑盒購自英國Abcam科技有限公司;電子天平購自美國Thermo Fisher Scientific公司;光學(xué)顯微鏡和顯微攝像儀購自日本Olympus公司;3K15超低溫離心機(jī)購自德國Sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 C57BL/6小鼠肺癌造模 將購買的小鼠Lewis肺癌細(xì)胞解凍、復(fù)蘇,取0.2 ml貼壁生長的對(duì)數(shù)期(細(xì)胞數(shù)為1×107/ml)的Lewis肺癌細(xì)胞接種于C57BL/6小鼠右腋下,接種后第21天,選取精神和食欲良好的小鼠進(jìn)行脫頸椎處死,取出生長良好的無破潰的腫瘤組織進(jìn)行體內(nèi)傳代:取完整的瘤組織,去除包膜后,選取魚肉狀組織制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為1×107/ml,將癌細(xì)胞懸液分別接種于5組小鼠右腋下,0.2 ml/只。
1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將300只C57BL/6肺癌小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法平均分成5組,每組60只,雌雄各半,分別命名為空白對(duì)照組、正常對(duì)照組、紫杉醇低劑量組、紫杉醇中劑量組和紫杉醇高劑量組,正常對(duì)照組注射7.5 mg/m2恩度進(jìn)行治療,空白對(duì)照組注射等量容積生理鹽水,紫杉醇低劑量組、紫杉醇中劑量組和紫杉醇高劑量組在正常對(duì)照組的基礎(chǔ)上分別注射30、100、170 mg/m2紫杉醇進(jìn)行治療。治療時(shí)間為4周。
1.2.3 觀察指標(biāo) ①肺癌細(xì)胞移植前記錄5組小鼠的體重;②測量治療過程中小鼠腫瘤的生長情況:給藥第4、10、16、22、28天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的最大徑(a)及最小徑(b),計(jì)算腫瘤的體積(V),V=ab2/2,繪制腫瘤生長曲線;③記錄5組小鼠的瘤重及抑瘤率:持續(xù)治療4周后將小鼠脫頸椎處死,將腫瘤組織剝離出來,記錄腫瘤組織的重量及抑瘤率,抑瘤率(%)=[對(duì)照組平均瘤重(g)-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重(g)]/對(duì)照組平均瘤重(g)×100%。
1.2.4 免疫組化檢測CA Ⅸ、HIF-1α的表達(dá)水平及結(jié)果判定 持續(xù)治療4周后,選取生長良好的腫瘤組織制作石蠟切片(厚度不超過5 mm),將組織切片在92~98 ℃條件下存放20 min進(jìn)行抗原修復(fù),滴加正常山羊血清用來中和非特異性反應(yīng)后,在組織玻片上分別滴加CA Ⅸ和HIF-1α一抗,于4 ℃過夜放置,復(fù)溫后在組織玻片上滴加二抗。使用DAB顯色試劑進(jìn)行底物顯色,當(dāng)呈現(xiàn)金黃色時(shí)終止顯色反應(yīng),使用蘇木素進(jìn)行復(fù)染后,用奧林帕斯CCD攝像機(jī)隨機(jī)采集5個(gè)視野(400×)的圖片,觀察CA Ⅸ和HIF-1α蛋白在癌細(xì)胞胞核和(或)胞質(zhì)的表達(dá)情況。
1.2.5 ELISA檢測CA Ⅸ、HIF-1α的表達(dá)水平 持續(xù)治療4周后,各組分別取5只小鼠眼眶靜脈血,采用CA Ⅸ、HIF-1α ELISA試劑盒檢測移植瘤小鼠血清中CA Ⅸ、HIF-1α的表達(dá)水平。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。
2.1 五組小鼠體重比較 治療前,五組小鼠的體重相近,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。
2.2 五組小鼠移植瘤體積的變化情況 從治療后第10天開始,其他各組的腫瘤體積小于空白對(duì)照組(P<0.05),紫杉醇組的腫瘤體積小于正常對(duì)照組(P<0.05),紫杉醇中劑量和紫杉醇高劑量組的腫瘤體積小于紫杉醇低劑量組(P<0.05),紫杉醇高劑量組的腫瘤體積小于紫杉醇中劑量組(P<0.05)。結(jié)果見圖1、表2。
表1 五組小鼠體重的比較
圖1 五組小鼠移植瘤體積的變化情況
注:與空白對(duì)照組比較,*P<0.05;與正常對(duì)照組比較,#P<0.05;與紫杉醇低劑量組比較,@P<0.05;與紫杉醇中劑量組比較,&P<0.05
2.3 五組小鼠瘤重及抑瘤率的比較 持續(xù)治療4周后,其他各組的瘤重低于空白對(duì)照組(P<0.05),紫杉醇組的瘤重低于正常對(duì)照組(P<0.05),紫杉醇中劑量組和紫杉醇高劑量組的瘤重低于紫杉醇低劑量組(P<0.05),紫杉醇高劑量組的瘤重低于紫杉醇中劑量組(P<0.05)。
紫杉醇組的抑瘤率高于正常對(duì)照組,且隨著紫杉醇劑量增加,對(duì)腫瘤生長的抑制明顯增加。見表3。
2.4 五組小鼠肺癌組織中CA Ⅸ、HIF-1α表達(dá)情況比較 持續(xù)治療4周后,五組小鼠肺癌組織中CA Ⅸ、HIF-1α表達(dá)情況如圖2、圖3所示,與空白對(duì)照組和正常對(duì)照組比較,紫杉醇低劑量組、紫杉
醇中劑量組和紫杉醇高劑量組小鼠肺癌組織中CA Ⅸ、HIF-1α表達(dá)水平明顯降低。
2.5 ELISA檢測五組小鼠血清中CA Ⅸ、HIF-1α表達(dá)情況 持續(xù)治療4周后,其他各組小鼠血清中CA Ⅸ和HIF-1α的表達(dá)水平顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05);紫杉醇治療組小鼠血清中CA Ⅸ和HIF-1α的表達(dá)水平顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05);紫杉醇中劑量組和紫杉醇高劑量組小鼠血清中CA Ⅸ和HIF-1α表達(dá)水平顯著低于紫杉醇低劑量組(P<0.05),紫杉醇高劑量組小鼠血清中CA Ⅸ和HIF-1α表達(dá)水平顯著高于紫杉醇中劑量組(P<0.05)。見表4。
恩度是一種血管內(nèi)皮抑制素,能通過抑制腫瘤新生血管的生成達(dá)到抑制腫瘤的目的,雖然恩度在大多數(shù)癌癥的治療中取得了一定效果,但其可導(dǎo)致相關(guān)毒副作用,如心血管毒性、肌肉關(guān)節(jié)疼痛、胃腸反應(yīng)、肝臟毒性及皮膚過敏反應(yīng)等。從臨床用藥情況來看,植物抗癌藥物已普遍應(yīng)用于癌癥治療中,其中應(yīng)用最廣泛的植物抗癌藥物是天然植物堿[4]。
紫杉醇(Paclitaxel,商品名:Taxol)是從紅豆杉屬植物中提取的一種天然的植物堿,其有效成分是紫杉烷類二萜化合物,是近年來備受關(guān)注的抗癌藥物之一。紫杉醇在低濃度下(0.25 μm)即催化微管蛋白的迅速合成,這些微管使細(xì)胞分裂停止于有絲分裂期的G2和M期,阻斷了細(xì)胞的正常分裂,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[5-6]。紫杉醇在臨床癌癥治療上取得了顯著效果,申維喜等[7]研究表明,體外環(huán)境下紫杉醇可誘導(dǎo)Her-2過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞凋亡,且呈劑量依賴關(guān)系。婁源杰等[8-9]采用恩度聯(lián)合紫杉醇治療非小細(xì)胞肺癌,結(jié)果表明,恩度聯(lián)合紫杉醇能有效抑制腫瘤的生長、療效較好;周風(fēng)舉等[10]研究表明,紫杉醇聯(lián)合氟尿嘧啶類化療藥對(duì)腹膜轉(zhuǎn)移胃癌有顯著療效;林錦源等[11]研究表明,紫杉醇單藥治療胃癌的有效率約為20%。本研究結(jié)果表明,紫杉醇組的腫瘤體積顯著小于空白對(duì)照組和正常對(duì)照組,且呈劑量依賴型;持續(xù)治療4周后,紫杉醇組的瘤重顯著小于空白對(duì)照組和正常對(duì)照組,紫杉醇組的抑瘤率明顯高于空白對(duì)照組和正常對(duì)照組,且隨著紫杉醇劑量增加,抑瘤率明顯升高。結(jié)果表明,紫杉醇能有效抑制腫瘤細(xì)胞生長。
表2 五組小鼠移植瘤體積的變化情況(mm3)
注:與空白對(duì)照組比較,*P<0.05;與正常對(duì)照組比較,#P<0.05;與紫杉醇低劑量組比較,@P<0.05;與紫杉醇中劑量組比較,&P<0.05
表3 五組小鼠瘤重、抑瘤率比較
注:與空白對(duì)照組比較,*P<0.05;與正常對(duì)照組比較,#P<0.05;與紫杉醇低劑量組比較,@P<0.05;與紫杉醇中劑量組比較,&P<0.05
表4 五組小鼠血清中CA Ⅸ、HIF-1α 的表達(dá)水平(pg/ml)
注:與空白對(duì)照組比較,*P<0.05;與正常對(duì)照組比較,#P<0.05;與紫杉醇低劑量組比較,@P<0.05;與紫杉醇中劑量組比較,&P<0.05
圖2 五組小鼠肺癌組織中CA Ⅸ的表達(dá)情況(400×)
圖3 五組小鼠肺癌組織中HIF-1α的表達(dá)情況(200×)
HIF-1α最先由Semenza等[12]發(fā)現(xiàn),與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及患者存活有關(guān)[13-14]。研究表明,HIF-1α能夠調(diào)控一系列基因表達(dá)介導(dǎo)組織細(xì)胞對(duì)缺氧的適應(yīng)性,從而維持腫瘤細(xì)胞的能量代謝、新生血管生成,促進(jìn)增殖及轉(zhuǎn)移,同時(shí)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的耐受性[15]。目前,研究者已在多種惡性腫瘤中檢測到HIF-1α蛋白的過度表達(dá),如卵巢癌[15]、腎細(xì)胞癌[16]、前列腺癌[17]等。CA Ⅸ位于VLH腫瘤抑制基因的下游,由HIF-1α途徑激活[17],在正常人體組織中表達(dá)較低,但在許多腫瘤如腎細(xì)胞癌[16]、前列腺癌[17]和肺癌中表達(dá)明顯增強(qiáng),與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[18]。
本研究結(jié)果表明,紫杉醇組小鼠組織和血清中CA Ⅸ和HIF-1α的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組;且隨著紫杉醇劑量增加,CA Ⅸ和HIF-1α的表達(dá)水平顯著降低。結(jié)果表明,紫杉醇能夠有效降低腫瘤細(xì)胞中CA Ⅸ和HIF-1α 的表達(dá)水平,推測紫杉醇是通過抑制腫瘤細(xì)胞生長來調(diào)控CA Ⅸ和HIF-1α 表達(dá)。
綜上所述,恩度聯(lián)合紫杉醇治療C57BL/6小鼠肺癌能顯著控制腫瘤的生長,降低CA Ⅸ和HIF-1α的表達(dá)水平,為肺癌的臨床治療提供一定的參考依據(jù)。
參考文獻(xiàn):
[1] Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.
[2] De Groot P,Munden RF.Lung cancer epidemiology,risk factors,and prevention[J].Radiol Clin North Am,2012,50(5):863-876.
[3] WHO.Tobacco or health:a global status report[M].Geneva:WHO,1997.
[4] 李光,劉洪霞,劉軍.不同化療方案治療復(fù)合性小細(xì)胞肺癌的效果和安全性比較[J].中國醫(yī)藥,2017,12(1):50-54.
[5] Park JE,Woo SR,Kang CM,et al.Paclitaxel stimulates chromosomal fusion and instability in cells with dysfunctional telomeres:implication in multinucleation and chemosensitization[J].Biochem Biophys Res Commun,2011,404(2):615-621.
[6] Demidenko ZN,Kalurupalle S,Hanko C,et al.Mechanism of G1-like arrest by low concentrations of paclitaxel:next cell cycle p53-dependent arrest with sub G1 DNA content mediated by prolonged mitosis[J].Oncogene,2008,27(32):4402-4410.
[7] 申維喜,趙妍,閆玉,等.恩度聯(lián)合紫杉醇對(duì)Her-2過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡研究[J].腫瘤學(xué)雜志,2012,8(11):844-847.
[8] 婁源杰,王同生,毛毅敏,等.恩度聯(lián)合紫杉醇和卡鉑靶向治療晚期非小細(xì)胞肺癌效果觀察[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生,2010,48(23):39-40.
[9] 劉晶,靳彩玲,牛紅蕊,等.恩度聯(lián)合周劑量多西紫杉醇治療老年性非小細(xì)胞肺癌的臨床觀察[J].醫(yī)學(xué)信息:內(nèi)·外科版,2009,22(6):506-508.
[10]周風(fēng)舉,彭曄,王寧,等.伊立替康聯(lián)合卡培他濱一線治療進(jìn)展期胃癌臨床觀察[J].中華腫瘤防治雜志,2011,18(9):710-712.
[11]林錦源,郭增清,王曉杰,等.紫杉醇在進(jìn)展期胃癌中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥指南,2011,9(35):5-8.
[12]Semenza GL,Wang GL.A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation[J].Mol Cell Biol,1992,12(12):5447-5454.
[13]Bos R,Van der Groep P,Greijer AE,et al.Levels of hypoxia-inducible factor-1alpha independently predict prognosis in patients with lymph node negative breast carcinoma[J].Cancer,2003,97(6):1573-1581.
[14]Kuwai T,Kitadai Y,Tanaka S,et al.Expression of hypoxia-inducible factor-1alpha is associated with tumor vascularization in human colorectal carcinoma[J].Int J Cancer,2003,105(2):176-181.
[15]王蘊(yùn).HIF-1α、MRP和P-gp在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及其臨床意義[D].山東大學(xué),2008.
[16]彭啟宇,溫儒民,薛松.HIF-1α與CAⅨ在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義[J].徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,28(4):229-231.
[17]黃海,盧振權(quán),杜濤,等.碳酸酐酶IX(CA-IX)與HIF-1α在前列腺癌中的表達(dá)情況及相關(guān)性研究[J].中華腔鏡泌尿外科雜志:電子版,2012,6(5):60-63.
[18]Oosterwijk E.Carbonic anhydrase IX:historical and future perspectives[J].BJU Int,2008,101 Suppl 4:2-7.