低毒性金葡萄球菌腸毒素A D227A突變體的原核表達(dá)、純化及鑒定①

劉雪婷 曾麗萍 謝 洋 張建國(guó) 鄒澤紅 陶愛(ài)林

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣東省過(guò)敏反應(yīng)與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510260)

金黃色葡萄球菌腸毒素A(Staphylococcal Enterotoxins A，SEA)的研制是國(guó)內(nèi)外抗腫瘤新藥研究的熱點(diǎn)之一。SEA是一種細(xì)菌超抗原，在極低劑量時(shí)(以ng計(jì))即可直接與抗原提呈細(xì)胞APC的MHC-Ⅱ類(lèi)分子和T細(xì)胞抗原識(shí)別受體(TCR)Vβ片段高親和力地結(jié)合，刺激T細(xì)胞增殖并釋放TNF-α、TNF-β、IFN-γ、IL-2、IL-6和IL-12等多種細(xì)胞因子[1-3]。實(shí)驗(yàn)證明，TNF-α、TNF-β和IFN-γ具有明顯的抗腫瘤作用；TNF-α和TNF-β 還有顯著的抗腫瘤協(xié)同效應(yīng)，而IFN-γ 和 TNF 有利促進(jìn)腫瘤細(xì)胞表達(dá)MHCⅡ類(lèi)分子及黏附分子，有利于細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合，增強(qiáng)腫瘤刺激宿主免疫系統(tǒng)的能力[4,5]。

然而，SEA除了有效發(fā)揮激活T細(xì)胞而參與殺傷MHCⅡ陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞的積極作用，卻也是世界范圍內(nèi)人類(lèi)最常見(jiàn)的細(xì)菌毒素，可引起食物中毒和中毒性休克綜合征[4-6]。食物中毒的主要癥狀是攝取受污染食物后1～4 h內(nèi)發(fā)生的惡心、嘔吐、腹部痙攣和腹瀉，甚至導(dǎo)致危及生命的中毒性休克綜合征[4-6]。SEA的這些“毒性作用”，被認(rèn)為是限制SEA在臨床上進(jìn)一步推廣應(yīng)用的原因[4-6]。研究表明，精氨酸替代第225(H)或者227(D)位氨基酸后，SEA與MHCⅡ的親和力將降低1 000倍[7]，消除了原來(lái)SEA誘導(dǎo)的嘔吐，但仍保留其免疫活性[7-9]。本研究通過(guò)PCR技術(shù)克隆SEAD227A基因，建立原核表達(dá)系統(tǒng)，重組表達(dá)了SEAD227A蛋白，為SEA的毒性弱化及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑 DNA序列合成、測(cè)序以及引物合成均由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司完成；T4 DNA連接酶、PrimeSTAR HS超保真DNA聚合酶、NdeⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa；克隆宿主大腸桿菌JM109、表達(dá)宿主大腸桿菌Rosetta BlueTM由本實(shí)驗(yàn)室保存；蛋白預(yù)染Marker、顯色液Pierce ECL Western blot Substrate購(gòu)于Thermo公司；StrepⅡ親和填料購(gòu)于GE公司;StrepⅡ單克隆抗體購(gòu)于Merck公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1金葡菌基因組DNA的提取 配制細(xì)菌裂解液：20 mmol/L Tris-HCl，pH8.0，2 mmol/L sodium EDTA，1.2% Triton X-100，20 g/L溶菌酶(使用前加入)。挑取待測(cè)菌株單個(gè)菌落接種于5 ml的LB培養(yǎng)基中，于37℃搖床振蕩過(guò)夜。在1.5 ml的離心管中加入1 ml細(xì)菌的過(guò)夜培養(yǎng)物，13 000～16 000 g(離心半徑為8 cm)離心1 min沉淀菌細(xì)胞，去上清(最大細(xì)胞數(shù)<2×109)。參照Qiagen DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取。

1.2.2PCR擴(kuò)增SEA成熟肽基因 以金葡菌基因組DNA為模板，PCR獲得SEA基因片段。引物序列為F1，5′-AGCGAGAAAAGCGAAGAAAT-3′及R1 5′-ACTTGTATATAAATATATAT-3′。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性 94℃ 5 min，變性 94℃ 30 s，退火 60℃ 30 s，延伸 72℃ 60 s，32個(gè)循環(huán)，延伸72℃ 5 min，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為702 bp。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.2.4pET44a-SEAD227A載體的構(gòu)建及鑒定 限制性核酸內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ對(duì)PCR產(chǎn)物(SEAD227A)及質(zhì)粒pET44a進(jìn)行雙酶切后，在T4 DNA連接酶作用下16℃連接過(guò)夜。用氯化鈣法制備感受態(tài)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，將轉(zhuǎn)化的菌液涂布于含氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)12 h，進(jìn)行菌落PCR鑒定，并挑取陽(yáng)性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后小量提取質(zhì)粒，進(jìn)行NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測(cè)序。使用在線BLAST軟件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi)將結(jié)果與SEA基因進(jìn)行比對(duì)。

1.2.5SEAD227A基因在大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定 重組質(zhì)粒pET44a-SEAD227A轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株Rosetta，37℃，LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增。當(dāng)濃度達(dá)到0.6(600 nm)時(shí)，加入1 mmol/L IPTG 37℃誘導(dǎo)6 h。4℃，4 300 g離心30 min，收集菌體。SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)結(jié)果，并通過(guò)Western blot鑒定目的蛋白。

1.2.6包涵體的清洗 擴(kuò)大培養(yǎng)表達(dá)菌，用破碎緩沖液(25 mmol/L Phosphate Buffer,150 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA，10%甘油,pH7.5)懸浮菌體，超聲波破碎菌體后4 300 g離心30 min，收集包涵體。用清洗液(50 mmol/L Tris,2%TritonX-100,1 mmol/L EDTA,pH7.5)清洗包涵體2次。SDS-PAGE電泳分析目的蛋白在包涵體及破碎上清的表達(dá)情況及包涵體的清洗效果。

1.2.7包涵體的復(fù)性 包涵體溶于變性溶液(6 mol/L 鹽酸胍,10 mmol/L DTT,100 mmol/L Tris,2 mmol/L EDTA,pH8.0)中，包涵體濃度為0.5 mg/ml。通過(guò)梯度透析法對(duì)變性的包涵體進(jìn)行復(fù)性。在4℃下，依次用含4、2及1 mol/L尿素的復(fù)性液(150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L 半胱氨酸，3 mmol/L GSSG，3 mmol/L GSH，0.2%L-精氨酸和10%甘油;pH8.0)各透析1次，再用不含尿素的復(fù)性液透析3次，每次8～12 h取透析后液體，4℃ 15 000 g離心，20 min取上清。

1.2.8重組SEAD227A蛋白的純化 復(fù)性后的rSEAD227A蛋白透析于平衡液(150 mmol/L NaCl,50 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA;pH8.0)，并通過(guò)AKTA avant 25蛋白純化儀和StrepⅡ親和層析進(jìn)行純化。結(jié)合在StrepⅡ親和填料上的目的蛋白用洗脫緩沖液(NaCl 150 mmol/L、EDTA 1 mmol/L、Tris-HCl 10 mmol/L、脫硫生物素2.5 mmol/L，pH8.0)進(jìn)行洗脫。純化后的rSEAD227A蛋白SDS-PAGE電泳分析目的蛋白的純化效果。

1.2.9高效液相色譜-二級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(LC-MS/MS)鑒定重組SEAD227A蛋白 純化后的重組SEAD227A蛋白經(jīng)胰蛋白酶消化后，肽段用樣品溶解液(0.1%甲酸、2%乙腈)溶解，充分振蕩渦旋，4℃，10 000 g 離心10 min，上清轉(zhuǎn)移到上樣管中，高效液相色譜-二級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(LC-MS/MS)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。色譜柱為75 μm×150 mm，C18,3 μm，液相參數(shù)為流動(dòng)相A：0.1%甲酸，流動(dòng)相B：0.1%甲酸，80%ACN，流速：300 nl/min，分析時(shí)間：40 min，有效梯度：B相從5%上升至90%。分離后的肽段直接進(jìn)入質(zhì)譜儀Thermo Scientific Q Exactive進(jìn)行在線檢測(cè)。一級(jí)質(zhì)譜分辨率70 000，掃描范圍350～1 800 m/z，二級(jí)質(zhì)譜分辨率17 500。質(zhì)譜原始文件經(jīng)過(guò)MM File Conversion軟件處理轉(zhuǎn)換，得到MGF格式文件，然后用MASCOT檢索uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)。分析肽段與數(shù)據(jù)庫(kù)SEA蛋白的匹配情況。

2 結(jié)果

2.1SEAD227A基因的克隆 以金葡菌提取的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到SEA基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)在702 bp處有明顯的擴(kuò)增條帶，大小與理論值702 bp相符(圖1B)。以SEA模板，通過(guò)引物設(shè)計(jì)引入突變位點(diǎn)、NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)和StrepⅡ純化標(biāo)簽對(duì)應(yīng)的堿基，PCR擴(kuò)增得到含有D227A突變的SEA基因片段，大小與理論值751 bp相符(圖1C)。

2.2pET44a-SEAD227A質(zhì)粒的構(gòu)建 限制性核酸內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ對(duì)PCR產(chǎn)物(SEAD227A)及質(zhì)粒pET44a進(jìn)行雙酶切后，在T4 DNA連接酶連接后的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。通過(guò)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切法和PCR法對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定(圖2B、C)，測(cè)序結(jié)果顯示，第679～681位堿基由GAT(對(duì)應(yīng)氨基酸序列為天冬氨酸)突變?yōu)镚CG(丙氨酸)，其余序列與SEA序列一致，pET44a-SEAD227A重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3重組SEAD227A在大腸桿菌Rosetta的誘導(dǎo)表達(dá) 重組質(zhì)粒pET44a-SEAD227A轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株Rosetta。37℃，1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h后，SDS-PAGE電泳顯示rSEAD227A大小與理論值31 kD相符，用 Quantity one 軟件對(duì) SDS-PAGE 電泳結(jié)果圖進(jìn)行灰度估算，rSEAD227A表達(dá)量占菌體蛋白的50%以上，提示rSEAD227A在大腸桿菌中高效表達(dá)(圖3，泳道2和4)。

2.4重組SEAD227A包涵體的清洗與復(fù)性 菌體破碎后，rSEAD227A以包涵體形式存在于沉淀中(圖4，泳道1)。用清洗液洗滌兩次后包涵體純度達(dá)80%以上(圖4，泳道4)。包涵體透析復(fù)性后，純度達(dá)90%以上(圖5)。

2.5重組SEAD227A蛋白的純化 用StrepⅡ親和層析純化復(fù)性后的SEAD227A蛋白，SDS-PAGE電泳分析顯示只有單一條帶，純化效果良好，純度大于95%(圖6)。

圖1 SEAD227A基因的克隆Fig.1 Cloning of SEAD227A geneNote: A.Schematic presentation of PCR for SEAD227A.SEAD227A mutation was inserted to the C-terminal of SEA and tagged with Strep-tag Ⅱ at the C-terminal.B-C.PCR amplified products of SEA gene(B) and SEAD227A(C) respectively.Each gel image the DNA ladder was indicated on the left side,arrows indicated the PCR products and their expected sizes were labeled below as well.

圖2 PCR和雙酶切法鑒定pET44a-SEAD227A質(zhì)粒Fig.2 Identification of pET44a-SEAD227A plasmid by PCR and double restriction enzyme digestion assaysNote: A.Map of recombinant expression plasmid pET44a-SEAD227A；B.Identification of the pET44a-SEAD227A by PCR assay.1-3.Agarose gel electrophoresis of PCR products of different clones after using primers for PCR detection；C.Identification of the pET44a-SEAD227A by restrictive enzyme digestion assay with NdeⅠ and XhoⅠ.1-3.Agarose gel electrophoresis of products of different clones after restrictive enzyme digestion.

2.6免疫印跡鑒定純化后的rSEAD227A免疫印跡結(jié)果表明親和層析純化后的rSEAD227A可以被StrepⅡ單克隆抗體特異性識(shí)別(圖7)。

2.7LC-MS/MS鑒定重組SEAD227A蛋白 LC-MS/MS分析證實(shí)，胰酶消化后的rSEAD227A肽段與數(shù)據(jù)庫(kù)的SEA的序列(NCBI登陸號(hào)AAA26681)匹配率為77.4%。圖8為其中三條代表性肽段的二級(jí)質(zhì)譜峰圖。

圖3 SDS-PAGE分析rSEAD227A的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.3 Analysis of expression of rSEAD227A by SDS-PAGENote: SDS-PAGE analysis of inducible expression of rSEAD227A.1，2.Lysates of E.coli cells harboring rSEAD227A before(1,3) and after(2,4) IPTG induction.M.Low-molecular-weight standard.

圖4 SDS-PAGE 分析rSEAD227A包涵體表達(dá)情況及包涵體的清洗Fig.4 SDS-PAGE analysis showed expression of rSEAD227A inclusion bodies before and after two washes with wash bufferNote: M.Low-molecular-weight standard;1.Lysates of E.coli cells harboring rSEAD227A after IPTG induction；2.Pellet after cell lysis(inclusion bodies);3.supernatant after washing of inclusion bodies;4.Inclusion bodies after washing step.

圖5 SDS-PAGE分析復(fù)性后的rSEAD227A包涵體Fig.5 SDS-PAGE analysis of refolded rSEAD227A inclusion bodies

圖6 SDS-PAGE分析純化后的rSEAD227A蛋白Fig.6 SDS-PAGE analysis of purified rSEAD227A protein by Strep-T actin affinity chromatography

圖7 免疫印跡分析純化后的rSEAD227AFig.7 Immunoblot analysis of purified rSEAD227A

圖8 LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定胰酶消化后的rSEAD227A蛋白Fig.8 Identification of tryptic digested rSEAD227A peptide sequences by LC-MS/MS mass spectrometryNote: A.Full-scan ion evaporation mass spectra of representative peptide fragment derived from the tryptic digests of rSEAD227A；B.Amino acid sequence coverage of representative peptide fragment matched with the known SEA sequences.

3 討論

在多數(shù)臨床試驗(yàn)中，SEA具有非常大的毒副作用，可引起發(fā)熱、惡心、嘔吐及肝臟和心臟毒性，限制了其臨床應(yīng)用。針對(duì)SEA中與MHCⅡ類(lèi)分子的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，可大大降低它在表達(dá)MHCⅡ類(lèi)分子組織的滯留和系統(tǒng)毒性。已有研究報(bào)道建立了C215 Fab-SEA/D227A(SEA蛋白的第227位氨基酸由天冬氨酸D突變成丙氨酸A)，該突變可以降低SEA對(duì)MHCⅡ抗原的結(jié)合力，使SEA與MHCⅡ抗原的結(jié)合力降低1 000倍，從而降低T細(xì)胞對(duì)機(jī)體正常組織中的MHCⅡ+抗原細(xì)胞殺傷能力，降低毒副作用，同時(shí)該突變?nèi)跃哂酗@著的抗腫瘤效應(yīng)[7,8]。越來(lái)越多的研究證實(shí)，D227A突變確實(shí)可以一定程度地降低SEA與MHCⅡ結(jié)合能力，使SEA毒性減弱[10-14]；由SEAD227A和其他腫瘤靶向分子，如由人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)等組成融合蛋白可極為有效地抑制動(dòng)物實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)，因此可能成為各種癌癥的潛在治療藥物[10-14]。

已有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)使用突變的SEAD227A或者由其組成融合蛋白治療效果的良好評(píng)價(jià)[10-14]，為進(jìn)一步利用本研究獲得的高純度rSEAD227A蛋白去進(jìn)行深入的生物活性、細(xì)胞及動(dòng)物學(xué)研究提供了信心。由于SEA的表達(dá)在侵襲性金黃色葡萄球菌菌株和食物中毒菌株中較常見(jiàn)[4-6]，因此低毒性但仍保留其免疫活性、高純度的rSEAD227A及其抗體可用于控制葡萄球菌食物中毒和食源性疾病的治療嘗試。

本研究以金葡菌基因組DNA為模板，以SEA編碼基因特異區(qū)段為引物，采用PCR擴(kuò)增SEA成熟肽編碼基因，再通過(guò)PCR方法引入D227A突變，成功克隆SEAD227A基因。SEAD227A克隆到pET-44a載體后，經(jīng)菌落PCR及酶切鑒定篩選出陽(yáng)性克隆后再進(jìn)行DNA測(cè)序及比對(duì)分析，第679～681位堿基由GAT(對(duì)應(yīng)氨基酸序列為天冬氨酸)突變?yōu)镚CG(丙氨酸)，其余序列與SEA序列一致性達(dá)100%。已有研究報(bào)道將重組金黃色葡萄球菌腸毒素A突變體D227A在大腸桿菌BL21DE3表達(dá)，利用組氨酸標(biāo)簽和鎳離子親和層析系統(tǒng)進(jìn)行純化，采用HPLC檢測(cè)其純度[15]。鑒于SEAD227A基因結(jié)構(gòu)含有較多稀有密碼子，較之同類(lèi)研究使用的BL21表達(dá)菌株[15]，我們選擇大腸桿菌表達(dá)菌株Rosetta為宿主表達(dá)菌。Rosetta菌株來(lái)源于BL21宿主菌，該菌株含有原本在大腸桿菌中的稀有密碼子(AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA)，更有利于SEAD227A的高效表達(dá)[16]。包涵體經(jīng)鹽酸胍變性后，依據(jù)影響包涵體蛋白正確復(fù)性的各種因素，使用利于蛋白復(fù)性的緩沖液系統(tǒng)(添加氧化還原對(duì)GSH/GSSG、精氨酸、半胱氨酸、適合的鹽濃度和甘油)，梯度透析使蛋白復(fù)性，經(jīng)StrepⅡ親和層析純化后獲得了高純度的目的蛋白純度。采用高效液相色譜-二級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(LC-MS/MS)進(jìn)行蛋白序列鑒定，鑒定結(jié)果顯示胰酶消化后的rSEAD227A肽段與數(shù)據(jù)庫(kù)的SEA的序列(NCBI登陸號(hào)AAA26681)匹配率為77.4%，較之同類(lèi)研究的HPLC鑒定結(jié)果更為精準(zhǔn)地解析重組蛋白[15]。精氨酸替代第225(H)或者227(D)位氨基酸后，為研發(fā)rSEAD227A和其他腫瘤靶向分子組成的腫瘤抑制劑奠定了基礎(chǔ)，可能成為我們擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的靶向抗癌新藥。

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