吡格列酮對新生大鼠成骨細胞p38和ERK1/2信號通路的影響

劉永立，程富禮，景小博，王來喜

0 引言

骨質(zhì)疏松癥是常見的人代謝骨疾病，其特征在于進行性和年齡依賴性骨丟失和骨折風險增加。近年來，因藥物引起的骨質(zhì)疏松癥得到廣泛關(guān)注。噻唑烷二酮類(TZDs，曲格列酮、羅格列酮和吡格列酮)是PPARγ的人工合成配體，是用于治療糖尿病的胰島素敏化化合物。已有研究表明，TZDs在骨代謝過程中發(fā)揮重要作用。臨床研究表明，曲格列酮治療能夠降低2型糖尿病患者的骨轉(zhuǎn)換率[1]。A糖尿病結(jié)局進行試驗(ADOPT)表明，羅格列酮增加了2型糖尿病絕經(jīng)后婦女骨折的風險[2]。另外，已有研究表明了TZDs對骨生物標志物的影響。Gray等[3]發(fā)現(xiàn)，吡格列酮治療能夠降低堿性磷酸酶(ALP)的活性。Berberoglu等[4]發(fā)現(xiàn)，羅格列酮治療降低了ALP和骨鈣素的生成。這些研究表明，TZDs對骨骼存在不利作用，存在引起骨質(zhì)疏松的風險。然而，吡格列酮對骨代謝的影響及相關(guān)機制尚不完全清楚。本研究通過體外分離培養(yǎng)新生大鼠顱骨成骨細胞，探究吡格列酮對成骨細胞增殖、凋亡和分化的影響，并初步探討其可能的機制，以期對TZDs的臨床用藥提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料 新生24 h內(nèi)SD大鼠幼仔(北京生命科學研究所，許可證號：SYXK2015-0003)，均為SPF級動物，雌雄及體重不限。吡格列酮購自上海邁瑞爾化學技術(shù)有限公司(純度99%，CAS號：112529-15-4)；3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)、4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、蛋白酶抑制劑混合物購自美國Calbiochem公司；ALP比色測定試劑盒購自賽奧生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青霉素/鏈霉素購自美國GIBCO公司；抗Bcl-2、Bax、磷酸化(p-)p38、p-細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2、p-C-Jun N-末端激酶(JNK)、BMP-2、Runx2、OSX抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司；引物購自上海生工。

1.2 大鼠顱骨成骨細胞的分離、培養(yǎng) 取出生24 h內(nèi)的SD大鼠8只，處死后置于75%酒精中，消毒3～5 min后，于無菌條件下取出顱骨，除骨膜及結(jié)締組織后，PBS清洗3次。將顱骨剪成1 mm2左右的碎塊，用0.25%胰蛋白酶2 ml，37 ℃預消化10 min，用血清培養(yǎng)液10 ml終止消化后，1 000 r/min離心5 min，棄上清。將沉淀物于0.1%Ⅱ型膠原酶10 ml，37 ℃消化100 min后終止消化。收集消化液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，取細胞沉淀，PBS漂洗后，重復離心過程。于離心管中加入含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液2 ml，將沉淀細胞吹打均勻，并于200目濾網(wǎng)過濾去除碎骨片，制成細胞懸濁液。將細胞懸濁液接種至細胞培養(yǎng)瓶中靜置10 min后，吸收上清液并置于另一培養(yǎng)瓶中，最后將細胞懸濁液接種于培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)，隔日換液。待顯微鏡下觀察可見成骨細胞80%以上融合時，用0.25%胰蛋白酶消化30 s后，進行細胞傳代培養(yǎng)。

1.3 成骨細胞分化及鑒定 第3代成骨細胞培養(yǎng)至出現(xiàn)80%融合時，將細胞以5×103個/cm2接種在40 mm培養(yǎng)皿中，并在成骨分化培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、10 mmol/L HEPES、50 μg/ml L-抗壞血酸和5 mmol/L β-甘油磷酸酯的DMEM培養(yǎng)基)中培養(yǎng)21 d，每周更換2次培養(yǎng)基。隨后用PBS洗滌細胞2次，用4%福爾馬林固定15 min，并用水洗滌，然后將細胞與茜素紅孵育2 min進行染色。PBS洗滌3次后，用蒸餾水洗滌數(shù)次。于鏡下觀察細胞。

1.4 成骨細胞增殖、凋亡測定 細胞增殖測定：第3代成骨細胞培養(yǎng)至出現(xiàn)80%融合時，將細胞以5×103個/孔接種在96孔培養(yǎng)板中孵育過夜。加入含0、10、20、40 μmol/L吡格列酮的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μl MTT，孵育4 h后，棄去上清液，于每孔中加入100 μl二甲基亞砜，振蕩混合3 min后，使用酶標儀于490 nm下測量吸光度(OD490)。

細胞凋亡測定：應(yīng)用Hoechst 33258染色檢測細胞凋亡。第3代細胞培養(yǎng)至出現(xiàn)80%融合時，將細胞以4×104個/cm2接種至12孔板中，孵育過夜。根據(jù)參考文獻[5]，于培養(yǎng)基中加入含0、10、20、40 μmol/L吡格列酮的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，PBS洗滌細胞以除去非貼壁細胞，貼壁細胞置于4%多聚甲醛中固定10 min。PBS洗滌后，細胞與0.2 mmol/L Hoechst 33258在黑暗中孵育5 min。于熒光顯微鏡下觀察凋亡成骨細胞數(shù)。

1.5 ALP活性檢測 第3代成骨細胞培養(yǎng)至出現(xiàn)80%融合時，將細胞以5×103個/cm2接種在40 mm培養(yǎng)皿中，加入含0、10、20、40 μmol/L吡格列酮的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，更換為成骨分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，每周更換2次培養(yǎng)基。各組細胞培養(yǎng)的第14天，棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞2次后，收集細胞，1 000 r/min離心30 min。取上清液，使用ALP活性測定試劑盒檢測ALP活性，所有操作均嚴格按照說明書進行。在酶標儀上于420 nm處讀取吸光值(OD420)。

1.6 鈣化結(jié)節(jié)染色鑒定 應(yīng)用茜素紅染色進行鈣化結(jié)節(jié)測定。“1.6”項下各組細胞培養(yǎng)的第21天，棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞2次后，用4%福爾馬林固定15 min。用水洗滌后，將細胞與0.1%茜素紅(pH 8.9)于37 ℃下孵育2 min。PBS洗滌3次后，用蒸餾水洗滌數(shù)次后，拍照記錄鈣化結(jié)節(jié)情況。

1.7 實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 應(yīng)用qRT-PCR進行成骨分化相關(guān)基因的mRNA表達檢測。將細胞數(shù)調(diào)節(jié)至1×106/ml，TRIzol試劑(Invitrogen，美國)從細胞提取總RNA，Reverse Transcription Kit(Takara，日本)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，SYBR Green(Takara)進行實時PCR分析。以β-Actin作為內(nèi)參。利用ABI7500系統(tǒng)(Applied Biosystems)進行qRT-PCR反應(yīng)。用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達的倍數(shù)變化。qRT-PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s，95 ℃15 s，72 ℃ 15 s，共40個循環(huán)。引物設(shè)計及合成由上海生工完成，引物序列如下：BMP-2，forward 5′-GGTGGAATGACTGGATTG-3′，reverse 5′-GCATCGAGATAGCACTG-3′；Runx2，forward 5′-GGAATTCCATATGGACACTT-3′，reverse 5′-CCGCTCGAGGTTATAGTCCT-3′；OSX,forward 5′-TGTCCGTCGTGGATCTGAC-3′，reverse 5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′；β-actin,forward 5′-CTCCTGGCAAGAATGGAGAT-3′，reverse 5′-AATCCACGA

GCACCCTGA-3′。

1.8 蛋白免疫印跡(Western blot，WB) 使用WB進行蛋白表達檢測，補充有PMSF(Riche)的RIPA蛋白提取試劑(Beyotime)裂解細胞，從細胞中提取蛋白質(zhì)。在4 ℃下12 000 r/min離心10 min，通過10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離上清液，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(Sigma)上。將膜在PBS和5%脫脂乳中封閉1 h，并用抗Bcl-2、Bax、p-p38、p-ERK1/2、p-JNK、BMP-2、Runx2、OSX的一抗于4 ℃孵育過夜。將膜用HRP綴合的二抗(Cell Signaling Technology)在室溫下孵育1 h。使用Quantity One軟件(Life Technologies)評估相對蛋白表達水平。

2 結(jié)果

2.1 成骨細胞形態(tài)觀察及鑒定 倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，大鼠成骨細胞原代培養(yǎng)的第2天，成骨細胞呈圓形，單細胞離散分布(圖1A)。在培養(yǎng)的第4天，細胞數(shù)量增加，細胞形態(tài)多樣，呈多角形、三角形、梭形等(圖1B)。細胞培養(yǎng)的第14天，細胞迅速增殖，細胞呈梭形或立方形，排列緊密，可多層生長，細胞整合達90%，可進行傳代培養(yǎng)(圖1C)。第3代成骨細胞培養(yǎng)21 d后，細胞重疊生長，茜素紅染色顯示，胞漿內(nèi)可見棕黑色或黑色鈣結(jié)節(jié)沉積(圖1D)。提示本研究所培養(yǎng)新生大鼠顱骨成骨細胞具有細胞分化能力。

2.2 吡格列酮對成骨細胞增殖的影響 第3代成骨細胞經(jīng)0、10、20、40 μmol/L吡格列酮處理48 h后，細胞活性(OD490)分別為0.82±0.03、0.58±0.06、0.38±0.04、0.25±0.03，隨著吡格列酮濃度的增加，各組細胞活性逐漸降低，差異有統(tǒng)計學意義(F=282.629，P<0.01)。見圖2。

圖1 成骨細胞形態(tài)觀察及鑒定

注：*與空白對照組比較，P<0.05；#與10 μmol/L組比較，P<0.05；△與20 μmol/L組比較，P<0.05

2.3 吡格列酮對成骨細胞凋亡的影響 第3代成骨細胞經(jīng)0、10、20、40 μmol/L吡格列酮處理48 h后，熒光顯微鏡下觀察成骨細胞Hoechst 33258染色陽性細胞數(shù)。與空白對照組相比，經(jīng)10、20 μmol/L吡格列酮處理組熒光陽性成骨細胞數(shù)量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與空白對照組及吡格列酮10 μmol/L組、20 μmol/L組相比，吡格列酮40 μmol/L組熒光陽性成骨細胞數(shù)量顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示低濃度(10、20 μmol/L)吡格列酮抑制成骨細胞凋亡，而高濃度(40 μmol/L)吡格列酮促進成骨細胞凋亡。見圖3。

圖3 吡格列酮對成骨細胞凋亡的影響(n=8)

2.4 吡格列酮對成骨細胞Bax、Bcl-2蛋白表達的影響 與空白對照組相比，第3代成骨細胞經(jīng)10、20 μmol/L吡格列酮處理48 h后，細胞內(nèi)Bax蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)。當吡格列酮濃度為40 μmol/L時，與空白對照組相比，成骨細胞內(nèi)Bax蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖4。

圖4 吡格列酮對成骨細胞Bax、Bcl-2蛋白表達的影響(n=8)

注：*與空白對照組比較，P<0.05；#與10 μmol/L組比較，P<0.05；△與20 μmol/L組比較，P<0.05

2.5 吡格列酮對成骨細胞分化的影響

2.5.1 吡格列酮對ALP活性的影響 第3代成骨細胞經(jīng)0、10、20、40 μmol/L吡格列酮處理48 h后，ALP活性(OD420)分別為1.07±0.15、0.89±0.04、0.75±0.03、0.53±0.03，隨著吡格列酮濃度的增加，各組細胞ALP活性逐漸降低，差異有統(tǒng)計學意義(F=64.247，P<0.01)。見圖5。

圖5 吡格列酮對成骨細胞ALP活性的影響(n=8)

注：*與空白對照組比較，P<0.05；#與10 μmol/L組比較，P<0.05；△與20 μmol/L組比較，P<0.05

2.5.2 吡格列酮對成骨細胞鈣化結(jié)節(jié)形成的影響 與空白對照組相比，吡格列酮處理組的鈣化結(jié)節(jié)數(shù)均明顯降低(圖6A)。以鈣化結(jié)節(jié)在培養(yǎng)皿中所占面積的百分比進行量化，發(fā)現(xiàn)隨著吡格列酮濃度的增加，鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量逐漸增加，且差異均有統(tǒng)計學意義(F=672.644，P<0.01)。見圖6B。

2.5.3 吡格列酮對成骨細胞BMP-2、Runx2、OSX mRNA表達的影響 經(jīng)0、10、20、40 μmol/L吡格列酮處理的成骨細胞于成骨分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，應(yīng)用qRT-PCR檢測吡格列酮對成骨細胞分化相關(guān)基因表達的影響。與空白對照組相比，經(jīng)10、20、40 μmol/L吡格列酮處理后，細胞內(nèi)BMP-2、Runx2、OSX mRNA表達水平均以劑量依賴形式顯著降低(P<0.05)。見圖7。

圖6 吡格列酮對成骨細胞鈣化結(jié)節(jié)形成的影響(n=8)

注：A.茜素紅染色觀察到鈣化結(jié)節(jié)，B.鈣化結(jié)節(jié)在培養(yǎng)皿中所占面積百分比。*與空白對照組比較，P<0.05；#與10 μmol/L組比較，P<0.05；△與20 μmol/L組比較，P<0.05

圖7 吡格列酮對成骨細胞BMP-2、Runx2、OSX mRNA表達的影響(n=8)

注：*與空白對照組比較，P<0.05；#與10 μmol/L組比較，P<0.05；△與20 μmol/L組比較，P<0.05

2.5.4 吡格列酮對成骨細胞BMP-2、Runx2、OSX蛋白表達的影響 與空白對照組相比，經(jīng)10、20、40 μmol/L吡格列酮處理后，細胞內(nèi)BMP-2、Runx2、OSX蛋白表達水平均以劑量依賴形式顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖8。

2.6 吡格列酮對成骨細胞MAPK信號通路的影響 經(jīng)0、10、20、40 μmol/L吡格列酮處理的成骨細胞于成骨分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，應(yīng)用免疫印跡分析，檢測吡格列酮對成骨細胞MAPK信號通路的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，經(jīng)10、20、40 μmol/L吡格列酮處理后，細胞內(nèi)p-p38 MAPK蛋白表達水平均顯著增加(P<0.05)，而p-ERK1/2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，且均存在劑量依賴性。各組細胞內(nèi)p-JNK蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖9。

圖8 吡格列酮對成骨細胞BMP-2、Runx2、OSX蛋白

注：*與空白對照組比較，P<0.05；#與10 μmol/L組比較，P<0.05；△與20 μmol/L組比較，P<0.05

圖9 吡格列酮對成骨細胞MAPK信號通路的影響(n=8)

注：*與空白對照組比較，P<0.05；#與10 μmol/L組比較，P<0.05；△與20 μmol/L組比較，P<0.05

3 討論

本研究采用新生24 h內(nèi)SD大鼠顱骨組織來源的成骨細胞進行培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察到成骨細胞生長狀態(tài)良好，形態(tài)與過往學者報道一致。通過茜紅素染色可使鈣化結(jié)節(jié)呈現(xiàn)棕黑色或黑色沉積，證實所培養(yǎng)成骨細胞具有分化為鈣結(jié)節(jié)的能力。

研究表明，TZDs對骨代謝過程存在不利作用，能夠抑制骨骼間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化，抑制骨形成，誘導成骨細胞凋亡，使成骨細胞正常功能受損，導致骨量減少，并增加骨折風險[6-7]。研究證實，吡格列酮能夠抑制成骨細胞增殖、分裂和DNA合成，且低濃度吡格列酮(≤20 μmol/L)能夠抑制成骨細胞凋亡，而較高濃度吡格列酮(30～40 μmol/L)則促進成骨細胞凋亡[5]。與此一致，本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，經(jīng)10、20、40 μmol/L吡格列酮處理后，成骨細胞活性下降。另外，與空白對照組相比，吡格列酮濃度為10、20 μmol/L時，成骨細胞凋亡被抑制，而當吡格列酮濃度為40 μmol/L時，能夠促進成骨細胞凋亡。Bcl-2家族蛋白是調(diào)節(jié)線粒體損傷的關(guān)鍵分子，Bax是Bcl-2家族中重要的促凋亡蛋白，在細胞凋亡調(diào)控中起重要作用。研究證實，Bax表達的增加、Bcl-2表達水平的降低能夠?qū)е录毎蛲鯷8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，羅格列酮能夠劑量依賴性促進Bax表達增加，從而導致成骨細胞死亡[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，當吡格列酮濃度為10、20 μmol/L時，成骨細胞內(nèi)Bax蛋白表達水平降低，而Bcl-2蛋白表達水平顯著增加。當吡格列酮濃度為40 μmol/L時，成骨細胞內(nèi)Bax蛋白表達水平增加，而Bcl-2蛋白表達水平顯著降低。提示吡格列酮可通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白表達水平，調(diào)控成骨細胞凋亡，且這種調(diào)控作用存在劑量依賴性，其機制可能在于成骨細胞自身調(diào)節(jié)機制可以對抗低濃度吡格列酮誘導的凋亡作用，而隨著吡格列酮含量的增加，Bcl-2/Bax平衡超過自身調(diào)節(jié)范圍，無法對抗藥物刺激引起的細胞凋亡。

成骨細胞增殖抑制、凋亡增加及分化程度降低，是造成骨質(zhì)疏松癥的重要原因。TZDs對成骨細胞分化影響的研究較少，且吡格列酮對成骨細胞分化的影響及相關(guān)機制尚未報道。本研究進一步分析吡格列酮對大鼠成骨細胞分化功能的影響，并探討潛在機制。

ALP是成骨細胞在分化早期所分泌的酶蛋白，是骨形成的標志性蛋白，特異性較高，可作為鑒定成骨細胞的生化和組織學標志[11]。ALP變化反映了骨轉(zhuǎn)換過程中骨形成程度，其活性與成骨細胞的分化程度呈正相關(guān)。有證據(jù)表明，ALP活性的微小降低直接影響成骨細胞礦化形成過程。另外，成骨細胞分化的標志性表型是礦化結(jié)節(jié)的形成。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同濃度吡格列酮處理后，各組成骨細胞ALP活性降低，且吡格列酮可抑制成骨細胞礦化結(jié)節(jié)的形成，提示吡格列酮可抑制大鼠成骨細胞的分化，且隨著其濃度的增加，抑制作用逐漸增強。BMP-2是促進骨形成、誘導成骨細胞分化的重要細胞外信號分子之一，是最強的成骨因子之一。BMP-2調(diào)節(jié)因子Runx2是間質(zhì)細胞分化成前成骨細胞所必需的[12]。Runx2下游的OSX是成骨細胞特異性的成骨細胞分化和骨形成所必需的轉(zhuǎn)錄因子[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)吡格列酮處理后，成骨細胞內(nèi)BMP-2、Runx2、OSX mRNA和蛋白表達以劑量依賴的形式降低，由此推測，吡格列酮通過調(diào)控成骨細胞內(nèi)BMP-2/Runx2/OSX信號通路，參與調(diào)控大鼠成骨細胞分化功能。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是能夠被不同細胞外刺激激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，是信號轉(zhuǎn)導過程中的主要信號分子，參與多種重要的細胞生理病理過程[14-15]。已在哺乳動物細胞中鑒定了MAPKs的3條并行信號通路：p38、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)和C-Jun N-末端激酶(JNK)，在細胞增殖、分化、凋亡等過程中都發(fā)揮重要作用。研究表明，包括成骨細胞在內(nèi)的多種細胞類型中，ERK參與細胞的增殖、分化和存活，而p38和JNK參與細胞周期控制、細胞凋亡和炎癥反應(yīng)[16]。Tang等[17]發(fā)現(xiàn)，BMP-2在成骨細胞中的表達受p38和ERK信號通路調(diào)控。ERK1/2組成型活性形式的激活能夠誘導成骨細胞的分化[18-19]。p38的磷酸化能誘導smad1活化，從而調(diào)控BMP-2/smads信號通路，導致成骨細胞ALP表達和活化[20]，且BMP-2在成骨細胞中的表達受MAPK調(diào)控[21-23]。另外，在成骨細胞中，JNK和p-38 MAPK能夠誘導細胞凋亡，而ERK能夠抑制凋亡過程[24]。這些研究表明，MAPK信號通路參與成骨細胞特異性基因表達和功能調(diào)控。已有研究報道，吡格列酮通過調(diào)控MAPK信號通路，調(diào)節(jié)細胞炎癥反應(yīng)[25]。體外研究表明，曲格列酮通過激活MAPK信號通路增加成骨細胞的凋亡[26]。然而，吡格列酮在成骨細胞中對MAPK信號通路的影響尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)吡格列酮處理后，成骨細胞內(nèi)p-p38蛋白表達水平增加，而p-ERK1/2蛋白表達水平降低，且均呈劑量依賴性。而p-JUN1/2蛋白表達水平無明顯變化。推測吡格列酮能夠通過活化p38信號通路和抑制ERK1/2信號途徑參與成骨細胞凋亡和分化過程。成骨細胞代謝過程十分復雜，作為細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的主要信號分子，MAPK信號通路在吡格列酮影響成骨細胞增殖、分化及凋亡過程中的作用還需深入探究，以期為臨床用藥提供一定參考依據(jù)。

綜上所述，吡格列酮以劑量依賴的方式調(diào)節(jié)大鼠成骨細胞增殖、凋亡和分化，p38和ERK1/2信號途徑在這一過程中起重要調(diào)控作用。

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