HEK293T細(xì)胞中驗證靶向豬ApoE基因TALEN活性

徐華榮，雒志新，李 托，王 昕

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

ApoE (Apolipoprotein E)蛋白是人血漿中五類載脂蛋白之一，分為三個亞型[1-2]。有報道稱，ApoE基因的多態(tài)性與阿爾茲海默病(Alzheimer's disease，AD)的發(fā)生有關(guān)[3-6]。此外，ApoE蛋白被認(rèn)為參與了血管相關(guān)疾病病變過程[7-8]，但其具體的生物學(xué)功能目前并不清楚。類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease，TALEN)是一種組裝簡單、定點敲除和細(xì)胞毒性低的基因敲除技術(shù)[9-10]，目前已經(jīng)成功應(yīng)用于各類動植物體的基因編輯中[11-13]。本試驗構(gòu)建靶向敲除豬ApoE基因的TALEN，并在HEK293T細(xì)胞中利用雙熒光報告系統(tǒng)驗證其特異切割活性，為進(jìn)一步構(gòu)建豬疾病模型提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

T4 DNA連接酶及內(nèi)切酶BsmBI購買于NEB，Taq DNA聚合酶購自全式金生物公司，質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)mega公司，DNA凝膠回收試劑盒購自威格拉斯。載體pST-TALEN-Backbones、pmRFP-EGFP-MCS、TALEN模塊質(zhì)粒文庫，DH5α菌株，HEK293T細(xì)胞系均由本課題組保存。引物為上海博尚生物技術(shù)公司合成(表1)；載體序列測序由南京金思瑞生物科技有限公司完成。

1.2 方 法

首先利用在線TAL Effector Nucleotide Targeter2.0工具[14]，在ApoE基因第四外顯子靶點位置左右各選擇一段TALE結(jié)合位點，然后采用本課題組先前報道的TALE組裝方法，利用TALE質(zhì)粒文庫組裝TALEN[15]，并進(jìn)一步利用雙熒光報告系統(tǒng)在HEK293T細(xì)胞中驗證其工作活性[16]。

1.2.1 TALEN表達(dá)載體的構(gòu)建 利用TAL Effector Nucleotide Targeter 2.0網(wǎng)站的TALN Targeter工具，在ApoE基因的第四外顯子靶位點的序列中，選擇推薦的TALE蛋白特異結(jié)合的序列。根據(jù)結(jié)合靶點位置的TALE蛋白氨基酸，選擇相應(yīng)的TALE四聯(lián)模塊，并采用PCR方法擴(kuò)增各個模塊(表1引物)。菌落PCR檢測陽性克隆(表1引物)，經(jīng)酶切鑒定后，將陽性克隆進(jìn)行測序確認(rèn)，獲得針對ApoE基因的TALEN真核表達(dá)載體PST-ApoE-Left和PST-ApoE-Right，-20 ℃保存。

1.2.2 報告載體構(gòu)建 報告引物經(jīng)95 ℃變性，65 ℃退火連接，獲得左右各帶NotI和BamHI酶切位點的粘性末端片段，psDRED骨架載體經(jīng)NotI和BamHI酶切后回收骨架片段，將兩者按照一定比例混合，T4連接酶16 ℃連接過夜。以CMV和報告載體的下游引物為上、下游引物，進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽性克隆送測序公司測序鑒定。

1.2.3 雙熒光報告系統(tǒng)檢測TALEN的活性 將HEK293T細(xì)胞接種在12孔板上培養(yǎng)，試驗組將TALEN表達(dá)載體和對應(yīng)的報告載體混合共轉(zhuǎn)染，并設(shè)置轉(zhuǎn)染TALEN骨架載體和雙熒光報告載體的對照組。轉(zhuǎn)染10 h后更換細(xì)胞培養(yǎng)液。共轉(zhuǎn)24 h及48 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞紅綠熒光的發(fā)光情況。

2 結(jié) 果

2.1 TALEN結(jié)合位點四聯(lián)模塊選擇及擴(kuò)增

通過https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen在ApoE基因第四外顯子靶點左右各選擇一段序列作為TALE結(jié)合位點(表2)。左側(cè)識別結(jié)合位點為GGG CGC CGA CAT，右側(cè)為AGA GCA CCA AGC。在TALE質(zhì)粒文庫中選擇出對應(yīng)的模塊。

采用表1的引物將6個相應(yīng)的四聯(lián)模塊PCR擴(kuò)增，獲得引入BsmBI酶切位點的片段，取1 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，獲得465 bp左右的DNA條帶，TALE模塊擴(kuò)增完成。

2.2 ApoE-TALEN表達(dá)載體及雙熒光報告載體構(gòu)建

將ApoE-TALEN表達(dá)載體用NotI和EcoRI雙酶切消化獲得5 600 bp和 2 300 bp的目的片段(圖2，2、3號泳道)。陽性克隆測序驗證與模擬克隆序列相同，成功獲得ApoE-TALEN真核生物表達(dá)載體。報告載體經(jīng)測序檢測，目的片段序列正確。

表1 組裝TALEN四聯(lián)模塊、報告引物及測序引物序列表Table 1 Oligonucleotide sequences of primers for vector construction, detection and sequencing

表2 TALE四聯(lián)模塊的選擇Table 2 Tetramers of TALE

圖1 PCR擴(kuò)增四聯(lián)模塊 M. Trans2K Plus DNA Maker；1-3.模塊L1，L2，L3； 4-6模塊R1，R2，R3Fig.1 Amplified tetramers by PCR M. Trans2K Plus DNA Maker; 1-3. tetramers:L1，L2，L3；4-6. tetramers:R1，R2，R3

圖2 pST1374-TALEN-ApoE表達(dá)載體酶切鑒定 M. Trans 15K Marker；1. pST1374空白對照；2，3.陽性質(zhì)粒Fig.2 Digestion identification of pST1374-TALEN- ApoE expression vector M. Trans15K Marker; 1. pST1374 blank control; 2，3.positive plasmid

2.3 TALEN的活性檢測

ApoE-TALEN表達(dá)載體及雙熒光報告載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，培養(yǎng)24 h及48 h后倒置熒光顯微鏡下觀察。白光觀察細(xì)胞狀態(tài)，紅光檢測轉(zhuǎn)染效率，綠光指示TALEN工作。在轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞24 h后，有較弱的熒光。48 h后，在試驗組觀察到有綠色熒光表達(dá)，對照組沒有，說明TALEN能夠在真核細(xì)胞中工作(圖3)。

圖3 ApoE-TALEN雙熒光報告系統(tǒng)活性檢測結(jié)果Fig.3 The fluorescence results in HEK293T cells treated by TALEN

3 討 論

基因敲除是一種有效的研究基因功能的方法，可達(dá)到從根本上沉默靶基因的目的[17]。TALEN作為簡單實用基因編輯技術(shù)，其基于Golden Gate優(yōu)化的組裝方法大大推動了基因定點修飾的進(jìn)程。各種基于TALEN技術(shù)的動植物突變體以及細(xì)胞突變系的報道不斷涌現(xiàn)，為生命科學(xué)研究提供了不可或缺的研究材料[18]。ApoE基因與各種衰老現(xiàn)象及心血管疾病發(fā)生相關(guān)，被認(rèn)為是潛在治療老年癡呆的靶基因[19]，但目前其具體的生物學(xué)功能并不清楚。

本研究利用本課題組快速高效組裝TALEN的方法一周內(nèi)完成了靶向ApoE基因的TALEN組裝，與組裝ZFNs相比極大縮短了試驗周期[15]。并進(jìn)一步在HEK293T細(xì)胞中通過雙熒光報告系統(tǒng)中綠色熒光蛋白的表達(dá)情況指示TALEN的工作活性[16]。將TALEN的檢測結(jié)果與之前構(gòu)建的兩對ZFNs的結(jié)果做了比較，從綠色光斑的比例上來說，ZFN1的效率最高，其次是TALEN，而ZFN2的效率則最低[20]。造成這種結(jié)果的原因很可能是因為三者選擇的ApoE基因靶向位點不同的位置效應(yīng)，影響到了FokI的切割活性。當(dāng)然不同的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率以及細(xì)胞狀態(tài)也會對結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。多位點的靶向敲除為徹底的沉默基因功能提供了保障。由于豬在生理機(jī)能方面與人的高度相似性，因此利用豬作為疾病模型來研究ApoE的致病機(jī)理，具有重要的理論意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] DONG L M ,WILSON C,WARDELL M R, et al.Human apolipoproteinE.Roleof arginine 61 in mediating the lipoprotein preferences of the E3 and E4 isoforms[J]. Journal of Biological Chemistry, 1994，269(35):22 358-22 365.

[2] FULLERTON S M ,CLARK A G,WEISS K M, et al.Apolipoprotein E variation at the sequence haplotype level: implications for the origin and maintenance of a major human polymorphism [J]. American Journal of Human Genetics, 2000，67(4): 881.

[3] SCHUFF N,WOERNER N,BORETA L, et al. MRI of hippocampal volume loss in early Alzheimer's disease in relation to ApoE genotype and biomarkers [J]. Brain,2009，132(4):1 067-1 077.

[4] KORCZYN A D, Clinical diagnosis of Alzheimer's disease (AD) [J]. European Neuropsychopharmacology, 1994，4(3):241.

[5] HARDY J,AND D J SELKOE.The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics [J]. Science, 2002，297(5580): 353-356.

[6] TERWEL D,STEFFENSEN K R,VERGHESE P B, et al.Critical role of astroglial apolipoprotein E and liver X receptor-α expression for microglial Aβ phagocytosis [J]. Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience, 2011，31(19): 7 049-7 059.

[7] BANERJEE I，GUPTA V,GANESH S. Association of gene polymorphism with genetic susceptibility to stroke in Asian populations: a meta-analysis [J]. Journal of Human Genetics, 2007，52(3): 205-219.

[8] LAFFONT I.SHUVAEV V V,BRIAND O,et al.Early-glycation of apolipoprotein E: effect on its binding to LDL receptor, scavenger receptor A and heparan sulfates [J]. Biochimica Et Biophysica Acta, 2002，1583(1): 99-107.

[9] DOYLE E L,BOOHER N J,STANDAGE D S, et al.TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction [J]. Nucleic Acids Research, 2012，40(40):117-122.

[10] MUSSOLINO C，MORBITZER R,LüTGE F, et al.A novel TALE nuclease scaffold enables high genome editing activity in combination with low toxicity [J]. Nucleic Acids Research, 2011，39(21): 9 283-9 293.

[11] ZU Y,TONG X,WANG Z, et al.TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish [J]. Nature Methods, 2013，10(4): 329-331.

[12]LI T, LIU B,SPALDING M H, et al.High-efficiency TALEN-based gene editing produces disease-resistant rice [J]. Nature Biotechnology, 2012，30(5): 390-392.

[13] MAHATA B，BISWAS K. Generation of Stable Knockout Mammalian Cells by TALEN-Mediated Locus-Specific Gene Editing [J]. Methods in Molecular Biology, 2017，1498: 107-120.

[14] DOYLE E L,BOOHER N J,STANDAGE D S, et al.TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction [J]. Nucleic Acids Research, 2012,40(Web Server issue):117-122.

[15] ZHANG Z,LI D,XU H, et al.A simple and efficient method for assembling TALE protein based on plasmid library [J]. PLoS One, 2013,8(6): e66459.

[16] 韓芙蓉, 王令, 徐坤, 等. 基于SSA修復(fù)機(jī)制和特異性核酸酶活性檢測的雙熒光報告載體系統(tǒng)的開發(fā)及應(yīng)用 [J]. 遺傳, 2015,37(10): 1 053-1 060.

[17] SANTIAGO Y,CHAN E,LIU P Q, et al., Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2008,105(15):5 809-5 814.

[18] GAJ T,GERSBACH C A, AND C F,et al.CRISPR/Cas-based methods for genome engineering [J]. Trends in Biotechnology, 2013,31(7): 397-405.

[19] NAMJOSHI D,STUKAS S, AND C L,Wellington, ABCA1, apoE and apoA-I as potential therapeutic targets for treating Alzheimer's disease [J]. Neurodegenerative Disease Management, 2017,1(3): 245-259.

[20] 徐華榮, 李托, 王昕. 豬ApoE基因ZFNs構(gòu)建及其在真核細(xì)胞中活性驗證 [J]. 家畜生態(tài)學(xué)報, 2016,37(5): 13-17.