• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    芝麻酚對(duì)豬精液冷凍保存效果的影響

    2018-07-04 06:24:34耿果霞徐德軍陳華麗茍清碧裴一飛李青旺
    家畜生態(tài)學(xué)報(bào) 2018年6期
    關(guān)鍵詞:活率稀釋液芝麻

    王 捷,耿果霞,楊 麗,徐德軍,陳華麗,茍清碧,裴一飛,吳 琳,李青旺*

    (1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,陜西 楊凌 712100;2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

    相比較于其他動(dòng)物,豬精子質(zhì)膜含有豐富的不飽和脂肪酸和少量的膽固醇,使豬精子對(duì)冷凍刺激更為敏感[1]。大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)會(huì)在冷凍過(guò)程中形成,以及預(yù)處理中精漿的移除,導(dǎo)致精子內(nèi)氧化還原系統(tǒng)失衡,質(zhì)膜受到破壞,失去了選擇通透性,冷凍解凍后精子活率顯著降低[2]。大量研究表明,外源性抗氧化劑的添加,可有效消除過(guò)量ROS,提高精子抗氧化損傷能力,維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)。Giaretta等[3]發(fā)現(xiàn),一定濃度的維生素C能提高豬解凍后精子活率和膜完整性。Jeong等[4]研究證明,在冷凍稀釋液中添加適量Vitamin E可以提高解凍后豬精子活率和功能完整性。Chanapiwat等[5]和Kaeoket等[6]一致認(rèn)為,添加適量L-半胱氨酸明顯改善解凍后精子質(zhì)量。Gadea等[7]研究表明,在冷凍稀釋液中添加適量還原型GSH可以明顯改善整體解凍后精子質(zhì)量,增強(qiáng)核蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,從而提高其體內(nèi)和體外的受精能力。Varo-Ghiuru等[8]在葉黃素對(duì)冷凍解凍后精子質(zhì)量的影響研究中發(fā)現(xiàn),適當(dāng)濃度的葉黃素可以增強(qiáng)解凍后精子對(duì)滲透壓的耐受性,維持DNA雙鏈結(jié)構(gòu)并提高活率和頂體的完整性。盡管如此,仍然不能滿(mǎn)足實(shí)際生產(chǎn)需要,因此,尋找一些更有效的抗氧化劑,對(duì)提高優(yōu)良公畜利用率,加快豬精子冷凍保存研究,完善人工授精技術(shù)具有重要的意義。

    芝麻酚(3,4-亞甲二氧基苯酚,sesamol,SM)是存在于芝麻油中的一種芳香類(lèi)物質(zhì),白色至淡黃色結(jié)晶性粉末或顆粒,微溶于水,易溶于乙醇、乙醚等極性有機(jī)溶劑,具有良好的藥理作用并常作為食品和醫(yī)藥的抗氧化劑。芝麻酚對(duì)OH·、NO、 O-·2等活性氧自由基均具有較強(qiáng)的清除作用[9-10]。芝麻酚被用于食品領(lǐng)域,多用來(lái)添加至植物或者動(dòng)物油脂中,以提高油脂的抗氧化能力,延長(zhǎng)油脂的保存時(shí)間[11]。但作為天然無(wú)毒的抗氧化劑,目前尚未發(fā)現(xiàn)芝麻酚對(duì)豬精子冷凍保存效果的研究。本試驗(yàn)將不同濃度的芝麻酚作為外源性抗氧化劑添加到冷凍稀釋液中,通過(guò)檢測(cè)解凍后豬精子的活率、功能完整性和抗氧化能力,探究芝麻酚對(duì)豬精子冷凍保存效果的影響。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    精液樣品采集于楊凌某豬場(chǎng),試驗(yàn)豬為健康狀態(tài)良好,1~2歲齡杜洛克種公豬(n=3)。手握法采集豬精液,37 ℃顯微鏡下觀(guān)察,乳白色、無(wú)異味且活率大于75%的精液用于試驗(yàn)。

    1.2 方 法

    1.2.1 預(yù)處理 用等溫等量BTS液稀釋檢驗(yàn)合格的豬精液樣品,經(jīng)0.5 h平衡后離心(800 r/min,10 min,17 ℃),棄上清液。用冷凍基礎(chǔ)液(Tris-Citric Acid Glucose,TCG)和卵黃以4∶1體積比配置成冷凍Ⅰ液,預(yù)冷后緩慢加入到離心后的沉積中,按1∶2比例稀釋?zhuān)啿及蠓湃? ℃冰箱平衡1.5~2 h。再等體積緩慢加入預(yù)冷過(guò)的Ⅱ液(在冷凍Ⅰ液基礎(chǔ)上添加終濃度為3%的甘油),并用紗布包裹后在4 ℃繼續(xù)平衡2~3 h。選擇精子活率高于0.6的精液樣品進(jìn)行冷凍。

    1.2.2 冷凍 將裝有精液樣品并用封口粉密封好的0.25 mL細(xì)管放入程序冷凍儀中,以1 ℃/min的速率從4 ℃降至-5 ℃,當(dāng)溫度恒定在-5 ℃時(shí),將細(xì)管置于液氮面3 cm上方熏蒸10 min,迅速投入到液氮中保存。

    1.2.3 解凍 將細(xì)管從液氮中取出后迅速放入37 ℃恒溫水浴鍋中孵育45 s,然后取出,剪斷兩端后將精液倒入1.5 mL離心管內(nèi),置34 ℃恒溫水浴鍋中,10 min后進(jìn)行精液品質(zhì)檢測(cè)。

    1.3 質(zhì)量檢測(cè)

    1.3.1 活率 用等溫BTS液稀釋解凍精液樣品。400×倒置顯微鏡下觀(guān)察精子,根據(jù)其運(yùn)動(dòng)狀態(tài)評(píng)定精子活率。

    1.3.2 線(xiàn)粒體活性 利用羅丹明( rhodamine123,Rh123)和碘化丙啶(propidium iodide,PI)熒光染料聯(lián)合染色鑒別精子線(xiàn)粒體活性[12]。在熒光相差顯微鏡下(400×,激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)513 nm)觀(guān)察,計(jì)數(shù)頭部無(wú)紅色熒光且頸部發(fā)綠色熒光精子所占比率,重復(fù)3次,每次計(jì)數(shù)精子不少于200個(gè)。

    1.3.3 精子質(zhì)膜完整性檢測(cè) 通過(guò)HOST試驗(yàn)測(cè)定精子質(zhì)膜完整性[13]。精液樣品置于顯微鏡下(400×)觀(guān)察,計(jì)數(shù)具有彎尾的精子所占比率,重復(fù)3次,每次計(jì)數(shù)精子不少于200個(gè)。

    1.3.4 頂體完整性 利用FITC-PNA熒光染色法檢測(cè)精子的頂體完整性[14]。在熒光相差顯微鏡下(400×,激發(fā)波長(zhǎng)480 nm、發(fā)射波長(zhǎng)530 nm)觀(guān)察,計(jì)數(shù)頭部頂端發(fā)綠色熒光精子所占比率,重復(fù)3次,每次計(jì)數(shù)精子不少于200個(gè)。

    1.3.5 DNA完整性 利用吖啶橙染色法檢測(cè)精子DNA完整性[15]。在熒光相差顯微鏡下(400×下,激發(fā)光波長(zhǎng)450 nm、發(fā)射光波長(zhǎng)490 nm)觀(guān)察,計(jì)數(shù)頭部發(fā)綠色熒光精子所占比率,重復(fù)3次,每次計(jì)數(shù)精子不少于200個(gè)。

    1.3.6 生化參數(shù) 取精液樣品離心(25 ℃, 1 600 r/min,5 min),在所得沉淀物中加入3倍體積1% TritonX-100抽提20 min,再次離心(25 ℃,4 000 r/min,30 min),保留上清液,使用南京建成生物工程研究所的MDA、SOD、CAT和GSH-Px試劑盒,分別檢測(cè)解凍后豬精子MDA水平以及 SOD、CAT和GSH-PX酶的活力。

    1.4 統(tǒng)計(jì)分析

    應(yīng)用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,以P<0.05表示差異顯著。

    1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    分別向稀釋液中添加0.05、0.10、0.15、0.20和0.25 g/L的芝麻酚,以不添加芝麻酚的TCG稀釋液作為對(duì)照,檢測(cè)解凍后豬精子活率、質(zhì)膜完整率、頂體完整率、線(xiàn)粒體活性、DNA完整性、MDA水平和抗氧化酶活性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 芝麻酚對(duì)解凍后豬精子活率和線(xiàn)粒體活性的影響

    通過(guò)冷凍前添加一定濃度的芝麻酚,可以顯著提高解凍后豬精子活率和線(xiàn)粒體活性(P<0.05),在0.1~0.2 g/L的范圍內(nèi),芝麻酚濃度和解凍后精子的活率和線(xiàn)粒體活性呈正相關(guān)(P<0.05),并且當(dāng)芝麻酚濃度為0.2 g/L時(shí),精子活率和線(xiàn)粒體活率最高(P<0.05),活率為45.84%,線(xiàn)粒體活性為56.87%。當(dāng)芝麻酚濃度為0.25 g/L時(shí),解凍后精子活率顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。添加0.05 g/L和0.25 g/L芝麻酚和對(duì)照組相比較,精子線(xiàn)粒體活性并沒(méi)有明顯改變(P>0.05)。

    表1 芝麻酚對(duì)冷凍-解凍后豬精子活率和線(xiàn)粒體活性的影響Table 1 Effect of sesamol on frozen-thawed boar spermatozoa motility and mitochondrial activity

    2.2 芝麻酚對(duì)解凍后豬精子功能完整性的影響

    通過(guò)冷凍前添加一定濃度的芝麻酚,可以顯著提高解凍后精子質(zhì)膜完整率、頂體完整率和DNA完整率(P<0.05)。當(dāng)芝麻酚濃度為0.2 g/L時(shí),精子質(zhì)膜完整率和頂體完整率最高,相比較于對(duì)照組,分別提高了18.78%和14.09%(P<0.05)。但當(dāng)芝麻酚濃度為0.25 g/L時(shí),精子DNA完整率最高,為72.46%(P<0.05)。芝麻酚添加濃度為0.05 g/L與對(duì)照組相比較,解凍后精子質(zhì)膜完整率、頂體完整率和DNA完整率差異不顯著(P>0.05)。

    2.3 芝麻酚對(duì)解凍后豬精子生化參數(shù)的影響

    通過(guò)冷凍前添加一定濃度的芝麻酚,可以顯著提高解凍后精子SOD、CAT和GSH-Px活性(P<0.05)。當(dāng)芝麻酚添加濃度為0.2 g/L時(shí),MDA水平最低(P<0.05),SOD和GSH-Px活性最高(P<0.05),而當(dāng)芝麻酚添加濃度為0.15 g/L時(shí),CAT活性最高(P<0.05)。當(dāng)芝麻酚添加濃度為0.05 g/L時(shí),與對(duì)照組相比較差異不顯著(P>0.05)。因此,當(dāng)芝麻酚添加濃度為0.2 g/L時(shí),對(duì)豬精子抗氧化性效果最佳。

    表2 芝麻酚對(duì)冷凍-解凍后豬精子功能完整性的影響Table 2 Effect of sesamol on frozen-thawed boar spermatozoa functional integrity

    表3 芝麻酚對(duì)冷凍-解凍后豬精子生化參數(shù)的影響Table 3 Effects of sesamol on frozen-thawed boar spermatozoa biochemical parameters

    3 討 論

    芝麻油中含有大量的PUFA,由于其內(nèi)活性物質(zhì)芝麻酚被認(rèn)為是芝麻油主要品質(zhì)穩(wěn)定劑,可以保護(hù)PUFA不被氧化,故芝麻油比其他植物油穩(wěn)定[16]。芝麻酚對(duì)O2-·自由基具有較強(qiáng)的清除作用,其清除活性要優(yōu)于2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)和維生素E[10]。作為天然的食源性抗氧化劑,芝麻酚已被廣泛研究于醫(yī)學(xué)損傷防護(hù)上。芝麻酚能保護(hù)小鼠外周血淋巴細(xì)胞的DNA,顯著降低因射線(xiàn)照射引起的DNA損傷[17],提高小鼠淋巴細(xì)胞DNA的自我損傷修復(fù)能力[18],通過(guò)改變氧化應(yīng)激水平和炎癥介質(zhì)一定程度上解除環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的大鼠肝毒性[19]。但是,目前還未報(bào)道關(guān)于芝麻酚對(duì)豬精液冷凍保護(hù)效果的研究。本試驗(yàn)在冷凍稀釋液中添加梯度濃度的芝麻酚,表明適量濃度的芝麻酚對(duì)豬精子冷凍保護(hù)具有良好的作用。

    豬精子因其質(zhì)膜富含PUFA,更易受到冷凍過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)量ROS的攻擊,而發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),損傷精子結(jié)構(gòu),活率和受精能力降低[2],因而豬精子對(duì)超低溫冷凍比較敏感。在冷凍稀釋劑中添加外源性抗氧化性劑可起到保護(hù)精子的作用,Varo-Ghiuru等[8]研究證明,水溶性維生素E能提高解凍后豬精子活率和頂體完整率。沈濤等[20]研究發(fā)現(xiàn),在豬精液冷凍稀釋液中添加α-硫辛酸,可以顯著提高解凍后豬精子活率和SOD酶活性。孫艷青等[21]研究證明,在豬精液冷凍稀釋液中添加葡萄籽原花青素,可以顯著提高解凍后精子品質(zhì)和抗氧化能力。本試驗(yàn)中,在冷凍稀釋液中添加適量的芝麻酚,顯著提高解凍后精子質(zhì)量,本試驗(yàn)研究結(jié)果和上述研究結(jié)果一致。

    本試驗(yàn)中,芝麻酚可提高解凍后豬精子質(zhì)量和抗氧化能力,表明芝麻酚對(duì)冷凍-解凍后豬精子有保護(hù)作用。芝麻酚是一種高效無(wú)毒的抗氧化劑,分子中含有可提供良好抗氧化能力的酚羥基和亞甲二氧基苯環(huán),以及結(jié)構(gòu)中近似與苯環(huán)垂直的氧原子軌道使得整個(gè)分子結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定[22],其穩(wěn)定的抗氧化能力可以有效減少精子的氧化損傷,維持精子結(jié)構(gòu)和功能完整性。Kanimozhi等[23]驗(yàn)證了芝麻酚可一定程度消除OH·、O2-、NO、DPPH·、ABTS·+等自由基。MDA是生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物,其含量可以間接反映機(jī)體受過(guò)氧化的損傷程度,而SOD、CAT和GSH-Px酶活性均可直接反映精子抗氧化能力[24]。本試驗(yàn)表明,芝麻酚可以提高精子內(nèi)SOD、CAT和GSH-Px活性,Prasad等[25]研究表明,芝麻酚預(yù)處理體外培養(yǎng)的人淋巴細(xì)胞能提高SOD、CAT和GSH-Px活性,減輕γ射線(xiàn)的毒害作用、避免著絲粒發(fā)生畸變。當(dāng)添加芝麻酚濃度達(dá)到0.25 g/L時(shí),解凍后精子質(zhì)量明顯下降,甚至低于對(duì)照組。可能是因?yàn)樵谙♂屢褐刑砑痈邼舛鹊闹ヂ榉訒?huì)降低精液樣品的pH,從而對(duì)精子造成嚴(yán)重?fù)p害。pH可能通過(guò)影響乙酰輔酶A、琥珀酰輔酶A等一些代謝酶的酰化作用調(diào)節(jié)其活性進(jìn)而調(diào)節(jié)這些酶介導(dǎo)的能量代謝,影響ATP水平,從而影響體外培養(yǎng)精子活力及功能[26]。

    有研究通過(guò)比較含有芝麻酚、Vitamin E和同時(shí)含有芝麻酚和Vitamin E的油在60 ℃放置時(shí)間不同得出結(jié)論,而含有芝麻酚和Vitamin E的油抗氧化活性較高[27]。將芝麻酚和生育酚配伍,對(duì)豬精液冷凍保存是否有更好的效果,還需進(jìn)一步試驗(yàn)。

    4 結(jié) 論

    本試驗(yàn)表明,豬精液冷凍稀釋液中添加適量的芝麻酚可以顯著提高解凍后精子活率、功能完整性和抗氧化活性,其最適添加濃度為0.2 g/L。

    參考文獻(xiàn):

    [1] CASAS I, Flores E. Gene Banking: The Freezing Strategy[M]// Boar Reproduction,2013:551-588.

    [2] 張亮, 姜垠, 邱進(jìn)杰,等. 豬精液冷凍保存影響因素研究進(jìn)展[J]. 豬業(yè)科學(xué), 2016, 33(2):114-116.

    [3] GIARETTA E, ESTRADA E, BICCI D, et al. Combining reduced glutathione and ascorbic acid has supplementary beneficial effects on boar sperm cryotolerance[J]. Theriogenology, 2015, 83(3):399-407.

    [4] JEONG Y J, KIM M K, SONG H J, et al. Effect of α-tocopherol supplementation during boar semen cryopreservation on sperm characteristics and expression of apoptosis related genes [J]. Cryobiology, 2009, 58(2):181-189.

    [5] CHANAPIWAT P, KAEOKET K, TUMMARUK P. Effects of DHA-enriched hen egg yolk and L-cysteine supplementation on quality of cryopreserved boar semen[J]. Asian Journal of Andrology, 2009, 11(5):600-608.

    [6] KAEOKET K, CHANAPIWAT P, TUMMARUK P, et al. Supplemental effect of varying L-cysteine concentrations on the quality of cryopreserved boar semen[J]. Asian Journal of Andrology, 2010, 12(5):760-765.

    [7] GADEA J, MOLLA M, SELLES E, et al. Reduced glutathione content in human sperm is decreased after cryopreservation: Effect of the addition of reduced glutathione to the freezing and thawing extenders[J]. Cryobiology, 2011, 62(1):40-46.

    [8] VAROGHIURU F, MICLEA I, HETTIG A, et al.Lutein, trolox, ascorbic acid and combination of trolox with ascorbic acid can improve boar semen quality during cryopreservation[J]. Cryo Letters, 2015, 36(1):1-7.

    [9] KANIMOZHI P, PRASAD N R. Antioxidant potential of sesamol and its role on radiation-induced DNA damage in whole-body irradiated Swiss albino mice[J]. Environmental Toxicology & Pharmacology, 2009, 28(2):192-197.

    [10] 李宇, 劉宇光, 董新榮,等. 芝麻酚清除O2-·自由基的活性研究[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā), 2009, 30(1):44-45.

    [11] 董新榮, 劉宇光, 李本祥. 芝麻酚對(duì)茶油抗氧化活性研究[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā), 2008, 29(7):19-21.

    [12] FRASER L, DZIEKOSKA A, STRZEZEDK R, et al. Dialysis of boar semen prior to freezing-thawing: its effects on post-thaw sperm characteristics[J]. Theriogenology, 2007, 67(5):994-1 003.

    [14] ABOAGLA E M, TERADA T. Trehalose-enhanced fluidity of the goat sperm membrane and its protection during freezing[J]. Biology of Reproduction, 2001, 69(4):1 245-1 250.

    [15] LIU L J, PENG-CHENG M A, WANG L, et al. Protective Effect of Astragalus Polyose on DNA Integrity of Human Sperm[J]. Journal of International Reproductive Health/family Planning, 2015, 225(9):50-53.

    [16] 蔣文偉, 羅杰, 牟莉娟. 抗氧劑芝麻酚制備技術(shù)及抗氧化活性評(píng)述[J]. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè), 2001, 21(4):73-78.

    [17] KANIMOZHI P, PRASAD N R. Antioxidant potential of sesamol and its role on radiation-induced DNA damage in whole-body irradiated Swiss albino mice[J]. Environmental Toxicology & Pharmacology, 2009, 28(2):192-197.

    [18] NAIR G G, NAIR C K. Protection of cellular DNA and membrane from γ-radiation[J]. Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 2010, 25(6):629.

    [19] JNANESHWARI S, HEMSHEKHAR M, THUSHARA R M, et al. Sesamol Ameliorates Cyclophosphamide-Induced Hepatotoxicity by Modulating Oxidative Stress and Inflammatory Mediators[J]. Anti-cancer agents in medicinal chemistry, 2013, 14(7):975-983.

    [20] SHEN T, JIANG Z L, LI C J, et al. Effect of alpha-lipoic acid on boar spermatozoa quality during freezing-thawing[J]. Zygote, 2015, 24(2):1-7.

    [21] 孫艷青, 李青旺, 耿果霞,等. 葡萄籽原花青素對(duì)豬精液冷凍保存效果的研究[J]. 家畜生態(tài)學(xué)報(bào), 2016, 37(5):46-51.

    [22] SEUNGWOOK L, MINKYU J, MINHEE P, et al. Effects of roasting conditions of sesame seeds on the oxidative stability of pressed oil during thermal oxidation[J]. Food Chemistry, 2010, 118(3):681-685.

    [23] KANIMOZHI P, PRASAD N R. Antioxidant potential of sesamol and its role on radiation-induced DNA damage in whole-body irradiated Swiss albino mice[J]. Environmental Toxicology & Pharmacology, 2009, 28(2):192-197.

    [24] 鄔志薇, 蔣霞, 童星,等. 芝麻酚清除自由基及對(duì)輻照大鼠抗氧化能力的影響[J]. 中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志, 2013, 33(1):37-39.

    [25] PRASAD N R, MENON V P, VASUDEV V, et al. Radioprotective effect of sesamol on gamma-radiation induced DNA damage, lipid peroxidation and antioxidants levels in cultured human lymphocytes[J]. Toxicology, 2005, 209(3):225-235.

    [26] 王立蕊, 甄林青, 楊強(qiáng)震,等. 培養(yǎng)液pH值對(duì)小鼠精子體外培養(yǎng)過(guò)程中活力及蛋白修飾的影響[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)農(nóng)業(yè)科學(xué)版, 2016, 34(3):6-14.

    [27] 黃紀(jì)念, 宋國(guó)輝, 孫強(qiáng). 芝麻和芝麻油的抗氧化活性[J]. 中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng), 2009(2):26-28.

    猜你喜歡
    活率稀釋液芝麻
    兩種肉用品種種公羊采精量及精子活率的比較分析
    草食家畜(2022年6期)2022-12-27 01:04:02
    不同稀釋液對(duì)雞新城疫活苗免疫效果評(píng)價(jià)
    香噴噴的芝麻
    中老年保健(2021年3期)2021-08-22 06:51:16
    稀釋方法、孵育溫度和時(shí)間對(duì)冷凍-解凍后豬精液質(zhì)量的影響
    一品芝麻狐 第四回
    一品芝麻狐 第二回
    一品芝麻狐 第五回
    卵黃和十二烷基硫酸鈉添加量對(duì)犬精子凍后活率的影響
    豬精液常溫保存稀釋液配方篩選試驗(yàn)研究
    冷凍前預(yù)處理對(duì)新西蘭兔精液超低溫保存品質(zhì)的影響
    狠狠狠狠99中文字幕| 国产av精品麻豆| 男女之事视频高清在线观看| 性色av乱码一区二区三区2| 香蕉丝袜av| АⅤ资源中文在线天堂| 51午夜福利影视在线观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 欧美大码av| 国产精品国产高清国产av| 国产成人欧美| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | a级毛片在线看网站| 嫩草影院精品99| 一夜夜www| 国内精品久久久久久久电影| 9191精品国产免费久久| 此物有八面人人有两片| or卡值多少钱| 无人区码免费观看不卡| 国产成人精品久久二区二区免费| 波多野结衣高清无吗| 老汉色av国产亚洲站长工具| 在线观看日韩欧美| 久久人妻av系列| 欧美精品亚洲一区二区| 两个人免费观看高清视频| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 一级作爱视频免费观看| 黄色毛片三级朝国网站| 91字幕亚洲| 精品乱码久久久久久99久播| 一区二区三区精品91| 国产激情久久老熟女| 又黄又粗又硬又大视频| 久久国产乱子伦精品免费另类| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国内精品久久久久精免费| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲国产精品999在线| 久久久精品欧美日韩精品| av福利片在线| 在线国产一区二区在线| 免费看a级黄色片| 视频区欧美日本亚洲| 99在线视频只有这里精品首页| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲欧美激情在线| www.999成人在线观看| 桃红色精品国产亚洲av| 怎么达到女性高潮| 欧美一区二区精品小视频在线| www.999成人在线观看| 欧美乱妇无乱码| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 黄色女人牲交| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| 波多野结衣av一区二区av| 99国产综合亚洲精品| 老司机午夜十八禁免费视频| 日韩国内少妇激情av| 久久国产乱子伦精品免费另类| 制服丝袜大香蕉在线| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产在线观看jvid| 亚洲五月天丁香| 亚洲精品国产一区二区精华液| www日本在线高清视频| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产国语露脸激情在线看| 午夜福利成人在线免费观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 免费无遮挡裸体视频| 嫩草影视91久久| 亚洲片人在线观看| 长腿黑丝高跟| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 色精品久久人妻99蜜桃| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 操出白浆在线播放| 欧美黄色淫秽网站| 精品国内亚洲2022精品成人| 9热在线视频观看99| 亚洲成人久久性| 婷婷精品国产亚洲av在线| 精品一品国产午夜福利视频| 啦啦啦 在线观看视频| 丝袜美腿诱惑在线| 禁无遮挡网站| 久久草成人影院| 成人欧美大片| 一进一出抽搐gif免费好疼| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 免费av毛片视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 性欧美人与动物交配| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产精品 国内视频| 女人精品久久久久毛片| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 男人舔女人的私密视频| 一级a爱片免费观看的视频| 色综合站精品国产| 色播亚洲综合网| 极品人妻少妇av视频| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲色图综合在线观看| 不卡av一区二区三区| 激情视频va一区二区三区| 日韩欧美国产一区二区入口| 99国产综合亚洲精品| 啪啪无遮挡十八禁网站| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 搡老熟女国产l中国老女人| 黄色 视频免费看| 国产精品九九99| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲专区字幕在线| 亚洲成人国产一区在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产不卡一卡二| 母亲3免费完整高清在线观看| 午夜成年电影在线免费观看| 超碰成人久久| 美女午夜性视频免费| a级毛片在线看网站| 91老司机精品| 国产av在哪里看| 欧美成人性av电影在线观看| 中文字幕最新亚洲高清| 999久久久国产精品视频| 亚洲av电影在线进入| 久久久国产成人精品二区| 韩国av一区二区三区四区| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 亚洲五月天丁香| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 可以在线观看的亚洲视频| 美国免费a级毛片| 国产真人三级小视频在线观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产精品 欧美亚洲| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲三区欧美一区| 亚洲精品粉嫩美女一区| 精品无人区乱码1区二区| 看免费av毛片| 一级黄色大片毛片| 97碰自拍视频| 亚洲第一青青草原| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产精品乱码一区二三区的特点 | 国产在线精品亚洲第一网站| 日本五十路高清| 狠狠狠狠99中文字幕| 中文字幕最新亚洲高清| 国产男靠女视频免费网站| 两个人视频免费观看高清| 天堂影院成人在线观看| www.自偷自拍.com| 国产亚洲精品久久久久5区| 亚洲男人的天堂狠狠| 久久久久久免费高清国产稀缺| 淫秽高清视频在线观看| 欧美大码av| 日韩免费av在线播放| 日本免费a在线| 亚洲精品国产色婷婷电影| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲一码二码三码区别大吗| 丁香六月欧美| 黄色女人牲交| 久久这里只有精品19| 在线观看舔阴道视频| 在线观看一区二区三区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 淫妇啪啪啪对白视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 两个人视频免费观看高清| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲精品一区av在线观看| 国产精品久久视频播放| 久久久久久久久中文| 欧美黑人精品巨大| 极品人妻少妇av视频| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产一区二区激情短视频| 91麻豆av在线| 亚洲 国产 在线| 国产成人精品久久二区二区91| 日韩大尺度精品在线看网址 | 久久人人爽av亚洲精品天堂| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 美女 人体艺术 gogo| 国产精品国产高清国产av| 久久精品影院6| 欧美成人免费av一区二区三区| 不卡一级毛片| 老鸭窝网址在线观看| 成人欧美大片| 欧美中文日本在线观看视频| 悠悠久久av| 成在线人永久免费视频| 久久国产精品人妻蜜桃| 男女下面进入的视频免费午夜 | 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲欧美激情在线| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲午夜理论影院| АⅤ资源中文在线天堂| 正在播放国产对白刺激| 精品久久久久久,| 一本久久中文字幕| 岛国在线观看网站| 国产精品九九99| √禁漫天堂资源中文www| 日韩免费av在线播放| 色精品久久人妻99蜜桃| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 亚洲中文日韩欧美视频| 日韩欧美三级三区| 日本三级黄在线观看| 91字幕亚洲| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 国产精品 国内视频| 热re99久久国产66热| 国产av一区二区精品久久| 免费在线观看亚洲国产| 丝袜在线中文字幕| 最近最新免费中文字幕在线| 美国免费a级毛片| 国产成年人精品一区二区| 欧美一级毛片孕妇| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 91国产中文字幕| 国产免费男女视频| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲精品美女久久av网站| 久久午夜亚洲精品久久| 久久影院123| 91九色精品人成在线观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清 | 久久精品国产亚洲av高清一级| 久久久国产成人精品二区| 不卡av一区二区三区| 成人三级黄色视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 精品人妻1区二区| av在线天堂中文字幕| aaaaa片日本免费| 久久精品国产综合久久久| www.自偷自拍.com| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 十分钟在线观看高清视频www| 一边摸一边抽搐一进一出视频| av欧美777| 99久久国产精品久久久| 麻豆久久精品国产亚洲av| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲国产精品合色在线| 日韩欧美免费精品| 午夜日韩欧美国产| 啦啦啦 在线观看视频| 正在播放国产对白刺激| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 国产私拍福利视频在线观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产又爽黄色视频| 丝袜人妻中文字幕| 久久 成人 亚洲| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 一夜夜www| 看片在线看免费视频| 午夜免费观看网址| 国产av一区在线观看免费| 亚洲欧美日韩无卡精品| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 动漫黄色视频在线观看| 在线观看午夜福利视频| av免费在线观看网站| 香蕉丝袜av| 国产成人免费无遮挡视频| 精品国产美女av久久久久小说| 99久久综合精品五月天人人| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 无人区码免费观看不卡| 少妇粗大呻吟视频| 久久久国产成人免费| 午夜两性在线视频| 国产成人影院久久av| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 天天添夜夜摸| 91在线观看av| 99国产综合亚洲精品| 黄色毛片三级朝国网站| 天堂√8在线中文| av天堂久久9| 亚洲国产看品久久| 成年女人毛片免费观看观看9| 日韩欧美国产一区二区入口| 无人区码免费观看不卡| 自线自在国产av| 国产欧美日韩一区二区精品| 丝袜在线中文字幕| 久久香蕉激情| 欧美一区二区精品小视频在线| 青草久久国产| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 一夜夜www| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 欧美久久黑人一区二区| 午夜免费观看网址| 久久影院123| 黄色女人牲交| 日韩欧美在线二视频| 99re在线观看精品视频| 校园春色视频在线观看| 久久狼人影院| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 日韩成人在线观看一区二区三区| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 黄片播放在线免费| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 欧美一级a爱片免费观看看 | 国产蜜桃级精品一区二区三区| 色av中文字幕| 婷婷六月久久综合丁香| 国产激情久久老熟女| 99re在线观看精品视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 美女大奶头视频| 操美女的视频在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 精品日产1卡2卡| 亚洲成人精品中文字幕电影| 老司机午夜福利在线观看视频| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 亚洲片人在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| 国产免费av片在线观看野外av| www.精华液| 亚洲片人在线观看| 黄色丝袜av网址大全| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 一区二区日韩欧美中文字幕| 成人18禁在线播放| 黄片小视频在线播放| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲在线自拍视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 欧美最黄视频在线播放免费| 久久精品人人爽人人爽视色| 色播在线永久视频| 91av网站免费观看| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲精华国产精华精| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久久久九九精品影院| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 久久 成人 亚洲| 国产三级黄色录像| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产一区二区三区综合在线观看| 中文字幕高清在线视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 亚洲一区二区三区不卡视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 成人国产综合亚洲| 久久精品91无色码中文字幕| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 免费高清视频大片| 免费观看精品视频网站| 亚洲中文av在线| 国产成人精品久久二区二区免费| 久久久精品欧美日韩精品| 精品卡一卡二卡四卡免费| 日韩视频一区二区在线观看| 欧美乱色亚洲激情| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲最大成人中文| 母亲3免费完整高清在线观看| 一级a爱视频在线免费观看| av超薄肉色丝袜交足视频| 亚洲五月色婷婷综合| 久久精品成人免费网站| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 99在线视频只有这里精品首页| 国产精品综合久久久久久久免费 | 国产亚洲av高清不卡| 青草久久国产| www.自偷自拍.com| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产又色又爽无遮挡免费看| 欧美色欧美亚洲另类二区 | 天堂影院成人在线观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 一级毛片女人18水好多| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 国产成人av教育| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| www国产在线视频色| 精品国产一区二区三区四区第35| 天堂影院成人在线观看| 在线天堂中文资源库| 高潮久久久久久久久久久不卡| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 成人精品一区二区免费| 黄频高清免费视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 精品电影一区二区在线| 国产色视频综合| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 免费看a级黄色片| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 日韩精品青青久久久久久| 国产精品久久视频播放| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产精品九九99| 老司机午夜福利在线观看视频| 日韩免费av在线播放| 成人免费观看视频高清| 多毛熟女@视频| 99re在线观看精品视频| 欧美黄色淫秽网站| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 日日干狠狠操夜夜爽| 久久国产精品影院| 国产精品 国内视频| 欧美激情久久久久久爽电影 | 国产99久久九九免费精品| 美女高潮到喷水免费观看| 久久精品国产综合久久久| 亚洲av熟女| 亚洲欧美激情在线| 无人区码免费观看不卡| 午夜福利欧美成人| 久久热在线av| 91成年电影在线观看| 无限看片的www在线观看| 欧美在线一区亚洲| 亚洲熟女毛片儿| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 此物有八面人人有两片| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 91麻豆精品激情在线观看国产| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 成人三级黄色视频| av片东京热男人的天堂| 亚洲伊人色综图| 国产麻豆成人av免费视频| 丝袜在线中文字幕| 桃红色精品国产亚洲av| 少妇 在线观看| 亚洲国产精品成人综合色| 精品国产国语对白av| 变态另类丝袜制服| 欧美大码av| 丰满的人妻完整版| 国产成人啪精品午夜网站| 久久亚洲精品不卡| 亚洲男人的天堂狠狠| 午夜福利一区二区在线看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲,欧美精品.| 真人做人爱边吃奶动态| 国产高清有码在线观看视频 | 国产人伦9x9x在线观看| 色综合站精品国产| 成年版毛片免费区| 波多野结衣一区麻豆| 国产亚洲精品第一综合不卡| 日韩欧美国产在线观看| 成人免费观看视频高清| 9热在线视频观看99| 麻豆国产av国片精品| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 嫁个100分男人电影在线观看| 成人国产一区最新在线观看| www.精华液| 国产一区二区三区综合在线观看| 不卡av一区二区三区| 禁无遮挡网站| 亚洲成人精品中文字幕电影| 久久人妻av系列| 日韩视频一区二区在线观看| 精品不卡国产一区二区三区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 一区二区日韩欧美中文字幕| 91精品国产国语对白视频| 日韩欧美免费精品| 亚洲精品在线美女| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲,欧美精品.| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 最近最新免费中文字幕在线| 嫩草影视91久久| 国产激情久久老熟女| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲国产精品合色在线| 国产熟女午夜一区二区三区| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产99久久九九免费精品| а√天堂www在线а√下载| 亚洲精品国产区一区二| 99久久综合精品五月天人人| 亚洲熟妇熟女久久| 手机成人av网站| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 免费少妇av软件| 脱女人内裤的视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 亚洲电影在线观看av| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产精品久久久久久精品电影 | 村上凉子中文字幕在线| 国产在线精品亚洲第一网站| 日韩欧美免费精品| 999久久久精品免费观看国产| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲最大成人中文| 亚洲人成电影免费在线| 男女下面进入的视频免费午夜 | 日韩精品中文字幕看吧| 操出白浆在线播放| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 久久久久久久久中文| 久久精品成人免费网站| 国产野战对白在线观看| 国产成人av激情在线播放| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 999久久久精品免费观看国产| 精品欧美一区二区三区在线| 黄色视频不卡| 一级a爱视频在线免费观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 在线免费观看的www视频| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 69精品国产乱码久久久| 日韩精品免费视频一区二区三区| 一区二区三区国产精品乱码| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产野战对白在线观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲av熟女| 久久人人97超碰香蕉20202| 高清在线国产一区| 精品国产乱码久久久久久男人| 欧美亚洲日本最大视频资源| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 免费观看人在逋| 日本黄色视频三级网站网址| 91麻豆av在线| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 免费高清视频大片| 午夜激情av网站| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产精品免费一区二区三区在线| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 69精品国产乱码久久久| 婷婷六月久久综合丁香| av电影中文网址| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 美女大奶头视频| 久久 成人 亚洲| 日韩大码丰满熟妇| 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲精品av麻豆狂野| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产99久久九九免费精品| 中国美女看黄片| 久久久国产欧美日韩av| 国内精品久久久久精免费| 母亲3免费完整高清在线观看| 涩涩av久久男人的天堂| 午夜免费鲁丝| av网站免费在线观看视频| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 午夜亚洲福利在线播放| 12—13女人毛片做爰片一| 级片在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频|