冬凌草甲素抑制破骨細胞分化的機制研究

雷新環(huán) 李芷嫣 黃微星 蔡國平 米爽 洪盾 章禮煒

骨質疏松癥是由于骨重建過程中骨吸收和骨形成的平衡被打破，導致骨量下降，骨密度降低而引起的一系列臨床癥狀。破骨細胞的數量和活性決定骨吸收的持續(xù)時間和發(fā)展速度，在骨質疏松癥發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用[1-2]。既往體內外研究表明許多中藥單體諸如淫羊藿等可通過抑制破骨細胞分化、促進成骨細胞礦化等途徑治療骨質疏松[3-4]。冬凌草甲素是一種二萜類化合物的中藥單體，具有抗腫瘤、抗菌、抗炎等作用，但其能否影響破骨細胞分化目前尚不清楚[5]。本實驗旨在研究中藥單體冬凌草甲素抑制破骨細胞分化的作用及其可能的作用機制，為其治療骨質疏松癥提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 8周齡雌性C57BL/6小鼠購自上海斯萊克動物有限公司。

1.2 材料 冬凌草甲素（大連美侖生物技術有限公司，配制成200mM母液）；巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）、NF-κB受體活化因子配體（RANKL）購自美國R&D公司；alpha MEM、FBS購自美國Gibco公司；CCK-8細胞增殖-毒性檢測試劑盒、反轉錄試劑盒和qRT-PCR試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色試劑盒購自美國sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 骨髓巨噬細胞（bone marrow-derived macrophages,BMMs）的分離、培養(yǎng)及破骨細胞誘導 處死小鼠后分離出股骨和脛骨，用培養(yǎng)基沖出骨髓腔內的細胞后，將細胞轉移至T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含30ng/ml M-CSF的 alpha MEM（含 10%FBS），隔天換液，培養(yǎng)3～5d，獲得BMMs。根據不同需要，BMMs傳代種板，用含 50ng/ml RANKL、30ng/ml M-CSF的 alpha MEM 培養(yǎng)，隔天換液，直至分化為成熟的破骨細胞。

1.3.2 CCK-8法檢測冬凌草甲素對BMMs增殖的影響 收集對數生長期的BMMs，種入96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，細胞密度為8×103/孔，每板共30孔，分為對照組和9 組添加不同濃度（0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4和12.8μM）冬凌草甲素的藥物組，每組3個復孔；在含30ng/ml M-CSF的 alpha MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng) 48、72、96h。然后每孔加入10μl CCK-8溶液，在培養(yǎng)基內再次培養(yǎng)2h后使用酶標儀測定各孔450nm處吸光度（OD）值，實驗重復3次，細胞存活率計算公式：細胞存活率=（對照組OD值-藥物組OD值）/對照組OD值。

1.3.3 破骨細胞分化和TRAP染色 收集對數生長期的BMMs，種入96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，細胞密度為1×104/孔，細胞在含 50ng/ml RANKL、30ng/ml M-CSF的 alpha MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對照組不加藥，藥物組濃度由前述CCK-8實驗結果確定為0.8、0.4μM（排除冬凌草甲素對BMMs增殖的抑制作用），隔天換液。當對照組已經有明顯的破骨細胞形成時培養(yǎng)終止，吸去培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛每孔100μl固定細胞20min后，PBS緩沖液沖洗2遍，行TRAP染色，在倒置熒光顯微鏡下（100×和 200×）觀察，計算 TRAP（+）且細胞核數目 3 個以上的破骨細胞數量目和鋪展率并拍照分析，其中鋪展面積使用ImageJ v.1.51軟件計算，鋪展率=鋪展面積/同一視野總面積。

1.3.4 破骨細胞降鈣素受體（CTR）、組織蛋白酶K（CTSK）、活性 T細胞核因子 c1（NFATc1）mRNA表達水平檢測 采用qRT-PCR法。收集對數生長期的BMMs細胞，種入6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，細胞密度為20×104/孔，細胞在含 50ng/ml RANKL、30ng/ml M-CSF的 alpha MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對照組不加藥，藥物組濃度為0.8、0.4μM，隔天換液至第4天。應用Trizol試劑提取細胞的總RNA并測定濃度后，逆轉錄合成cDNA。以GAPDH為內參，設計引物，GAPDH上游:5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′,下 游 :5′-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3′;CTR 上游:5′-TGCAGACAACTCTTG GTTGG-3 ′，下 游 :5′-TCGGTTTCTTCTCCTCTGGA-3′；CTSK 上游:5′-CTTCCAATACGTGCAGCAGA-3′，下 游 :5′-TCTTCAGGGCTTTCTCGTTC-3′；NFATc1 上游:5′-CCGTTGCTTCCAGAAAATAACA-3′，下 游 :5′-TGTGGGATGTGAACTCGGAA-3′。對待測樣品的待測基因行qRT-PCR，反應體系為20μ（lSYBR Green Mister 10μl，正向引物 1μl,反向引物 1μl，cDNA 0.5μl，ddH2O 7.5μl），反應條件為 95℃ 5min，94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 60s，循環(huán)35次。結果表示及分析使用2-ΔΔCT法。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 破骨細胞鑒定 BMMs在含50ng/ml RANKL、30ng/ml M-CSF的alpha MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)6d后，用TRAP染色，對照組在倒置熒光顯微鏡下可見大量細胞為多個核細胞（≥3個），胞體較大，細胞形態(tài)不規(guī)則、邊緣不規(guī)整，有偽足伸出，胞質中出現較多的紫紅色顆粒，表明用BMMs成功誘導出破骨細胞。

2.2 冬凌草甲素抑制BMMs增殖 與對照組相比，經不同濃度冬凌草甲素處理48、72h后，濃度＞6.4μM的冬凌草甲素有抑制BMMs增殖的作用，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；經冬凌草甲素處理96h后，濃度＞3.2μM的冬凌草甲素有抑制BMMs增殖的作用，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），見圖1和表1。

2.3 冬凌草甲素抑制破骨細胞分化成熟 由于96h CCK-8實驗顯示濃度＞3.2μM冬凌草甲素對BMMs增殖有明顯抑制作用，故筆者選用濃度低于3.2μM作為藥物組篩選其是否可抑制破骨細胞的分化。在倒置相差顯微鏡下觀察可見BMMs經6d M-CSF和RANKL共同誘導后行TRAP染色，對照組出現成熟肥大且細胞核＞3個的破骨細胞，而藥物組（0.4、0.8μM冬凌草甲素）中破骨細胞分化過程明顯受到抑制。倒置相差顯微鏡下統(tǒng)計TRAP（+）且細胞核數目3個或3個以上的破骨細胞數量和鋪展率，發(fā)現藥物組破骨細胞數目和鋪展率較對照組均明顯減少（均P＜0.01），并呈明顯劑量依賴性，見圖2（插頁）、圖3和表2。

2.4 各組破骨細胞CTR、CTSK、NFATc1 mRNA相對表達水平比較 與對照組相比，0.4、0.8μM冬凌草甲素藥物組中CTR、CTSK、NFATc1的mRNA的表達水平均明顯降低（均P＜0.01），且呈劑量依賴性，見圖4。

圖1 BMMs經不同濃度冬凌草甲素處理48、72、96h后細胞存活率（a：BMMs經不同濃度冬凌草甲素處理48h；b：BMMs經不同濃度冬凌草甲素處理72h；c：BMMs經不同濃度冬凌草甲素處理96h；與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

表1 BMMs經不同濃度冬凌草甲素處理48、72、96h后的OD值變化

圖3 經不同濃度冬凌草甲素處理后破骨細胞數目和鋪展率比較（a：經不同濃度冬凌草甲素處理后破骨細胞數目比較；b：經不同濃度冬凌草甲素處理后破骨細胞鋪展率比較；與對照組比較，**P＜0.01）

表2 經不同濃度冬凌草甲素處理后破骨細胞數目和鋪展率的比較

3 討論

骨質疏松癥現已是老年人常見的慢性病之一，破骨細胞介導的骨吸收和成骨細胞介導的骨形成失衡，導致骨密度降低、骨量減少，是骨質疏松癥的重要原因。干擾破骨細胞的分化、增殖、活化、凋亡的任一過程，均能影響破骨細胞的功能，導致骨吸收的增強或減弱[1,6]。因此，干擾破骨細胞的分化增殖是是抑制骨吸收的有效方法。

冬凌草甲素是從唇形科香菜屬植物中分離出的一種二萜類天然有機化合物。冬凌草甲素因其具有良好的抑制腫瘤生長轉移、抗血管生成、抑制免疫反應等作用被人們熟知[7-11]。本研究觀察了冬凌草甲素對BMMs細胞增殖的影響及其在RANKL誘導下往破骨細胞分化的影響，結果表明冬凌草甲素能夠使TRAP（+）破骨細胞數目和鋪展率明顯減少，qRT-PCR顯示破骨細胞相關基因CTR、CTSK、NFATc1的mRNA表達水平也明顯下調，上述結果顯示冬凌草甲素對BMMs的增殖和破骨細胞的分化具有明顯的抑制作用。

BMMs是破骨細胞的前體細胞，在50ng/ml RANKL、30ng/ml M-CSF等誘導因子的作用下分化成為破骨細胞。RANKL是破骨細胞分化成熟和維持功能的重要細胞因子，在骨重建中發(fā)揮著重要的作用，可以促進破骨細胞分化成熟，增加破骨細胞活性，阻止破骨細胞凋亡。目前發(fā)現的破骨細胞內與RANKL相關的信號轉導通路主要有4條：NF-κB通路、MAPK通路、PI3K/Akt通路和CN/NFAT通路，且共同激活下游NFATc1轉錄因子[12-13]。CTR、CTSK、NFATc1是成熟破骨細胞特異性表達的重要基因，RANKL和M-CSF能與BMMs表面的RANK和M-CSF結合，激活NFATc1、NF-κB等轉錄因子，引起下游的鏈式反應，合成CTR、CTSK、TRAP等，并促進骨溶解[12-14]。

圖4 不同濃度冬凌草甲素處理后CTR、CTSK、NFATc1mRNA相對表達水平（a：不同濃度冬凌草甲素處理后CTR mRNA相對表達水平；b：不同濃度冬凌草甲素處理后CTSK mRNA相對表達水平；c：不同濃度冬凌草甲素處理后NFATc1 mRNA相對表達水平；與對照組比較，**P＜0.01）

綜上所述，本研究顯示冬凌草甲素對破骨細胞前體細胞BMMs的增殖及向破骨細胞的分化具有抑制作用，其可能的機制為冬凌草甲素可通過抑制破骨細胞相關基因CTR、CTSK、NFATc1的mRNA表達水平，起到防治破骨細胞相關疾病的作用。本實驗僅在體外條件下研究了冬凌草甲素對破骨細胞增殖分化的影響，還需在動物體內行進一步的實驗研究。

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