選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑對(duì)小鼠肥胖及脂代謝的作用

朱晶 傅曉華 張嶺 金碧輝 舒靜

代謝綜合征是一組包含肥胖、高血糖、血脂異常等一系列疾病的臨床癥候群，絕經(jīng)后女性發(fā)病率顯著升高[1]。其核心是中心性肥胖和胰島素抵抗（insulin resistance，IR）。研究顯示絕經(jīng)后雌激素缺乏會(huì)引起能量消耗降低、脂肪氧化能力下降、體重增加及內(nèi)臟脂肪堆積[2-3]。雌激素替代治療能有效改善或預(yù)防中心性肥胖和IR，降低代謝綜合征的發(fā)生率[4-5]。這提示雌激素及其受體在絕經(jīng)女性脂代謝異常中扮演著重要角色。然而，長(zhǎng)期應(yīng)用雌激素會(huì)增加乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌及血栓的風(fēng)險(xiǎn)。與有完整活性的天然雌激素不同，選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑（selective estrogen receptor modulators，SERMs）是指與雌激素受體高親和力結(jié)合、作用有組織選擇性特點(diǎn)的化合物[6]。SERMs可選擇性作用于不同組織雌激素受體，起類(lèi)似雌激素或抗雌激素作用。其中他莫昔芬作為經(jīng)典SERMs，目前臨床多用于雌激素受體陽(yáng)性乳腺癌藥物輔助治療，但同時(shí)對(duì)骨骼、子宮及脂代謝有不同作用。近期也有研究顯示，他莫昔芬可引起脂肪組織棕色化改變[7]。本研究旨在通過(guò)建立模型觀察他莫昔芬對(duì)小鼠肥胖和脂代謝的影響，探討SERMs在絕經(jīng)女性肥胖及代謝綜合征中的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型建立 8周齡C57/BL6雌鼠32只，具有正常動(dòng)情周期，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，稱(chēng)重、清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室溫保持在22～27℃，濕度約50%。采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為假手術(shù)組、卵巢切除組、假手術(shù)他莫昔芬組、卵巢切除雌激素替代組4組，每組8只。各組處理方法：（1）假手術(shù)組小鼠腹腔注入0.3%戊巴比妥鈉麻醉（0.25ml/10g），打開(kāi)腹腔暴露卵巢不作處理，隨即關(guān)閉腹腔；（2）卵巢切除組小鼠腹腔注入0.3%戊巴比妥鈉麻醉后行雙側(cè)卵巢切除術(shù)；（3）假手術(shù)他莫昔芬組小鼠麻醉后行假手術(shù)，術(shù)后每周1次皮下注射他莫昔芬緩釋劑0.1ml（江蘇揚(yáng)子江藥業(yè)，他莫昔芬5mg碾碎，用注射級(jí)玉米油配置維持血清濃度4ng/ml）；（4）卵巢切除雌激素替代組小鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)后，皮下埋植 17β-雌二醇（E2）緩釋劑（0.36mg，60d釋放，美國(guó)IRA公司）。4組小鼠手術(shù)后給予高脂飲食（40%脂肪）喂養(yǎng)8周，每周稱(chēng)量體重和飼料消耗。

1.2 口服葡萄糖耐量試驗(yàn) 高脂飲食7周后，所有小鼠禁食12h，給予20%葡萄糖溶液（0.1ml/10g）灌胃，采用血糖儀減尾試紙測(cè)定血糖（ACCU-CHEK performa，美國(guó)羅氏公司），時(shí)間依次為 0、15、30、60、90 及 120min，梯形法計(jì)算時(shí)間-血糖AUC。0～120min AUC[mmol/L·h]=[（BG0+BG15）×0.25/2]+[（BG15+BG30）×0.25/2]+[（BG30+BG60）×0.5/2]+[（BG60+BG90）×0.5/2]+[（BG90+BG120）×0.5/2]（BGx分別代表糖負(fù)荷后各時(shí)間點(diǎn)的血糖值）。

1.3 IR相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 高脂飲食8周后，所有小鼠再次禁食12h，二氧化碳安樂(lè)死后心臟穿刺采血0.7～0.8ml，3 000r/min 離心 10min，分離血清-80℃保存。日立7020全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)空腹血糖（FPG）水平，ELISA法（試劑盒購(gòu)自武漢優(yōu)爾生物公司）測(cè)定空腹胰島素（FINS）水平，采用穩(wěn)態(tài)模型評(píng)價(jià)法計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）：HOMA-IR=（FPG×FINS）/22.5。

1.4 血清E2水平和脂代謝指標(biāo)測(cè)定 采用日立7020全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定 TG、TC、HDL-C及 LDL-C，ELISA法（試劑盒均購(gòu)自武漢優(yōu)爾生物公司）測(cè)定血清E2和脂聯(lián)素（ADPN）水平。

1.5 脂肪組織稱(chēng)重 小鼠安樂(lè)死后取皮下脂肪組織（腹股溝脂肪）及內(nèi)臟脂肪組織（子宮旁脂肪）稱(chēng)重記錄。分別計(jì)算各組小鼠體重增加量、皮下脂肪/體重比值及內(nèi)臟脂肪/體重比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Sidak法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血清AUC、FINS、FPG及HOMA-IR比較卵巢切除組小鼠AUC值最大，與其他3組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。假手術(shù)他莫昔芬組小鼠AUC值小于假手術(shù)組（P＜0.05），與卵巢切除雌激素替代組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。4組小鼠FINS和FPG水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。進(jìn)一步計(jì)算HOMA-IR，卵巢切除組小鼠HOMA-IR值較卵巢切除雌激素替代組顯著升高（P＜0.05），其余組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠血清AUC、FINS、FPG及HOMA-IR比較

2.2 各組小鼠血清E2水平比較 與卵巢切除組和假手術(shù)他莫昔芬組比較，假手術(shù)組和卵巢切除雌激素替代組小鼠E2水平均明顯升高（均P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.3 各組小鼠血清脂代謝指標(biāo)水平比較 假手術(shù)他莫昔芬組小鼠血清TC、HDL-C水平均為組間最低（均P＜0.05）；其血清TG水平較卵巢切除雌激素替代組明顯上升（P＜0.05），與其余組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；其血清LDL-C水平較假手術(shù)組及卵巢切除雌激素替代組均明顯上升（均P＜0.05），與卵巢切除組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；其血清ADPN水平較卵巢切除組顯著升高（P＜0.05），與其余組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表3。

表2 各組小鼠血清E2水平比較

表3 各組小鼠血清脂代謝指標(biāo)水平比較

2.4 各組小鼠體重增加量、皮下脂肪/體重比值及內(nèi)臟脂肪/體重比值比較 經(jīng)過(guò)8周高脂飲食喂養(yǎng)后，卵巢切除組小鼠體重增加量最為顯著（均P＜0.05），假手術(shù)他莫昔芬組小鼠體重增加量最少（均P＜0.05）。進(jìn)一步觀察皮下脂肪/體重比值及內(nèi)臟脂肪/體重比值，卵巢切除組皮下脂肪/體重比值及內(nèi)臟脂肪/體重比值增加最多（均P＜0.05），假手術(shù)他莫昔芬組皮下脂肪/體重比值及內(nèi)臟脂肪/體重比值與卵巢切除雌激素替代組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠體重增加量、皮下脂肪/體重比值及內(nèi)臟脂肪/體重比值比較

3 討論

絕經(jīng)后女性由于雌激素缺乏，導(dǎo)致中心性肥胖、IR發(fā)病率顯著上升，并進(jìn)一步造成2型糖尿病、高脂血癥、高血壓等代謝綜合征的發(fā)生，且互相作用，影響老年女性健康。臨床上已經(jīng)明確對(duì)絕經(jīng)女性使用雌激素替代治療能有效降低中心性肥胖及IR的發(fā)生[8]。但是由于雌激素作用的泛化性及乳腺癌、血栓風(fēng)險(xiǎn)，其臨床應(yīng)用一直受到限制。

SERMs是一類(lèi)人工合成的化合物，具有組織選擇性特點(diǎn)，即可選擇性地作用于不同組織的雌激素受體，起類(lèi)似雌激素或抗雌激素作用。本研究顯示，卵巢切除組小鼠和假手術(shù)他莫昔芬組小鼠在同樣的低雌激素狀態(tài)下行高脂飲食喂養(yǎng)，前者體重明顯升高，且皮下及內(nèi)臟脂肪含量增加最多；相較之下，假手術(shù)他莫昔芬組小鼠體重增加量各組間最低，且皮下及內(nèi)臟脂肪量也明顯低于卵巢切除組小鼠，與卵巢切除雌激素替代組小鼠比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示他莫昔芬雖然顯著降低循環(huán)雌激素水平，但與此同時(shí)，對(duì)于雌激素缺乏引起的體重增加及中心性肥胖有一定的改善作用，在體重控制上或許優(yōu)于雌激素補(bǔ)充。

本研究中口服葡萄糖耐量試驗(yàn)也表明，卵巢切除后小鼠在低雌激素狀態(tài)下，糖耐量明顯受損，雌激素補(bǔ)充治療后小鼠糖耐量改善；而假手術(shù)他莫昔芬組小鼠在低雌激素狀態(tài)下糖耐量明顯優(yōu)于卵巢切除組小鼠，和卵巢切除雌激素替代組小鼠比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果進(jìn)一步提示：他莫昔芬或可改善雌激素缺乏引起的血糖升高及糖耐量受損，與雌激素一樣，對(duì)于絕經(jīng)后2型糖尿病的發(fā)生有一定的積極作用。本研究中，去卵巢、雌激素補(bǔ)充及他莫昔芬干預(yù)對(duì)血清FINS水平均無(wú)明顯影響，進(jìn)一步計(jì)算HOMA-IR顯示，卵巢切除雌激素替代組小鼠HOMA-IR值明顯下降，其余各組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。考慮到本試驗(yàn)采用穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估IR水平，對(duì)餐后階段的胰島素敏感性反應(yīng)不足；若同時(shí)存在小鼠糖耐量受損胰島素分泌異常的情況，研究結(jié)果或許不夠準(zhǔn)確。

本研究顯示假手術(shù)他莫昔芬組小鼠血清TC水平組間最低，這與Frolik等[9]既往的研究結(jié)果一致：他莫昔芬可顯著降低血清TC水平，且相較于雌激素，其對(duì)TC的抑制作用更久。對(duì)于TG、HDL-C及LDL-C各研究顯示結(jié)論并不一致。本研究顯示假手術(shù)他莫昔芬組小鼠血清HDL-C水平組間最低，與其他各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；此外，與卵巢切除雌激素替代組小鼠比較，假手術(shù)他莫昔芬組小鼠血清TG和LDL-C水平上升。Markopoulos等[10]對(duì)65例絕經(jīng)后乳腺癌患者使用他莫昔芬后發(fā)現(xiàn)，他莫昔芬顯著降低LDL-C水平，升高HDL-C水平，對(duì)TG水平無(wú)明顯影響。Atalay等[11]研究認(rèn)為他莫昔芬升高血清TG水平，對(duì)HDL-C水平無(wú)明顯影響。本研究他莫昔芬顯著升高小鼠血清ADPN水平，但與卵巢切除雌激素替代組小鼠比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ahl等[12]研究認(rèn)為循環(huán)中ADPN水平與脂肪含量成反比，且肥胖個(gè)體的ADPN水平顯著下降。本研究ADPN水平升高也進(jìn)一步提示他莫昔芬在中心性肥胖及脂代謝中起重要作用。本研究由于他莫昔芬干預(yù)時(shí)間較短，樣本量較少，對(duì)研究結(jié)果會(huì)造成一定影響。

綜上所述，SERMs具有組織選擇性作用特征及抗雌激素和類(lèi)雌激素的雙向作用。其在降低循環(huán)雌激素水平的同時(shí)，對(duì)于局部組織，如脂肪組織蓄積、再分布及血清脂代謝有一定的積極作用。相較于雌激素的泛作用性，在臨床上具備廣泛的應(yīng)用前景。目前臨床上應(yīng)用較成熟的SERMs制劑主要用于改善絕經(jīng)后女性骨代謝，在脂代謝上尚在探索階段。進(jìn)一步擴(kuò)大樣本，探索SERMs的作用機(jī)制，為絕經(jīng)女性中心性肥胖和代謝綜合征提供新的藥物研發(fā)思路是今后研究的方向。

[1]Lobo RA.Metabolic syndrome after menopause and the role of hormones[J].Maturitas,2008,60(1):10-18.doi:10.1016/j.maturitas.2008.02.008.

[2]Litwak SA,Wilson JL,Chen W,et al.Estradiol prevents fat accumulation and overcomes leptin resistance in female high-fat diet mice[J].Endocrinology,2014,155(11):4447-4460.doi:10.1210/en.2014-1342.

[3]Vieira Potter VJ,Strissel KJ,Xie C,et al.Adipose tissue inflammation and reduced insulin sensitivity in ovariectomized mice occurs in the absence of increased adiposity[J].Endocrinology,2012,153(9):4266-4277.doi:10.1210/en.2011-2006.

[4]Polotsky HN,Polotsky AJ.Metabolic implications of menopause[J].Semin Reprod Med,2010,28(5):426-434.doi:10.1055/s-0030-1262902.

[5]Babaei P,Dastras A,Tehrani BS,et al.The effect of estrogen replacement therapy on visceral fat,serum glucose,lipid profiles and apelin level in ovariectomized rats[J].J Menopausal Med,2017,23(3):182-189.doi:10.6118/jmm.2017.23.3.182.

[6]Mirkin S,Pickar JH.Selective estrogen receptor modulators(SERMs):a review of clinicaldata[J].Maturitas,2015,80(1):52-57.doi:10.1016/j.maturitas.2014.10.010.

[7]Cai J,Li B,Wang J,et al.Tamoxifen prefabricated beige adipose tissue improves fat graft survival in mice[J].Plast Reconstr Surg,2018,141(4):930-940.doi:10.1097/PRS.0000000000004220.

[8]呂玲,方素華,寧玉梅.不同雌激素制劑及方案治療絕經(jīng)婦女的觀察[J].浙江醫(yī)學(xué),2003,25(7):439-441.

[9]Frolik CA,Bryant HU,Black EC,et al.Time-dependent changes in biochemical bone markers and serum cholesterol in ovariectomized rats:effects of raloxifene HCl,tamoxifen,estrogen,and alendronate[J].Bone,1996,18(6):621-627.doi:10.1093/annonc/mdn545.

[10]Markopoulos C,Polychronis A,Dafni U,et al.Lipid changes in breast cancer patients on exemestane treatment:final results of the TEAM Greek substudy[J].Ann Oncol,2009,20(1):49-55.doi:10.1093/annonc/mdn545.

[11]Atalay G,Dirix L,Biganzoli L,et al.The effect of exemestane on serum lipid profile in postmenopausal women with metastatic breast cancer:a companion study to EORTC Trial 10951,'Randomized phase II study in first line hormonal treatment for metastatic breast cancer with exemestane or tamoxifen in postmenopausalpatients'[J].Ann Oncol,2004,15(2):211-217.

[12]Ahl S,Guenther M,Zhao S,et al.Adiponectin Levels Differentiate Metabolically Healthy vs Unhealthy Among Obese and Nonobese White Individuals[J].J Clin Endocrinol Metab,2015,100(11):4172-4180.doi:10.1210/jc.2015-2765.