活血醒腦開竅方對缺血性腦卒中大鼠運動功能、炎癥因子及GAP-43表達的影響

陳露露 林汝秀

（南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院，廣東 廣州 510515）

腦卒中是中老年人致死的主要原因，具有較高的致殘率和死亡率［1］。缺血性腦卒中是因腦部血液循環(huán)障礙導致的局限性腦組織缺血壞死，停止供血、供氧，局部腦組織崩解破壞，腦組織受損［2］。神經(jīng)生長相關蛋白-43（GAP-43）為神經(jīng)組織特異性磷酸蛋白質(zhì)，是神經(jīng)元發(fā)育及神經(jīng)生長、再生標志蛋白，為缺血性腦卒中軸突生長分子標志物［3］。缺血性腦卒中屬中醫(yī)學“中風病”，中風的基本病機總屬陰陽失調(diào)，氣血逆亂。“元氣虧虛為本，氣虛生瘀，血瘀生痰，痰郁化火，火極生風，致陰陽失調(diào)，氣血逆亂”為其病理機制［4-6］。活血醒腦開竅方為本院治療缺血性腦卒中患者的院內(nèi)協(xié)定處方，具有較好的臨床療效，但其作用機制尚不明確。本研究旨在觀察活血醒腦開竅方對缺血性腦卒中大鼠運動功能、炎癥因子及GAP-43表達的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 30只健康雄性清潔級SD大鼠，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號SCXK（京）2011-0011，雌雄各半，體質(zhì)量（250±20） g。自然光線，以標準飼料和無菌蒸餾水喂養(yǎng)。

1.2 試藥與儀器 活血醒腦開竅方：川芎10 g，赤芍15 g，丹參 15 g，遠志 10 g，石菖蒲 10 g，黃芪 10 g，冰片0.5 g。藥材均為本院中藥房提供，取除冰片外的處方藥材，加8倍量水煎煮2次，濾過，并制成生藥含量1 g/mL的煎煮液，放涼后加入冰片使溶解。水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公），HE染色液 （Sigma公司），C 反應蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）檢測試劑盒購于武漢博士德生物技術有限公司，GAP-43多克隆抗體（北京中杉生物技術有限公司）。尼莫地平（拜耳醫(yī)藥保健公司）。

1.3 模型制備 30只健康雄性SD大鼠分籠飼養(yǎng)，自然光照，適應性飼養(yǎng)1周開始實驗。水合氯醛麻醉后，經(jīng)頸部正中切開皮膚，鈍性分離肌肉及皮下組織，不要損傷迷走神經(jīng)，暴露右側頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，結扎頸總動脈、頸外動脈，經(jīng)切口插入制備好的栓線，微遇阻力時停止，栓線經(jīng)過頸總動脈分叉處、頸內(nèi)動脈進入顱底至較細的大腦前動脈，阻斷頸內(nèi)動脈、大腦前動脈及大腦后動脈血流供應，固定栓子后逐層縫合皮膚，清除術野，關閉切口，分組分籠飼養(yǎng)，不禁食水［7］。另選擇10只健康雄性SD大鼠作為空白組，給予假手術處理，水合氯醛麻醉后，經(jīng)頸部正中切開皮膚，僅暴露右側頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，不進行扎和栓線阻斷血流處理。

1.4 分組與給藥 造模成功后隨機分為模型組、中藥組和西藥組，每組10只，空白組和模型組給予0.9%氯化鈉注射液灌胃，5 mL/kg，每日1次。中藥組給予活血醒腦開竅方灌胃，5 mL/kg，每日1次。西藥組給予尼莫地平灌胃，劑量為10 mg/kg，每日1次。分別灌胃14 d，14 d后處死大鼠進行觀察。

1.5 運動功能觀察 分別于給藥后7 d和14 d，平衡木行走和轉(zhuǎn)棒上行走評價運動功能，平衡木行走實驗評分：穿過平衡木不跌倒為0分，穿過平衡木跌倒少于1/2為1分，穿過平衡木跌倒大于1/2為2分，能穿過平衡木癱瘓側后肢不能移動為3分，不能穿過平衡木但可坐在上面為4分，在平衡木上掉下來為5分，每只大鼠進行10次測試。轉(zhuǎn)棒上行走實驗評分：轉(zhuǎn)動中大鼠可在棒上行走為0分，轉(zhuǎn)動中大鼠60 s不會掉下來為1分，轉(zhuǎn)動后大鼠掉下來為2分，轉(zhuǎn)動開始前大鼠就從棒上掉下來為3分，每只大鼠進行10次測試。

1.6 標本采集與檢測 1）處死大鼠，開顱取腦，去額極、小腦，生理鹽水清洗后，10%甲醛固定液固定48 h后，二甲苯脫脂，酒精脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，在海馬齒狀回平面連續(xù)冠狀切片，片厚4 μm。觀察各組大鼠的腦組織病理變化。2）空腹抽取3 mL血液，離心，分離血清，Elisa法檢測血清CRP、TNF-α和IL-6炎癥因子水平嚴格按照試劑盒說明書操作。3）免疫組化法檢測腦組織GAP-43表達，取組織切片，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶法檢測大鼠腦組織GAP-43表達，切片常規(guī)脫蠟、水化，按免疫組化試劑盒提供的實驗步驟進行操作。DAB顯色，顯微鏡400倍光鏡視野下觀察，取5個視野，陽性為胞質(zhì)中的棕黃色顆粒，計數(shù)出陽性細胞數(shù)，各視野相加取平均值為G×P-43陽性細胞數(shù)［8］。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗比較組內(nèi)和組間差異，計數(shù)資料以n（%）表示，應用c2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠海馬病理組織比較 見圖1。對照組海馬錐體細胞排列緊密，細胞核圓而大，腦組織皮層細胞形態(tài)、結構正常，模型組海馬、大腦皮質(zhì)細胞核固縮、碎裂，炎細胞浸潤，膠質(zhì)細胞增生，腦組織呈彌漫性損傷，中藥組細胞變性、壞死數(shù)量有所減少，程度也明顯減輕，西藥組和中藥組比較無明顯變化。

圖1 各組大鼠腦組織組織病理改變比較（HE染色，200倍）

2.2 各組大鼠運動功能評分比較 見表1。給藥后7 d和14 d，中藥組的平衡木行走和轉(zhuǎn)棒上行走評分顯著低于模型組，但高于空白組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠運功功能評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠運功功能評分比較（分，±s）

與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。 下同。

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2.3 各組大鼠炎癥因子水平比較 見表2。中藥組CRP、TNF-α和IL-6水平顯著低于模型組，但高于空白組（P＜0.05）。

表2 各組大鼠炎癥因子水平比較（分，±s）

表2 各組大鼠炎癥因子水平比較（分，±s）

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2.4 各組大鼠腦組織GAP-43表達比較 見圖2。中藥組的GAP-43陽性細胞表達 （17.12±3.25）%顯著高于模型組 （12.14±2.48）和空白組 （5.47±1.06）%（P＜0.05）。西藥組與中藥組比較差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）。

圖2 各組大鼠腦組織GAP-43陽性細胞表達（HE染色，200倍）

3 討 論

缺血性腦卒中是由大腦血管狹窄或閉塞，局部腦血流供應障礙，導致腦組織局灶性缺血缺氧，可造成腦組織缺血缺氧性損傷，其發(fā)病機制復雜［9］。缺血性腦卒中患者細胞間隙谷氨酸累積，局灶血流障礙、缺氧、缺血、機械牽拉及炎癥等刺激，引起細胞正常代謝途徑紊亂，體內(nèi)自由基產(chǎn)生與清除平衡破壞，導致患者神經(jīng)功能受損，細胞壞死、水腫，腦組織受損，運動功能受阻，炎癥反應加?。?0］。GAP-43為神經(jīng)組織特異性磷酸蛋白，表達在發(fā)育或再生軸突的生長錐末端，可促進神經(jīng)細胞生長、軸突再生和突觸重構，是軸突生長分子標志蛋白，中樞神經(jīng)損傷后，GAP-43可促進軸突再生和軸突導向，在缺血性腦卒中大腦組織中高表達［11］。缺血性腦卒中后嚴重損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，中藥對促進腦梗死后神經(jīng)修復具有較好的治療作用，筆者采用活血醒腦開竅院內(nèi)協(xié)定處方治療缺血性腦卒中患者取得了較好的臨床療效，但其機制尚不明確。

本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組的大鼠腦組織呈彌漫性損傷，有炎細胞浸潤，膠質(zhì)細胞增生比較，中藥組大鼠腦內(nèi)神經(jīng)細胞壞死數(shù)量減少，程度減輕，說明活血醒腦開竅方可改善缺血性腦卒中大鼠病理損傷。這與活血醒腦開竅方中川芎揮發(fā)油部分對動物大腦的活動具有抑制作用，赤芍通過抑制凝血酶和激活纖溶酶原而發(fā)揮抗血栓作用，丹參增加心肌血流量，擴張外周血管，提高纖溶酶活性，改善微循環(huán)等有關［12］。中藥組的平衡木行走和轉(zhuǎn)棒上行走評分顯著低于模型組，但高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義，說明活血醒腦開竅方可改善缺血性腦卒中大鼠運動功能。活血醒腦開竅方中黃芪、遠志、石菖蒲等行氣、醒腦、益智，改善改善缺血性腦卒中大鼠早期學習能力，保護缺血性損傷神經(jīng)元［13-14］。中藥組的CRP、TNF-α和IL-6水平顯著低于模型組，但高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義，說明活血醒腦開竅方可減輕缺血性腦卒中大鼠減輕炎癥反應?？赡芘c活血醒腦開竅方抑制腦內(nèi)神經(jīng)細胞的凋亡，增強腦組織的神經(jīng)生長因子的表達，興奮大腦皮質(zhì)，增強神經(jīng)調(diào)節(jié)功能，減輕炎癥反應有關。中藥組的GAP-43表達顯著高于模型組和空白組，差異有統(tǒng)計學意義，說明活血醒腦開竅方可升高缺血性腦卒中大鼠腦組織GAP-43表達。這與活血醒腦開竅方修復損傷區(qū)神經(jīng)元軸突，重建神經(jīng)突觸，增強大鼠認知能力和神經(jīng)可塑性有關［15］。

綜上所述，活血醒腦開竅方可改善缺血性腦卒中大鼠病理損傷和運動功能，減輕炎癥反應，可能與升高GAP-43表達有關。

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