淫羊藿苷調(diào)控急性淋巴細(xì)胞白血病PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路的實(shí)驗(yàn)研究*

王 黎 柯 鴻

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院，湖北 十堰 442000）

急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）是一類起源于淋巴細(xì)胞的T系或B系細(xì)胞在骨髓內(nèi)異常分化和增生的惡性克隆性疾?。?］。這些異常增生的細(xì)胞可聚集于骨髓并抑制造血干細(xì)胞的正常造血功能，同時(shí)，異常增生的原始細(xì)胞也可廣泛浸潤(rùn)至骨髓外的淋巴結(jié)、肝、脾、肺、腦膜、性腺等組織，如不及時(shí)采取有效的治療，約20%的兒童和70%的成人會(huì)短期內(nèi)死亡［2］。研究表明，磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（Akt）信號(hào)傳導(dǎo)通路參與多種細(xì)胞功能，包括轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡等［3］。同源性磷酸酶-張力蛋白（PTEN）為具有磷酸酶活性的抑癌基因，在細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)通路中起重要作用，在急性淋巴細(xì)胞白血病中，PTEN沉默或突變失活會(huì)失去對(duì)PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路的抑制作用，造成去對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)通路活化而引起下游的Akt磷酸化［4］。而持續(xù)活化的Akt通過磷酸化下游廣泛的靶點(diǎn)蛋白，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)或抑制細(xì)胞凋亡，并最終導(dǎo)致白血病細(xì)胞大量增生［5］。另有研究表明，淫羊藿苷具有抗腫瘤、促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及遷移等作用［6-7］。但這些實(shí)驗(yàn)結(jié)論大多采用體外細(xì)胞培養(yǎng)方面，而針對(duì)活體卻鮮有報(bào)導(dǎo)，對(duì)與急性淋巴細(xì)胞白血病發(fā)病極其相關(guān)的去對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)通路方面的研究幾無涉及。有鑒于此，本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)觀察了淫羊藿苷對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系L1210細(xì)胞去對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響，為臨床發(fā)掘治療急性淋巴細(xì)胞白血病的新藥提供實(shí)驗(yàn)參考?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)DBA/2近交系小鼠60只，雌雄各半，8～10周齡，體質(zhì)量25.50～27.50 g。動(dòng)物購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)均在人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 ，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（鄂）2017-0031。

1.2 藥物及試劑

淫羊藿苷購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自賽默飛公司；RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2單克隆抗體（Bcl-2）、磷酸化蛋白激酶（p-Akt）、PTEN、Akt檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司。急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系L1210購(gòu)自上海爾頓生物科技有限公司。

1.3 L1210細(xì)胞培養(yǎng)及調(diào)制

將L1210細(xì)胞培養(yǎng)瓶移入超菌臺(tái)，加RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后棄去培養(yǎng)液進(jìn)行傳代，用PBS液洗2次，向瓶底加2.0 mL胰蛋白酶液，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化，待細(xì)胞大部分變圓后吸取胰蛋白酶，加6 mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液輕輕吹打，使細(xì)胞成單個(gè)懸浮狀態(tài)，轉(zhuǎn)移到含10%胎牛血清、100 mg/L鏈霉素和100 U/mL青霉素G的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)條件：要求培養(yǎng)箱飽和濕度、37℃并通5%CO2，每2～4天加入30%體積的新鮮培養(yǎng)基。注射前收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期L1210細(xì)胞，1500 r/min離心5 min，棄去上清，用無血清的DMEM 重懸細(xì)胞，再次離心 5 min（1500 r/min），細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)制成1×107個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。

1.4 造模與分組

參照文獻(xiàn)［8］，取近交系DBA/2小鼠60只，將上述調(diào)制好的L1210細(xì)胞懸液，按每鼠0.1 mL劑量于右側(cè)腹部皮下注射以建立L1210白血病模型，1周后即可成模。然后將小鼠用數(shù)字表編號(hào)后隨機(jī)均分為模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組、淫羊藿苷2.5 mL/kg組、淫羊藿苷5 mL/kg組和淫羊藿苷10 mL/kg組，每組12只。

1.5 給藥方法

5組小鼠均于皮下注射L1210細(xì)胞懸液1周后進(jìn)行相應(yīng)的干預(yù)性治療。其中淫羊藿苷2.5 mL/kg組、5 mL/kg組和10 mL/kg組分別灌胃給予相應(yīng)劑量的淫羊藿苷（8 mg/mL）治療，模型對(duì)照組灌胃0.9%氯化鈉注射液，陽性對(duì)照組按0.2 mL/kg的劑量灌胃PI3K/Akt抑制劑 LY294002（500 μmL/L）作對(duì)照。 均每日灌胃治療1次，共治療3周。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.6.1 靜脈血血象檢測(cè) 斷尾取小鼠靜脈血約0.05 mL，采用人工計(jì)數(shù)法檢測(cè)白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類，包括L1210細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、白細(xì)胞總數(shù)。

1.6.2 Westem blot檢測(cè)Bcl-2及p-Akt蛋白表達(dá)取血后處死動(dòng)物，仔細(xì)摘取小鼠肝、脾，剪碎并制成組織勻漿液，采用Westem blot檢測(cè)Bcl-2及p-Akt蛋白表達(dá)。檢測(cè)時(shí)取上述標(biāo)本，用聚丙烯酰胺凝膠電泳、濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，用5%脫脂奶粉封閉，然后加一抗Bcl-2及p-Akt，4℃孵育，過夜后TBST洗滌3次，加二抗，室溫下?lián)u床孵育60 min，TBST洗滌7 min，滴加ECL發(fā)光液，避光反應(yīng)曝光5 min顯影，以β-actin為內(nèi)參，用Image J軟件分析上述凝膠電泳目標(biāo)條帶光密度值。

1.6.3 RT-PCR檢測(cè)Akt和PTEN基因表達(dá) PCR擴(kuò)增引物序列用pfimer5軟件設(shè)計(jì)，標(biāo)本總RNA用RNA抽提試劑盒一步法提取，并以β-actin為內(nèi)參，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行半定量分析。其中Akt上游引物：5′-CAGG AATCCAAATGCAGGGGTA-3′。 下游引物：5′-ATCGGACGAAACATCGGTA-3′。 β-actin 上游引物：5′-CACAAAGGGCATGGAAAGATGTC-3′。 下游引物：5′-AC CTACGGGATGGTAACGCGATC-3′。 擴(kuò)增長(zhǎng)度 260 bp；PTEN 上游引物：5′-ACCCAAATACCCGGTCCTA-3′。下游引物 5′-GCTAAGCCTCATGGACC′GACG-3′：擴(kuò)增長(zhǎng)度 270 bp；β-actin 上游引物：5′-CCAGCCACCGACCAGAAGTGAC-3′，下游引物：5′-AGCCTACCTAA TGGTCCCGCAAGAC-3′。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性 5 min；然后94℃變性30 s；56℃退火30 s；72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，取10 μL PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描，以目的基因灰度值/β-actin灰度值之比值表示相應(yīng)基因的OD值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 各組小鼠存活數(shù)、體質(zhì)量、肝脾質(zhì)量和皮下瘤質(zhì)量比較

見表1。在治療前，5組小鼠均長(zhǎng)有皮下瘤，至治療結(jié)束時(shí)，陽性對(duì)照組小鼠存活數(shù)、體質(zhì)量、肝脾和皮下瘤質(zhì)量與模型對(duì)照組比較（P＜0.05）。2.5 mL/kg組、5 mL/kg組和10 mL/kg組小鼠存活數(shù)、體質(zhì)量、肝脾和皮下瘤重與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。3個(gè)淫羊藿苷組組間比較無差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組小鼠存活數(shù)、體質(zhì)量、肝脾和皮下瘤質(zhì)量比較（±s）

表1 各組小鼠存活數(shù)、體質(zhì)量、肝脾和皮下瘤質(zhì)量比較（±s）

與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05。

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2.2 各組小鼠尾靜脈血細(xì)胞分類及血象比較

見表2。經(jīng)FCM檢測(cè)，陽性對(duì)照組小鼠尾靜脈血細(xì)胞淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞和L1210細(xì)胞總數(shù)均明顯降低，而中性粒細(xì)胞升高，與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。淫羊藿苷2.5 mL/kg組、淫羊藿苷5 mL/kg組和淫羊藿苷10 mL/kg組小鼠尾靜脈血細(xì)胞淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞和L1210細(xì)胞總數(shù)均明顯降低，而中性粒細(xì)胞升高，與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。且上述指標(biāo)中，5 mL/kg組與 2.5 mL/kg組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；淫羊藿苷10 mL/kg與淫羊藿苷5 mL/kg組和淫羊藿苷2.5 mL/kg組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組小鼠尾靜脈血細(xì)胞分類及血象比較（±s）

表2 各組小鼠尾靜脈血細(xì)胞分類及血象比較（±s）

與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05；與淫羊藿苷2.5 mL/kg組比較，△P＜0.05；與淫羊藿苷5 mL/kg組比較，▲P＜0.05。 下同。

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2.3 各組小鼠Bcl-2及p-Akt蛋白表達(dá)相對(duì)表達(dá)量的比較

見表3。模型對(duì)照組Bcl-2及p-Akt蛋白高表達(dá)。而陽性對(duì)照組和淫羊藿苷2.5 mL/kg組、5 mL/kg組和10 mL/kg組Bcl-2及p-Akt蛋白明顯降低表，與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。淫羊藿苷2.5 mL/kg組、5 mL/kg組和10 mL/kg組Bcl-2及p-Akt蛋白呈劑量依賴性，淫羊藿苷5 mL/kg組與2.5mL/kg組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；淫羊藿苷10 mL/kg與5 mL/kg組與2.5 mL/kg組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組小鼠Bcl-2及p-Akt蛋白表達(dá)相對(duì)表達(dá)量比較（β-actin，±s）

表3 各組小鼠Bcl-2及p-Akt蛋白表達(dá)相對(duì)表達(dá)量比較（β-actin，±s）

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2.4 淫羊藿苷對(duì)PTEN mRNA和Akt mRNA蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

見表4。與模型對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組和淫羊藿苷2.5 mL/kg組、5 mL/kg組和 10 mL/kg組 Akt mRNA蛋白表達(dá)水平顯著降低，PTEN mRNA則高表達(dá) （P＜0.05）。淫羊藿苷2.5 mL/kg組、5 mL/kg組和10 mL/kg組PTEN mRNA和Akt mRNA蛋白呈劑量依賴性，淫羊藿苷5 mL/kg組與2.5 mL/kg組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；淫羊藿苷10 mL/kg與5 mL/kg組和2.5 mL/kg組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 各組小鼠PTEN mRNA和Akt mRNA蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（%，±s）

表4 各組小鼠PTEN mRNA和Akt mRNA蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（%，±s）

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3 討 論

PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路在機(jī)體生理功能中，作為經(jīng)典信號(hào)通路之一，除可介導(dǎo)正常細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活，在淋巴瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病等細(xì)胞增殖及凋亡方面起關(guān)鍵作用［9］。研究表明，被激活PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路會(huì)促使下游Akt磷酸化（p-Akt），而p-Akt通過誘導(dǎo)磷酸化凋亡調(diào)節(jié)蛋白和抗凋亡蛋白表達(dá)并間接產(chǎn)生抗細(xì)胞凋亡作用［10］。因此，尋找抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的中藥有一定的研究意義。

在本研究中，2.5 mL/kg組、5 mL/kg組和10 mL/kg組小鼠肝、脾組織Bcl-2、p-Akt蛋白和AKT mRNA蛋白表達(dá)水平顯著降低，PTEN蛋白和PTEN mRNA則高表達(dá)，且這種作用呈劑量依賴性。Akt主要分布于細(xì)胞內(nèi)核、線粒體、微粒體和胞液中，在細(xì)胞存活和凋亡中起重要作用，因該激酶被證明是反轉(zhuǎn)錄病毒基因v-Akt的編碼產(chǎn)物，故又稱 Akt［11］。PTEN 為新發(fā)現(xiàn)的重要的抑癌基因，PTEN為脂質(zhì)磷酸酶及蛋白磷酸酶的活化酶，具有拮抗酪氨酸激酶的作用，在Akt磷酸化的過程中發(fā)揮抑制作用，從而產(chǎn)生抑制腫瘤生長(zhǎng)和侵襲效應(yīng)［12］。 另外，在 PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路中，PI3K 可通過激活A(yù)kt來調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)周期及細(xì)胞遷移、代謝，而PTEN基因低表達(dá)能激活PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路，造成細(xì)胞凋亡衰減現(xiàn)象［13］。臨床檢測(cè)表明，兒童AmL的骨髓標(biāo)本中PTEN蛋白表達(dá)缺失，從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，淫羊藿苷吸收后可調(diào)節(jié)PTEN的活性，提高其蛋白表達(dá)，高表達(dá)的PTEN可通過拮抗酪氨酸激酶而降低Akt磷酸化，從而發(fā)揮抑制腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲作用［14］。Bcl-2為白血病凋亡相關(guān)基因，受PTEN調(diào)控，在腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)傳導(dǎo)通路中，主要通過高表達(dá)的PTEN下調(diào)Bcl-2基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)［15］。在本實(shí)驗(yàn)中，小鼠肝、脾組織Bcl-2表達(dá)下調(diào)可能是通過PTEN下調(diào)Bcl-2基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞凋亡作用，而淫羊藿苷明顯提高PTEN蛋白及其基因表達(dá)，證實(shí)淫羊藿苷是通過影響PI3K/Akt信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系L1210細(xì)胞增殖的抑制作用。

另外，與模型對(duì)照組比較，2.5 mL/kg組、5 mL/kg組和10 mL/kg組尾靜脈血細(xì)胞淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞和L1210細(xì)胞總數(shù)均明顯降低，而中性粒細(xì)胞升高，至治療結(jié)束時(shí)3中藥組小鼠存活數(shù)、體質(zhì)量、肝脾和皮下瘤質(zhì)量與模型對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.05）。這一結(jié)果證實(shí)淫羊藿苷具有肯定的抗急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系L1210細(xì)胞作用。同時(shí)，為證實(shí)淫羊藿苷對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的抑制作用，本實(shí)驗(yàn)還用PI3K/Akt抑制劑LY294002作為陽性對(duì)照組。LY294002為PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制劑，可通過阻斷PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路來實(shí)現(xiàn)抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移［16-17］。在本實(shí)驗(yàn)中，陽性對(duì)照組對(duì) PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路產(chǎn)生明顯的抑制作用，而淫羊藿苷2.5 mL/kg組、5 mL/kg組和10 mL/kg組均產(chǎn)生與陽性對(duì)照組相同的作用，這種作用雖然沒有LY294002的作用強(qiáng)，但在本觀察中，這一作用所檢測(cè)到所有相關(guān)指標(biāo)均與模型對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這進(jìn)一步證實(shí)淫羊藿苷也具有抑制PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路的藥理作用，且在實(shí)驗(yàn)中這種作用呈劑量依賴性。

綜上所述，淫羊藿苷呈劑量依賴性地阻斷PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路而實(shí)現(xiàn)抑制L1210細(xì)胞增殖效應(yīng)，這一結(jié)果為后期開發(fā)治療急性淋巴細(xì)胞白血病的新藥提供了一定的活體實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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