采用氣相色譜法建立氟[18F]脫氧葡糖注射液中有機(jī)溶劑殘留的測(cè)定方法及其方法不確定度的評(píng)價(jià)

陳立光 梁明泉 鄧慶榮 羅 文

1.深圳市保健委員會(huì)辦公室PET/CT診斷中心，廣東深圳 518020；2.中國(guó)廣州分析測(cè)試中心，廣東廣州 510070

PET/CT顯像已成為核醫(yī)學(xué)發(fā)展的新“亮點(diǎn)”，18F標(biāo)記的2-去氧-2-18F氟-D-葡萄糖注射液（18F-FDG）被認(rèn)為是本世紀(jì)很有價(jià)值的放射性藥物。18F-FDG屬于正電子類放射性診斷用藥，目前臨床廣泛應(yīng)用于PET/CT腫瘤診斷中，經(jīng)過(guò)在國(guó)內(nèi)近20年的臨床試用，《中國(guó)藥典（二部）》（2015版）開始將18F-FDG收載為氟[18F]脫氧葡糖注射液[1]。隨著我國(guó)PET/CT掃描儀普及以及回旋加速器藥物生產(chǎn)系統(tǒng)投入使用，氟[18F]脫氧葡糖注射液的制備、藥品質(zhì)量控制和用藥安全越來(lái)越受到國(guó)家藥監(jiān)部門的重視。氟[18F]脫氧葡糖注射液是當(dāng)前臨床上正電子發(fā)射斷層顯像（PET）技術(shù)最常用的示蹤劑[2-4]，18F-FDG在PET中的用量占到了95%以上[5]。18F-FDG制備工藝多通過(guò)計(jì)算機(jī)控制的自動(dòng)化有機(jī)合成和純化制備，而在制備工藝中多采用有機(jī)溶劑乙腈、乙醇等[1，6]，最終產(chǎn)品的有機(jī)溶劑殘留不可避免，因此對(duì)有機(jī)溶劑殘留的質(zhì)量控制尤為重要。按照2015年版《中國(guó)藥典》對(duì)殘留溶劑的限度要求[7]，第二類溶劑中乙腈的殘留限度為0.041%，第三類溶劑乙醇的限度為0.50%。本研究主要探究氣相色譜分析法對(duì)18F-FDG產(chǎn)品的有機(jī)溶劑殘留進(jìn)行分析。建立一種對(duì)氟[18F]脫氧葡糖注射液中乙腈、乙醇兩種有機(jī)溶劑的殘留量進(jìn)行快速、定量測(cè)定的方法，用于日常生產(chǎn)中對(duì)氟[18F]脫氧葡糖注射液的質(zhì)量控制，具體報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器設(shè)備 Eclipse RD 型Cyclotron 回旋加速器（西門子公司）；藥物生產(chǎn)系統(tǒng)（專利研發(fā)，發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)枺?0171068609.4）；BBS1 38B1B/1型合成防護(hù)防護(hù)熱室，COMECER 公司產(chǎn)品；CRC-15R 型活度計(jì)（美國(guó)CAPINTEC公司生產(chǎn)）；Agilent 6820型氣相色譜儀：Agilent公司，氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）氮磷檢測(cè)器（NPD）檢測(cè)器，QA/QC Cerity工作站，毛細(xì)管柱SUPELCOSPB-5（30m×0.25mm×0.25um）； 精 密 電 子 天 平（Sartorius公司）；SW-CJ-1D型凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.1.2 試劑 H218O：豐度95%（ABX公司產(chǎn)品）；2-三氟甲基磺?；?F-D甘露糖（三氟甘露糖），Kryptofix2.2.2（K2.2.2），無(wú)水乙腈、無(wú)水乙醇（UPS級(jí)）（均 為 Sigma-Aldrich公 司）；QMA柱，Alumin-N柱，C18柱（Waters公司）；AG50樹脂和AG11A8樹脂：50 ～ 100目（Bio-Rad公司出品）；HPLC級(jí)去離子水，自備；壓縮空氣，高純氫氣及氮?dú)猓ㄉ钲诼?lián)華氣體有限公司產(chǎn)品）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 氟[18F]脫氧葡糖注射液的制備

氟[18F]脫氧葡糖注射液的制備包括標(biāo)準(zhǔn)的六個(gè)步驟。（1）首先是18F-負(fù)離子的產(chǎn)生。從18O富氧水開始，通過(guò)p-n核反應(yīng)，18O原子核俘獲一個(gè)質(zhì)子的同時(shí)發(fā)射一個(gè)中子而產(chǎn)生18F-負(fù)離子。這一步依賴于回旋加速器；（2）俘獲和釋放18F-負(fù)離子。這一步基于離子交換的原理；（3）反應(yīng)活性18F-負(fù)離子的制備。這一步的主要目的是通過(guò)乙腈和水的共沸原理移除反應(yīng)體系中的水分，保證第4步的標(biāo)記反應(yīng)體系嚴(yán)格要求在疏水的溶液體系中進(jìn)行；（4）反應(yīng)活性放射性18F-負(fù)離子和 1，3，4，6-四-O-乙?；?2-O-三氟甲磺酰-β-d-吡 喃 甘 露 糖（1，3，4，6-Tetra-O-acetyl-2-O-trifluoromethanesulfonyl-β-D-mannopyranose）發(fā)生親核反應(yīng)，產(chǎn)生18F-負(fù)離子輻射標(biāo)記的甘露糖三氟磺酸酯；（5）水解移除乙?；Ｗo(hù)基團(tuán)。（6）純化產(chǎn)物，這一步移除各種中間產(chǎn)物并作無(wú)菌、無(wú)熱源等純化處理，使用0.22μm濾膜過(guò)濾得到氟[18F]脫氧葡糖注射液，并將其收集于無(wú)菌真空瓶中。

2.2 氣相分析條件

分離柱：SUPELCO SPB-5型毛細(xì)管柱，高純氮?dú)鈮毫υO(shè)置為50kPa，空氣壓力設(shè)置為50kPa，高純氫氣壓力設(shè)置為100kPa，SPB-5毛細(xì)管分離柱的溫度設(shè)置為60℃，F(xiàn)ID監(jiān)測(cè)器溫度設(shè)置為150℃，氣化室溫度設(shè)置為150℃。高純氫氣20mL/min，空氣300mL/min，和高純氮?dú)?0mL/min；檢測(cè)后得到標(biāo)準(zhǔn)峰面積，并以峰面積為縱坐標(biāo)，有機(jī)溶劑濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析。乙腈和乙醇的標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備采用相同方法，并繪制各自的線性工作曲線。

2.3 工作曲線的建立

使用精密電子天平稱取200.00mg乙腈，將其放置于50mL容量瓶中，加水定容，搖勻，得到標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為4.000g/L。使用移液管移取上述標(biāo)準(zhǔn)品 10.0、5.0、2.5、0.5mL 至 20mL 容量瓶中，加水定容，搖勻，分別得到濃度為 2.00、1.00、0.50、0.10g/L溶液，然后按照2.2的氣相條件分別進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)， 進(jìn)樣量為2μL，檢測(cè)后得到標(biāo)準(zhǔn)峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度作為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)峰面積作為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程及線性及工作曲線；每個(gè)樣品進(jìn)樣兩次，取平均值。

2.4 系統(tǒng)回收率與重復(fù)性的測(cè)定

根據(jù)2.3中建立的方法，配制乙腈和乙醇有機(jī)溶液，取濃度為0.80g/L的乙腈和乙醇標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)溶液，進(jìn)行氣相分析，測(cè)定5次，且每次進(jìn)樣量相同，計(jì)算平均值，并使用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算濃度，得出回收率。再取濃度為0.80g/L的乙腈和乙醇標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)溶液，相同條件下測(cè)量10次，檢測(cè)系統(tǒng)重復(fù)性。

2.5 18F-FDG有機(jī)溶劑殘留的氣相色譜法檢測(cè)

按照2.2的分析條件，分別對(duì)隨機(jī)抽取5批次的氟[18F]脫氧葡糖注射液進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得到氟[18F]脫氧葡糖注射液中乙腈和乙醇的有機(jī)殘留量。

3 結(jié)果與討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品有機(jī)溶劑的線性關(guān)系

通過(guò)對(duì)兩種有機(jī)殘留溶劑含量的氣相分析，測(cè)定其峰面積。繪制線性工作曲線，其中橫坐標(biāo)是標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，縱坐標(biāo)則為峰面積。得到其曲 線方 程分 別 為：y=2287.6X-47.644，r=0.9994；y=1366.5X+85.821，r=0.9995； 線性范圍為0.10～2.00g/L。該結(jié)果說(shuō)明兩種溶劑的峰面積與濃度的線性關(guān)系良好。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)溶劑氣相檢測(cè)

兩種標(biāo)準(zhǔn)品溶液的氣相色譜圖見圖1，分析時(shí)間為15min。按照保留時(shí)間順序依次為乙醇、乙腈，其中乙醇的保留時(shí)間為1.84min；乙腈依次為的保留時(shí)間為2.04min；兩種溶劑的檢測(cè)均可在10min內(nèi)完成。信噪比按照3倍來(lái)計(jì)算，可測(cè)的最低檢測(cè)濃度為0.031g/L，以進(jìn)樣量為2μL進(jìn)行計(jì)算，在該檢測(cè)分離條件下，乙腈和乙醇的最低檢測(cè)線分別為0.22μg、0.20μg。

圖1 乙腈和乙醇的標(biāo)準(zhǔn)色譜圈

3.3 系統(tǒng)回收率和精密度

5次測(cè)量的平均值及回收率的測(cè)量通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行計(jì)算，經(jīng)計(jì)算，得出乙醇和乙腈的平均值分別為0.078、0.079g/L，回收率分別為98.7%、98.4%。平均值及回收率結(jié)果說(shuō)明系統(tǒng)具有良好的準(zhǔn)確性。采用該系統(tǒng)條件對(duì)10批次樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，乙腈和乙醇的含量 分 別 為（0.078±0.02），（0.079±0.03）g/L，說(shuō)明系統(tǒng)測(cè)量重復(fù)性良好，精密度可以滿足檢測(cè)要求。

3.4 樣品分析

隨機(jī)抽取5批次制備的氟[18F]脫氧葡糖注射液樣品，按照2.3氣相條件進(jìn)行檢測(cè)，兩種殘留溶劑的檢測(cè)結(jié)果見表1。由表1可見雖然不同批次中殘留溶劑含量不同，但是均未超過(guò)《中國(guó)藥典》2015 年版四部對(duì)氟[18F]脫氧葡糖注射液的質(zhì)量控制要求規(guī)定的含量（第二類溶劑中乙腈的殘留限度為0.041%，第三類溶劑乙醇的限度為0.50%。）[7]，同時(shí)也符合美國(guó)藥典的標(biāo)準(zhǔn)[8]，因此可以認(rèn)為該藥品中的殘留溶劑含量標(biāo)準(zhǔn)相同均為0.50%。

表1 5批次氟[18F]脫氧葡糖注射液中有機(jī)殘留乙醇、乙腈的含量

3.5 氟[18F]脫氧葡糖注射液中有機(jī)溶劑殘留的測(cè)定方法的不確定度

（1）不確定度的來(lái)源分析。本研究所采用的分析方法的不確定度來(lái)源主要有：①色譜柱；②氣化室和檢測(cè)器；③乙腈濃度；④人員操作；⑤儀器本身的穩(wěn)定性。

（2）不確定度分析。①色譜柱：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，色譜柱的柱溫、柱效均會(huì)對(duì)兩種物質(zhì)的分離效果產(chǎn)生影響，而不同類型的柱子直接關(guān)系到該兩種有機(jī)物質(zhì)能否有效分離。有研究指出，乙腈、在極性較小的柱子上較難分離，出峰時(shí)間無(wú)法分開[9-10]。②氣化室和檢測(cè)器：氣化室的溫度不宜過(guò)高，當(dāng)其溫度高于120℃時(shí)，會(huì)使待測(cè)樣品的保留時(shí)間縮短[11]，但是不會(huì)對(duì)樣品的檢測(cè)造成影響。③乙腈濃度引起的不確定度：經(jīng)驗(yàn)表明：在制備氟[18F]脫氧葡糖注射液的過(guò)程中，乙腈起到很重要的作用，主要用作反應(yīng)前體以及催化劑穴醚的溶劑[12-13]，而大部分作為載體的乙腈會(huì)在和水的共沸蒸發(fā)、親和反應(yīng)和后續(xù)的高溫蒸發(fā)過(guò)程被除掉，因此，反應(yīng)過(guò)程中乙腈的最終濃度可以對(duì)整個(gè)反應(yīng)起到一定的反應(yīng)性。④人員操作：不同工作人員的工作態(tài)度不同，且操作以及稱量樣品的習(xí)慣均會(huì)有所差異[14-15]，因此盡量由一位工作人員完成。⑤儀器本身的穩(wěn)定性引起的不確定度：由于氣相過(guò)于靈敏，因此極易出現(xiàn)損壞，所以在使用前需要校準(zhǔn)[16]。

4 結(jié)論

乙腈和乙醇溶劑是制備氟[18F]脫氧葡糖注射液過(guò)程中無(wú)法避免的有機(jī)殘留物，乙腈被美國(guó)藥典規(guī)定為二類限制使用溶劑，乙醇在美國(guó)藥典中為三類溶劑，且均對(duì)其殘留量進(jìn)行了限定；我國(guó)《中國(guó)藥典》2015年版四部對(duì)氟[18F]脫氧葡糖注射液的質(zhì)量控制要求規(guī)定的含量，該藥品殘留溶劑測(cè)定法采用通則0861第一法進(jìn)行試驗(yàn)。在氣相色譜檢測(cè)中，如果檢測(cè)器為帶氫火焰檢測(cè)器（FID），則乙腈和乙醇的殘留量應(yīng)分別低于0.04%和0.5%，而且中國(guó)藥典中規(guī)定氣相檢測(cè)須在藥品使用前完成。本次檢測(cè)結(jié)果顯示，雖然氟[18F]脫氧葡糖注射液的終產(chǎn)品中乙腈和乙醇的含量高低不同，但均沒有超出《中國(guó)藥典》2015 年版四部對(duì)氟[18F]脫氧葡糖注射液的質(zhì)量控制要求，證明了合成藥品的質(zhì)量完全符合臨床用藥標(biāo)準(zhǔn)。另外采用氣相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，可以準(zhǔn)確的對(duì)氟[18F]脫氧葡糖注射液的中的有機(jī)殘留量進(jìn)行測(cè)定，而且檢測(cè)時(shí)間僅為10min。該檢測(cè)方法簡(jiǎn)單迅速，尤其適用于半衰期短的PET示蹤劑藥物，為臨床用藥安全提供了保障。

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