HE 4在上皮性卵巢癌中的表達(dá)情況及其與臨床特征及預(yù)后的關(guān)系分析

黨秋紅，曹靜，張歡歡，曾憲旭，靳耀鋒

1鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院病理科，鄭州450052

2西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科，西安710004

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌，且其組織成分復(fù)雜，是類型最多的原發(fā)性腫瘤，包括上皮性腫瘤、性索/間質(zhì)腫瘤和生殖細(xì)胞腫瘤等，其中上皮性卵巢癌所占比例最大[1]。卵巢癌的發(fā)病一般比較隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已是腫瘤晚期，預(yù)后相對(duì)較差，故尋找一種可靠的早期診斷方法十分重要[2]。卵巢癌的診斷有多種方法，包括婦科三合診（陰道、直腸及腹部），經(jīng)陰道多普勒彩色超聲，影像學(xué)檢查如CT、MRⅠ、正電子發(fā)射斷層掃描（positron emission tomography，PET）等，以及腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)如糖類抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）及CA19-9等[3]。其中CA125檢測(cè)是卵巢癌最常見的早期篩查方法，尤其是上皮性卵巢癌患者對(duì)其更為敏感，但其對(duì)組織的特異度相對(duì)較差，且對(duì)早期腫瘤的敏感度有限，故尋找一種高敏感、高特異度的新型腫瘤標(biāo)志物是所有婦科腫瘤研究者的重要目標(biāo)[4]。人附睪上皮分泌蛋白4（human epididymis protein 4，HE4）是一種分泌型糖蛋白，在各種惡性腫瘤組織中均異常表達(dá)，提示其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系[5]。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELⅠSA）和免疫組織化學(xué)法（immunohistochemistry，ⅠHC）檢測(cè)卵巢癌組織中HE4的表達(dá)情況，分析其與臨床特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2009年3月至2014年3月于鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院診治的150例上皮性卵巢癌患者和72例良性卵巢疾病患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①上皮性卵巢癌患者的臨床表現(xiàn)和病理學(xué)檢查結(jié)果均符合上皮性卵巢癌的診斷（依據(jù)《婦產(chǎn)科學(xué)》第7版[6]）；②上皮性卵巢癌患者均于鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院首診，且術(shù)前未經(jīng)任何放化療；③病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①依從性差；②放化療過敏；③有手術(shù)絕對(duì)禁忌證。150例上皮性卵巢癌患者的年齡為24～68歲，平均為（42.32±9.05）歲；依據(jù)1988年國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FⅠGO）分期標(biāo)準(zhǔn)[7]，病理分期：Ⅰ～Ⅱ期78例，Ⅲ～Ⅳ期72例。72例良性卵巢疾病患者的年齡為22～65歲，平均為（41.73±9.79）歲。兩組患者的年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 檢測(cè)方法

HE4兔抗人單克隆抗體（一抗）購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，抗兔抗體（二抗）和DAB酶底物顯色劑購(gòu)于美國(guó)Dako公司，HE4 ELⅠSA試劑盒購(gòu)于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2.1 ELISA法檢測(cè)血清HE 4水平 收集治療前后上皮性卵巢癌和良性卵巢疾病患者的空腹靜脈血5 ml，置于EDTA抗凝管中，3000 r/min離心5 min，取上清。然后采用ELⅠSA法檢測(cè)兩組患者的血清HE4水平，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書進(jìn)行。

1.2.2 IHC法檢測(cè)腫瘤組織中HE 4表達(dá)情況 ⅠHC的原理是一種抗原抗體反應(yīng)，可用于蛋白的定位、定性及相對(duì)定量的研究，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于腫瘤診斷，是發(fā)現(xiàn)腫瘤最新蛋白最實(shí)際的“金標(biāo)準(zhǔn)”。本研究采用ⅠHC法檢測(cè)HE4在150例上皮性卵巢癌患者的癌組織和相應(yīng)癌旁正常組織中的表達(dá)情況，具體步驟如下：①烤片，常規(guī)石蠟切片，切片厚度為3～5μm，60℃烤片3～4 h。②脫蠟入水，二甲苯脫蠟2遍，各10 min；梯度乙醇（100%、95%、85%、75%）脫二甲苯入水，各3 min；蒸餾水洗3遍，各3 min。③內(nèi)源性過氧化物酶阻斷，H2O2加甲醇，10 min，注意避光。④抗原修復(fù)，玻片標(biāo)本置于盛有檸檬酸修復(fù)液的高壓鍋中，電磁爐加熱至沸騰，改檔并保持在130 kW，15 min，然后自然冷卻至常溫，30～40 min；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗3遍，各3 min。⑤添加一抗，滴加兔抗人HE4多克隆抗體（一抗）（1∶100稀釋），4℃濕盒內(nèi)過夜；PBS洗3遍，各4 min。⑥添加二抗，37 ℃濕盒內(nèi)孵育15～20 min；PBS洗3遍，各4 min。⑦二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，添加DAB酶底物顯色劑，顯微鏡下觀察，控制顯色反應(yīng)1 min左右，蒸餾水洗2遍，各4 min。⑧蘇木素復(fù)染、封片，將玻片置于蘇木素染色液進(jìn)行復(fù)染1 min（每次需要將漂浮的氧化膜去掉），然后用流水沖洗5～7 min，再放入梯度乙醇（95%、85%、75%）中各1 min，二甲苯透明，中性樹膠封片。

HE4蛋白陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)呈黃色或棕黃色。判定方法采用雙盲法[8]：染色強(qiáng)度×陽性細(xì)胞百分比。在同一個(gè)物鏡視野下，一位病理科高級(jí)職稱醫(yī)師負(fù)責(zé)染色強(qiáng)度判斷：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；另一位病理科高級(jí)職稱醫(yī)師負(fù)責(zé)陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)：未見陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞占所有細(xì)胞百分比≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。染色強(qiáng)度×陽性細(xì)胞百分比≥3分為HE4蛋白陽性表達(dá)。

1.3 隨訪方法

上皮性卵巢癌患者的隨訪時(shí)間截至患者死亡或2017年3月，隨訪時(shí)間為36個(gè)月，隨訪方式包括電話隨訪、上門隨訪和門診復(fù)診等，了解患者的生存情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析或SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；繪制生存曲線采用Kaplan-Meier法，生存率比較采用Logrank檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清HE 4水平

Ⅰ～Ⅱ、Ⅲ～Ⅳ期上皮性卵巢癌患者的血清HE4平均水平分別為（216.93±57.39）、（245.19±63.28）pmol/L，均明顯高于良性卵巢疾病患者的（164.06±50.17）pmol/L，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；且Ⅲ～Ⅳ期上皮性卵巢癌患者的血清HE4平均水平高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 HE 4蛋白的表達(dá)情況

上皮性卵巢癌患者的癌組織中HE4蛋白的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 上皮性卵巢癌患者的癌組織與相應(yīng)癌旁正常組織中HE 4蛋白陽性表達(dá)率的比較

2.3 上皮性卵巢癌組織HE 4蛋白表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

腫瘤直徑＞3 cm、低分化、Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的上皮性卵巢癌組織HE4蛋白的陽性表達(dá)率分別高于腫瘤直徑≤3 cm、中高分化、Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征的上皮性卵巢癌患者HE 4蛋白的陽性表達(dá)率的比較

2.4 上皮性卵巢癌患者的HE 4蛋白表達(dá)與生存情況的關(guān)系

隨訪36個(gè)月，HE4蛋白陽性表達(dá)的上皮性卵巢癌患者的生存率為22.08%，低于陰性表達(dá)患者的 60.17%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義（χ2=7.946，P=0.028）。（圖1）

3 討論

圖1 HE 4陽性、陰性表達(dá)的上皮性卵巢癌患者的生存曲線圖

HE4蛋白是WFDC2基因的產(chǎn)物，該基因位于染色體20q12-13.1上，屬于WAP家族。近年，有研究顯示HE4在早、晚期卵巢癌患者的診斷和鑒別診斷中具有較高的特異度和靈敏度[9]。Moore等[10]發(fā)現(xiàn)，HE4在早期卵巢癌診斷和鑒別診斷中的靈敏度優(yōu)于CA125，與其他腫瘤標(biāo)志物比較，HE4蛋白是最佳的單項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)，但若其與其他標(biāo)志物（CA125最佳）聯(lián)合，卵巢癌診斷的敏感度和特異度最高。有研究證明，HE4在卵巢癌組織中特異度高，良性卵巢組織中低，且與臨床特征及預(yù)后有密切的關(guān)系，有望成為早期診斷和監(jiān)測(cè)卵巢癌預(yù)后的重要指標(biāo)[11]。本研究中，上皮性卵巢癌患者的血清HE4水平明顯高于良性卵巢疾病患者，上皮性卵巢癌Ⅲ～Ⅳ期患者的血清HE4水平高于Ⅰ～Ⅱ期患者（P＜0.05），說明HE4不僅可鑒別良性卵巢疾病與上皮性卵巢癌，還可較好地反映腫瘤的發(fā)展趨勢(shì)。本研究還發(fā)現(xiàn)，HE4表達(dá)情況與腫瘤直徑、分化程度、FⅠGO分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），說明HE4表達(dá)與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移有關(guān)，這與莊慧宇等[12]的研究結(jié)果基本一致，提示HE4有望成為上皮性卵巢癌患者早期診斷、個(gè)體化治療的重要指標(biāo)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，HE4蛋白陽性表達(dá)的上皮性卵巢癌患者的生存率低于陰性表達(dá)的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這與王靜等[13]的研究結(jié)果基本一致，提示HE4在監(jiān)測(cè)上皮性卵巢癌的預(yù)后方面有一定的研究意義。綜上所述，HE4是上皮性卵巢癌的良好腫瘤標(biāo)志物，與腫瘤的良、惡性及臨床特征有密切的關(guān)系，對(duì)上皮性卵巢癌患者的早期診斷及預(yù)后有一定的價(jià)值。

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