采用不同裝置培養(yǎng)螺旋藻的對(duì)比研究

譙順彬，董汝晶，張義明*，田 輝

（貴州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 貴陽 550008）

螺旋藻（Spirulina）是一類廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)淡水或鹽堿性湖泊中的原核微生物，因細(xì)胞形態(tài)為單細(xì)胞或多細(xì)胞構(gòu)成的螺旋形絲狀體而得名，屬于藍(lán)藻門、藍(lán)藻綱、段殖藻目、顫藻科、螺旋藻屬。螺旋藻又稱節(jié)旋藻、藍(lán)細(xì)菌[1]。目前國內(nèi)外研究較多的為鈍頂螺旋藻（Spirulina platensis）和極大螺旋藻（Spirulina maxima）兩種。螺旋藻干粉中蛋白質(zhì)含量達(dá)60%～70%，遠(yuǎn)高于目前動(dòng)植物食用蛋白含量。細(xì)胞中還含有豐富的碳水化合物、藻多糖、不飽和脂肪酸、微量元素及維生素等豐富的營養(yǎng)物質(zhì)[2]，已被聯(lián)合國糧農(nóng)組織推薦為健康食品之一。

目前，螺旋藻規(guī)?；a(chǎn)仍以光合自養(yǎng)為主，由于藻體生長(zhǎng)對(duì)地域和環(huán)境依賴性強(qiáng)，培養(yǎng)產(chǎn)率低，占地面積大，極大地阻礙了其產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。因此近年來國內(nèi)外研究人員圍繞螺旋藻培養(yǎng)方式、培養(yǎng)裝置以及功能應(yīng)用等方面開展了大量研究，使得藻體培養(yǎng)產(chǎn)率、產(chǎn)品品質(zhì)和應(yīng)用都得到了提高。在培養(yǎng)方式方面，主要是在光合自養(yǎng)基礎(chǔ)上進(jìn)行混合營養(yǎng)研究?；旌蠣I養(yǎng)即通過向培養(yǎng)基中添加適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)營養(yǎng)物來改善細(xì)胞代謝過程，降低細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)環(huán)境的依賴，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，提高產(chǎn)率和品質(zhì)[3-4]。在培養(yǎng)裝置方面，主要是進(jìn)行類型各異的光生物反應(yīng)器的研究設(shè)計(jì)[5-8]。光生物反應(yīng)器是根據(jù)光合生物或具有光和能力的組織而設(shè)計(jì)的一類裝置，除具有普通生物反應(yīng)器的基本特點(diǎn)外，還需要配置合理的光照系統(tǒng)。在功能開發(fā)方面，主要是細(xì)胞中藻藍(lán)蛋白、藻多糖、β-胡蘿卜素、γ-亞麻酸及微量元素等具有較好的保健功效和藥理作用，在調(diào)節(jié)血糖、血脂，增強(qiáng)免疫力，抗輻射、抗衰老、抗疲勞以及防癌抑癌等方面具有重要的價(jià)值[9-13]。

本試驗(yàn)采用搖瓶、全自動(dòng)發(fā)酵罐和實(shí)驗(yàn)室自制的垂直板式光生物反應(yīng)器進(jìn)行螺旋藻培養(yǎng)研究，并對(duì)培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行比較，以提高螺旋藻培養(yǎng)產(chǎn)率為目的，為研制一套經(jīng)濟(jì)高效、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、便于操作的光生物反應(yīng)器提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鈍頂螺旋藻（fachb-350）：中科院武漢水生生物研究所；

基礎(chǔ)培養(yǎng)基采用AB培養(yǎng)基：碳酸氫鈉13.61 g/L、碳酸鈉4.03 g/L、磷酸氫二鉀0.50 g/L、硝酸鈉2.50 g/L、硫酸鉀1.00 g/L、氯化鈉1.00 g/L、硫酸鎂0.20 g/L、氯化鈣0.04 g/L、維生素B120.15 μg/L、PIV金屬溶液5.00 mL、A5微量元素溶液1.00 mL、蒸餾水993 mL。

葡萄糖、硝酸銨、維生素B1、維生素B12、精氨酸、萘乙酸、氫氧化鈉、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、丙酮、酒精等試劑（均為AR級(jí)）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZWYR-240恒溫?fù)u床：上海智城分析儀器制造有限公司；BiostatC全自動(dòng)發(fā)酵罐：德國B.BraunBiotechInternational公司；光生物反應(yīng)器：由課題組設(shè)計(jì)，采用垂直板式結(jié)構(gòu)，其長(zhǎng)×寬×高分別為320mm×80mm×390mm，容積約10.0L。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 接種量試驗(yàn)研究

采用搖瓶培養(yǎng)：新鮮藻泥經(jīng)多層無菌紗布過濾后，并用無菌水反復(fù)沖洗，按照0.06g/L、0.08g/L、0.1g/L、0.12g/L、0.14 g/L、0.16 g/L、0.18 g/L、0.2 g/L不同質(zhì)量濃度分別接種到裝有150 mL新鮮培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，溫度控制（30±1）℃，轉(zhuǎn)速120 r/min，光照強(qiáng)度3.5～4.0 klx，培養(yǎng)7 d后分別測(cè)定各接種濃度的平均比生長(zhǎng)速率（μ），每個(gè)濃度做3個(gè)平行取平均值。

1.3.2 光合自養(yǎng)條件下試驗(yàn)研究

確定接種量后，在光合自養(yǎng)條件下，分別利用上述3種培養(yǎng)裝置進(jìn)行螺旋藻培養(yǎng)，對(duì)比不同裝置中藻體細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

搖瓶試驗(yàn)：AB培養(yǎng)基滅菌冷卻后接入150 mL至無菌搖瓶中，搖床培養(yǎng)。轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)為120 r/min，光照強(qiáng)度為（4.0±0.3）klx，溫度維持在（30±1）℃、初始pH 9.50±0.01，連續(xù)光照條件下培養(yǎng)12 d。

全自動(dòng)發(fā)酵罐試驗(yàn)：AB培養(yǎng)基滅菌冷卻后裝罐，裝液系數(shù)0.8，反應(yīng)器外壁處光照強(qiáng)度為（4.0±0.3）k1x，通氣攪拌轉(zhuǎn)速為120 r/min，連續(xù)光照培養(yǎng)12 d。

光生物反應(yīng)器試驗(yàn)：滅菌后的AB培養(yǎng)基接入光生物反應(yīng)器中，裝液系數(shù)0.8，反應(yīng)器外壁處光照強(qiáng)度為（4.0±0.5）k1x，溫度維持在（30±1）℃，初始pH9.50±0.01，控制通氣量為210 L/h，連續(xù)光照下培養(yǎng)12 d。培養(yǎng)過程中每天定時(shí)測(cè)定藻體生物量和培養(yǎng)液pH，并定時(shí)補(bǔ)加相同溫度的無菌水保持裝液系數(shù)恒定。

1.3.3 混合營養(yǎng)條件下試驗(yàn)研究

根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果[14]，混合營養(yǎng)條件下試驗(yàn)采用優(yōu)化培養(yǎng)基。即將AB培養(yǎng)基中碳酸氫鈉、硝酸鈉兩組分分別調(diào)整為10、3.5g/L，并依次加入葡萄糖1.242 g/L、硝酸銨0.248 g/L及維生素B10.264 mg/L，其余組分和條件與光合自養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)相同。

1.3.4 測(cè)定方法

藻體生物量的測(cè)定：采用干質(zhì)量法[15]。

藻體生物量以藻體干質(zhì)量（dry mass，DM）計(jì)算。接種后取培養(yǎng)液20 mL于已烘干至質(zhì)量恒定（干燥溫度85℃）的紙片抽濾，無菌水沖洗兩次，同溫度下再次烘干至質(zhì)量恒定，用精密電子天平稱量，按下式計(jì)算干質(zhì)量（DM）。

式中：M1為抽濾前紙片烘干質(zhì)量，g；M2為抽濾后紙片烘干質(zhì)量，g。

培養(yǎng)過程中，按上述步驟每間隔24 h取樣抽濾，計(jì)算最終藻體生物量。

pH測(cè)定：用pH-3C數(shù)字式酸度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液的pH；光照強(qiáng)度測(cè)定：用LX-101數(shù)字光度表來測(cè)定光照強(qiáng)度；藻體細(xì)胞形態(tài)檢測(cè)：用ECLIPSE-E200顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和可能的染菌情況，并采用平板涂布的方法進(jìn)行進(jìn)一步的檢查。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種量對(duì)藻體細(xì)胞比生長(zhǎng)速率的影響

接種量對(duì)藻體細(xì)胞比生長(zhǎng)速率影響的變化趨勢(shì)見圖1。由圖1可知，接種量對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖影響較大，其比生長(zhǎng)速率呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)，當(dāng)接種量＜0.1 g/L時(shí)，比生長(zhǎng)速率呈上升趨勢(shì)，而＞0.1 g/L時(shí)逐漸下降，接種量0.1 g/L時(shí)可獲得最大比生長(zhǎng)速率0.142 h-1。因此，在接下來的試驗(yàn)中均采用0.1 g/L的新鮮藻泥進(jìn)行接種培養(yǎng)。

圖1 接種量對(duì)細(xì)胞比生長(zhǎng)速率的影響Fig.1 Effect of inoculum on the specific growth rate of S.platensiscell

2.2 光合自養(yǎng)培養(yǎng)螺旋藻對(duì)比試驗(yàn)

光合自養(yǎng)條件下藻體細(xì)胞在3種裝置中的生長(zhǎng)趨勢(shì)見圖2。由圖2可知，在光合自養(yǎng)條件下，3種裝置均能滿足藻體細(xì)胞的生長(zhǎng)需求。藻體細(xì)胞在搖瓶和全自動(dòng)發(fā)酵罐中生長(zhǎng)緩慢，搖瓶培養(yǎng)至第10天時(shí)細(xì)胞生物量最大值為0.715 g/L，而全自動(dòng)發(fā)酵罐培養(yǎng)至第12天時(shí)為0.789 g/L。相比較于前兩種培養(yǎng)裝置，藻體細(xì)胞在光生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)速率更快，培養(yǎng)至第9天時(shí)細(xì)胞生物量最大值為1.277 g/L，比搖瓶培養(yǎng)最大值提高78.6%，比全自動(dòng)發(fā)酵罐培養(yǎng)結(jié)果提高61.8%，且培養(yǎng)時(shí)間可縮短1～3 d。

主要原因是光合自養(yǎng)條件下光照強(qiáng)度是細(xì)胞生長(zhǎng)的主要限制性因素，自制光生物反應(yīng)器采用垂直板式設(shè)計(jì)，材質(zhì)為4.0 mm白色玻璃，比表面積為17.98，兩邊各安裝數(shù)根12 W白光源日光燈，與反應(yīng)器外壁燈距約5 cm。在通氣情況下，藻體細(xì)胞受光照均勻，細(xì)胞生長(zhǎng)情況較好，最終培養(yǎng)產(chǎn)率較高。而搖瓶培養(yǎng)時(shí)采用水平振動(dòng)，搖床頂蓋安裝光源，光距較長(zhǎng)且細(xì)胞光照不均，細(xì)胞生長(zhǎng)較緩慢，產(chǎn)率最低。采用全自動(dòng)發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)，由于罐體直徑比搖瓶和板式光生物反應(yīng)器大，細(xì)胞間存在屏蔽效應(yīng)，且藻體細(xì)胞受光照時(shí)間和通氣攪拌轉(zhuǎn)速影響，攪拌過慢細(xì)胞機(jī)械損傷小，光照時(shí)間短細(xì)胞生長(zhǎng)較慢，攪拌過快則葉輪對(duì)細(xì)胞剪切力增加，導(dǎo)致細(xì)胞破壞嚴(yán)重，故在發(fā)酵罐中培養(yǎng)時(shí)只能選擇適合的攪拌轉(zhuǎn)速。

圖2 光合自養(yǎng)條件下藻體在3種裝置中的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curves ofS.platensisunder the condition of photoautotrophy in the three devices

2.3 混合營養(yǎng)培養(yǎng)螺旋藻對(duì)比試驗(yàn)

螺旋藻在混合營養(yǎng)條件下采用3種培養(yǎng)裝置進(jìn)行培養(yǎng)的生長(zhǎng)情況見圖3。由圖3可知，與光合自養(yǎng)相比，混合營養(yǎng)條件下3種培養(yǎng)裝置中藻體細(xì)胞生長(zhǎng)速率均有大幅提升，且3種裝置中細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)與光合自養(yǎng)條件下情況相似。光生物反應(yīng)器培養(yǎng)9 d后藻體生物量最大值為1.715 g/L，搖瓶培養(yǎng)至10 d后藻體生物量為1.613 g/L，而全自動(dòng)發(fā)酵罐培養(yǎng)12 d后藻體生物量為1.616 g/L，光生物反應(yīng)器中細(xì)胞生物量分別比搖瓶和全自動(dòng)發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)提高6.3%和6.1%。同時(shí)，3種裝置中藻體生物量最大值分別比光合自養(yǎng)條件下提高125.6%、104.8%、34.3%。

在混合營養(yǎng)條件下，由于添加了葡萄糖和其他有機(jī)營養(yǎng)成分，不僅為細(xì)胞生長(zhǎng)提供了一定的能源，而且對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有調(diào)節(jié)功能，有利于降低細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)光照的依賴。在培養(yǎng)前期藻體細(xì)胞主要進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng)，待添加的葡萄糖消耗殆盡時(shí)，細(xì)胞才逐步開始轉(zhuǎn)為光合自養(yǎng)生長(zhǎng)。

圖3 混合營養(yǎng)條件下藻體在3種裝置中的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curves ofS.platensisunder the conditions of mixotrophy in the three devices

2.4 細(xì)胞形態(tài)及染菌情況觀察

在光合自養(yǎng)和混合營養(yǎng)兩種條件下，分別對(duì)細(xì)胞形態(tài)及染菌情況進(jìn)行觀察，結(jié)果見圖4。

圖4 在光合自養(yǎng)和混合營養(yǎng)兩種培養(yǎng)條件下藻體細(xì)胞形態(tài)Fig.4 Cell morphology ofS.platensisunder the conditions of photoautotrophy and mixotrophy

由圖4可知，無論是光合自養(yǎng)還是混合營養(yǎng)，由于藻體細(xì)胞一直處于較高的pH范圍（9.50～11.50），多數(shù)雜菌仍然難以生長(zhǎng)，盡管光生物反應(yīng)器采用開放式培養(yǎng)，仍未檢測(cè)到細(xì)胞染菌情況，說明后期試驗(yàn)可以繼續(xù)采用開放式培養(yǎng)。在光合自養(yǎng)條件下，細(xì)胞生長(zhǎng)速率低，衰亡細(xì)胞少，細(xì)胞中色素以葉綠素為主，培養(yǎng)液顏色呈深綠色。在混合營養(yǎng)條件下，細(xì)胞轉(zhuǎn)為異養(yǎng)為主，細(xì)胞生長(zhǎng)速率加快，衰亡細(xì)胞較多，光合作用降低，細(xì)胞中葉黃素含量增加，導(dǎo)致細(xì)胞顏色呈黃綠色，且在反應(yīng)器底部有少量衰亡細(xì)胞聚集。此外，與全自動(dòng)發(fā)酵罐相比，搖瓶和光生物反應(yīng)器中藻體細(xì)胞均未受到機(jī)械攪拌損傷，藻體細(xì)胞更長(zhǎng)，形態(tài)更完整，而全自動(dòng)發(fā)酵罐中細(xì)胞斷裂明顯。

2.5 光合自養(yǎng)培養(yǎng)藻液pH變化趨勢(shì)

在光合自養(yǎng)條件下，培養(yǎng)基中的碳酸根離子與碳酸氫根離子是一組緩沖體系，兩者含量變化導(dǎo)致pH改變是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，隨著培養(yǎng)基中無機(jī)碳源不斷消耗導(dǎo)致培養(yǎng)液pH不斷上升。因此，培養(yǎng)液pH的變化趨勢(shì)在一定程度上可反映培養(yǎng)基中無機(jī)碳源消耗的情況。光合自養(yǎng)條件下3種培養(yǎng)裝置中培養(yǎng)液pH的變化趨勢(shì)見圖5。由圖5可知，搖瓶和全自動(dòng)發(fā)酵罐中培養(yǎng)液pH上升趨勢(shì)基本一致，培養(yǎng)12 d后pH均超過11.0，而光生物反應(yīng)器中培養(yǎng)液pH最終為10.27，明顯低于前兩種裝置，尤其是培養(yǎng)5 d后pH上升較慢，其原因是光生物反應(yīng)器為開放式培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中除部分水分蒸發(fā)外，當(dāng)空氣泡上升到液面爆裂時(shí)，培養(yǎng)液中少量無機(jī)鹽會(huì)濺到反應(yīng)器內(nèi)壁，導(dǎo)致培養(yǎng)基無機(jī)成分濃度降低，而每天補(bǔ)加的無菌水進(jìn)一步增加了培養(yǎng)液稀釋作用，故光生物反應(yīng)器中培養(yǎng)液pH較低，且后期變化平緩。

圖5 光合自養(yǎng)條件下螺旋藻培養(yǎng)液pH變化情況Fig.5 Change of pH value ofS.platensisculture solution under the condition of photoautotrophy in the three devices

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用搖瓶、全自動(dòng)發(fā)酵罐和自制光生物反應(yīng)器，3種不同裝置進(jìn)行螺旋藻培養(yǎng)研究。研究結(jié)果表明，采用質(zhì)量濃度為0.1 g/L的新鮮藻泥接種時(shí)可獲得最大生長(zhǎng)速率。在光合自養(yǎng)條件下，搖瓶、全自動(dòng)發(fā)酵罐和光生物反應(yīng)器3種裝置中藻體生物量最大值分別為0.715 g/L、0.789 g/L、1.277 g/L，光生物反應(yīng)器培養(yǎng)產(chǎn)率比搖瓶培養(yǎng)提高78.6%，比全自動(dòng)發(fā)酵罐培養(yǎng)結(jié)果提高61.8%，且培養(yǎng)時(shí)間縮短1～3 d。采用混合營養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)，上述3種裝置獲得的藻體生物量最大值依次為1.613 g/L、1.616 g/L、1.715 g/L，分別比光合自養(yǎng)條件下藻體生物量提高125.6%、104.8%、34.3%。兩種條件下自制的光生物反應(yīng)器均獲得了最大的培養(yǎng)產(chǎn)率，盡管混合營養(yǎng)培養(yǎng)的藻體細(xì)胞品質(zhì)比光合自養(yǎng)條件下略差，但未發(fā)現(xiàn)染菌跡象，且培養(yǎng)產(chǎn)率得到了較大提高，說明自制的光生物反應(yīng)器具有一定的實(shí)用性，為其他研究者從事螺旋藻混合營養(yǎng)研究提供了一定的依據(jù)。

但在培養(yǎng)過程中，由于光生物反應(yīng)器為開放式培養(yǎng)，飛濺到反應(yīng)器器壁的營養(yǎng)物質(zhì)有導(dǎo)致染菌的風(fēng)險(xiǎn)，且每天補(bǔ)加無菌水會(huì)造成短時(shí)內(nèi)培養(yǎng)基中各成分濃度下降，影響細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，在今后的研究中，本課題組一方面將繼續(xù)使用該反應(yīng)器進(jìn)行混合營養(yǎng)培養(yǎng)基成分優(yōu)化及培養(yǎng)方式的研究，另一方面對(duì)培養(yǎng)液中無機(jī)鹽的消耗速率進(jìn)行定時(shí)檢測(cè)，研究無機(jī)鹽的補(bǔ)加方式，以期能開發(fā)出一套經(jīng)濟(jì)高效、操作簡(jiǎn)便、環(huán)境友好的螺旋藻培養(yǎng)工藝。

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