小鼠壓力過(guò)負(fù)荷心衰心肌組織中轉(zhuǎn)化生子因子-β1、Ⅰ型膠原蛋白、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白及瞬時(shí)受體電位香草酸亞型4通道蛋白表達(dá)

安 君 成憲武 劉旭光 安 康 王 寧 高 健 張 凱

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院心臟中心，吉林 延吉 133000)

心力衰竭(HF)是多種心血管疾病進(jìn)展的最終階段，世界范圍內(nèi)HF發(fā)病率持續(xù)增加〔1〕,在壓力過(guò)負(fù)荷引起的HF約占心衰總?cè)藬?shù)的50%左右。多種機(jī)制參與HF心肌重塑過(guò)程，但其確切機(jī)制仍不甚清楚。迄今研究結(jié)果表明，細(xì)胞外基質(zhì)沉積、心肌纖維化是HF發(fā)生、發(fā)展的最重要因素〔2〕。先前的研究表明壓力過(guò)負(fù)荷HF形成過(guò)程中IL-17A產(chǎn)生增多〔3〕，并通過(guò)上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白(MMP)2/9表達(dá)參與壓力過(guò)負(fù)荷HF心肌重塑。有報(bào)道轉(zhuǎn)化生子因子(TGF)-β1、Ⅰ型膠原蛋白、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)〔4，5〕參與心肌纖維化，而具有壓力敏感性的瞬時(shí)受體電位香草酸亞型4(TRPV4)通道具有壓力敏感性特點(diǎn)，可被流體壓力以及剪切力等多種刺激所激活后參與心肌成纖維細(xì)胞分化過(guò)程〔6〕，但這些因子在壓力過(guò)負(fù)荷HF中的作用機(jī)制不甚清楚。本研究通過(guò)已建立的壓力過(guò)負(fù)荷HF模型〔7〕,同步檢測(cè)TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白、α-SMA以及TRPV4通道蛋白表達(dá)，探討上述因子蛋白在壓力過(guò)負(fù)荷HF形成過(guò)程中的表達(dá)及可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用4周齡雄性昆明系小鼠，體重20～25 g，共27只，由吉林白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。將小鼠(27 只)，隨機(jī)分為空白對(duì)照組(n=6)、假手術(shù)組(n=6)、心衰組(n=15，其中TGF-β1蛋白表達(dá)組5只、去Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)組5只及α-SMA蛋白表達(dá)組5只)。

1.2小鼠壓力過(guò)負(fù)荷HF模型制備 按文獻(xiàn)〔8〕方法制備。假手術(shù)組的手術(shù)操作與模型制備組步驟完全相同，僅不用鉭夾夾閉。部分夾閉主動(dòng)脈弓10 w后在相同麻醉下通過(guò)心臟超聲觀察左室舒張末期直徑、左室收縮末期直徑、左室后壁舒張末期厚度以及射血分?jǐn)?shù)判斷是否形成HF，模型合格用于實(shí)驗(yàn)〔7〕。

1.3實(shí)驗(yàn)材料 兔抗TGF-β1多克隆抗體(稀釋1∶800)購(gòu)自美國(guó)Biovision公司，兔抗鼠I型膠原蛋白(稀釋1∶1 000)、多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)AbD Serotec，鼠抗α-SMA單克隆抗體(稀釋1∶1 000)購(gòu)自德國(guó)Boehringer Mannheim公司，兔抗TRPV4多克隆抗體(稀釋1∶800)購(gòu)英國(guó)Abcam公司。β-actin(稀釋1∶5 000)購(gòu)自德國(guó)Sigma-Aldrich公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(稀釋1∶1 000)購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司，其余二抗(山羊抗兔，1∶1 000～1∶8 000)以及一抗稀釋液等購(gòu)自國(guó)內(nèi)公司。

1.4TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白、α-SMA以及TRPV4通道蛋白表達(dá)檢測(cè)(Western印跡法) 分別抽提各組心臟組織的總蛋白，采用Bmdford法進(jìn)行蛋白定量，制備好的蛋白樣品置-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?0 μg蛋白上樣，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)后，轉(zhuǎn)膜。封閉液室溫封閉60 min，相應(yīng)一抗 孵育4℃過(guò)夜，TBST洗膜10 min，3次，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(室溫 90 min，TBST洗膜10 min，3次，加入新鮮配制HRP化學(xué)發(fā)光試劑，F(xiàn)cluroChem9900成像系統(tǒng)顯影。采用Quantity one軟件進(jìn)行光密度分析，從β-actin或GAPDH 作內(nèi)對(duì)照。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用 SPSS19.0 軟件行單因素ANOVA分析，兩組間用配對(duì)t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1TGF-β1蛋白表達(dá) 小鼠壓力過(guò)負(fù)荷HF發(fā)生過(guò)程中心肌組織中的TGF-β1蛋白表達(dá)與正常及假手術(shù)組比較明顯增強(qiáng)(P<0.05)。見圖1。

2.2Ⅰ型膠原蛋白蛋白表達(dá) 小鼠壓力過(guò)負(fù)荷HF發(fā)生過(guò)程中心肌組織中的Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)與正常及假手術(shù)組比較明顯增強(qiáng)(P<0.01)。見圖2。

2.3α-SMA蛋白表達(dá) 小鼠壓力過(guò)負(fù)荷HF發(fā)生過(guò)程中心肌組織中的α-SMA蛋白表達(dá)與正常及假手術(shù)組比較明顯增強(qiáng)(P<0.01)。見圖3。

1，空白對(duì)照組；2；假手術(shù)組；3，壓力過(guò)負(fù)荷心衰組；下圖同圖1 TGF-β1蛋白表達(dá)

圖2 Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)

圖3 α-SMA蛋白表達(dá)

2.4TRPV4通道蛋白表達(dá) 小鼠壓力過(guò)負(fù)荷HF發(fā)生過(guò)程中心肌組織中的TRPV4通道蛋白表達(dá)與正常及假手術(shù)組比較明顯增強(qiáng)(P<0.01)。見圖4。

圖4 TRPV4通道蛋白表達(dá)

3 討 論

HF的病理基礎(chǔ)是心肌重塑，是多種常見心臟疾病向終末期心臟疾病發(fā)展的一個(gè)病理過(guò)程，是心臟功能由代償期向失代償期轉(zhuǎn)變,進(jìn)而引起HF的關(guān)鍵。HF發(fā)生過(guò)程中細(xì)胞外基質(zhì)沉積、心肌間質(zhì)纖維化是HF發(fā)生、發(fā)展的最重要病理過(guò)程〔9〕。各種細(xì)胞因子通過(guò)不同途徑參與其細(xì)胞外基質(zhì)沉積、心肌間質(zhì)纖維化進(jìn)最終導(dǎo)致HF。

TGF-β1作為一種多效性細(xì)胞因子，在誘導(dǎo)纖維化過(guò)程中起中心作用。已有報(bào)道高水平的血漿TGF-β1與中老年人心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)〔4〕,而抑制TGF-β1可改善小鼠HF心肌重塑〔8〕。TGF-β1又可上調(diào)α-SMA mRNA 以及蛋白表達(dá)〔5〕。本研究結(jié)果表明壓力過(guò)負(fù)荷HF中TGF-β1蛋白表達(dá)明顯增加證明TGF-β1參與壓力過(guò)負(fù)荷HF形成過(guò)程。本研究表明Ⅰ型膠原蛋白以及α-SMA蛋白表達(dá)在壓力過(guò)負(fù)荷HF形成過(guò)程中增強(qiáng)，有報(bào)道稱TGF-β1可上調(diào)α-SMA mRNA以及蛋白表達(dá)以及Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白、MMP2/9等相關(guān)〔5〕。

近來(lái)具有感受壓力特點(diǎn)的TRPV4通道與心血管的調(diào)節(jié)以及疾病的關(guān)系越來(lái)越引起人們的重視〔6〕。本研究結(jié)果表明，在壓力過(guò)負(fù)荷HF過(guò)程中其TRPV4蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示壓力過(guò)負(fù)荷HF發(fā)生時(shí)心臟壓力變化引起TRPV4蛋白表達(dá)增強(qiáng)。有報(bào)道稱阻斷TRPV4 可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺水腫、HF以及肺動(dòng)脈高壓的進(jìn)展〔10〕。TRPV4又可通過(guò)整合來(lái)自TGF-β1信號(hào)和機(jī)械(壓力)因素調(diào)節(jié)心臟成纖維細(xì)胞分化成肌成纖維細(xì)胞〔6〕。既往報(bào)道與心肌纖維化和心臟重塑具有密切關(guān)系的IL-17A通過(guò)MMP2/9參與壓力過(guò)負(fù)荷HF形成過(guò)程〔3〕，而TGF-β1亦通過(guò)MMP2/9參與壓力過(guò)負(fù)荷HF形成過(guò)程〔5〕。IL-17A和TGF-β1在下游信號(hào)傳遞中可能具有某種交織，存在某種調(diào)控關(guān)系。有報(bào)道指出，IL-17A通過(guò)TRPV4介導(dǎo)參與機(jī)械性痛覺過(guò)敏〔10〕，但這種調(diào)節(jié)是否也存在于過(guò)負(fù)荷HF形成過(guò)程中尚不清楚。

本次同步檢測(cè)TGF-β1、 Ⅰ型膠原蛋白、α-SMA以及TRPV4通道蛋白在壓力過(guò)負(fù)荷HF心肌組織中表達(dá)增強(qiáng)的結(jié)果，提示這些細(xì)胞因子以及與HF相關(guān)的因子如IL-17A等相互調(diào)節(jié)機(jī)制在壓力過(guò)負(fù)荷HF形成過(guò)程中起重要作用，但其確切的機(jī)制尚不清楚。深入研究這些因子在細(xì)胞外基質(zhì)沉積、心肌間質(zhì)纖維化過(guò)程的作用，尤其在信息傳導(dǎo)層面的調(diào)節(jié)機(jī)制將有助于揭示HF發(fā)生機(jī)制。

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