維吾爾族不同HER-2表型乳腺癌中Survivin和Caspase-9基因表達的相關(guān)性及其意義

石文龍 巫姜 李炳軍，2 李南林 凌瑞 陳江浩

1空軍軍醫(yī)大學(xué)（第四軍醫(yī)大學(xué)）西京醫(yī)院甲乳血管外科（西安710032）；2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院乳腺甲狀腺外二科（烏魯木齊830001）

在全世界范圍內(nèi)，乳腺癌（breast cancer）是女性最常見的惡性腫瘤。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌是導(dǎo)致美國婦女死亡的第2位病因。我國乳腺癌發(fā)病率較發(fā)達國家低，但人口基數(shù)大，總患病人數(shù)也相當?shù)凝嫶?。因此乳腺癌的防治是不容忽視的。乳腺癌的發(fā)病及病情進展與多種因素有關(guān)［1］，特別地，不同民族人群之間有所不同［2］。維吾爾族是生活在我國西北地區(qū)的最主要少數(shù)民族，其乳腺癌發(fā)病有特點，在病理特征上也有特異之處，具有的不良預(yù)后因素較多［3］。人類表皮生長因子受體-2（HER-2）是乳腺癌預(yù)后相關(guān)因子。HER-2過表達（HER-2陽性）的乳腺癌是一種特殊類型的亞型，該亞型惡性程度高，預(yù)后較差。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族中的重要成員，它具有抑制Caspase-9參與的內(nèi)源性凋亡途徑的作用，進而達到抑制腫瘤細胞凋亡之目的。本研究旨在分析HER-2陽性及陰性的維吾爾族乳腺癌患者Survivin和Caspase-9表達差異并分析其相關(guān)性。初步探明Survivin和Caspase-9兩基因在維吾爾族不同HER-2表型乳腺癌發(fā)病中可能存在的作用及機制，為乳腺癌發(fā)病機制研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料實驗采用完全隨機設(shè)計，選取2014年6月至2016年12月在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院及西京醫(yī)院初次確診為乳腺癌的維吾爾族女性患者為研究對象，經(jīng)免疫組化或FISH檢查確定HER-2表達情況共72例，其中HER-2陽性39例（A組），HER-2陰性33例（B組），年齡33～67歲。以病理確診為良性病變的40例維吾爾族女性患者為正常對照（C組），年齡28～62歲。該實驗經(jīng)過倫理委員會審查通過，患者簽署知情同意書。其中早期浸潤癌19例，浸潤性特殊癌17例，浸潤性非特殊癌26例。按國際抗癌聯(lián)盟TNM分期：Ⅰ期3例，Ⅱ期38例，Ⅲ期27例，Ⅳ期4例。兩組患者在年齡、病理分型及病變分期等方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），具有可比性。見表1。

1.2 納入及排除標準納入標準：病理確診為乳腺癌的維吾爾族女性患者，且明確診斷HER-2表達為陽性者；HER-2確診標準：（1）免疫組化HER-2（3+）為陽性；（2）HER-2 FISH檢測比值 ＞ 2.2者；（3）免疫組化檢查HER-2（1+或-）為陰性。排除標準：入組前已行化療、免疫或生物治療等系統(tǒng)治療；非女性患者；非首次確診及診治的患者。

1.3 試劑與儀器反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR GreenⅠreal-time PCR試劑盒（日本Takara），Trizol Reagent（美國Invitrogen），DEPC（美國Sigma），PCR產(chǎn)物純化試劑盒（北京TIANGEN），一抗工作液：兔抗人Survivin多克隆抗體和兔抗人Caspase-9多克隆抗體（美國Santa-Cruz），羊抗兔二抗及DAB染色試劑盒（北京中杉金橋）。

表1 HER-2陽性患者及HER-2陰性組患者基本情況Tab.1 Condition of HER-2 Positive patients and the HER-2 Negative group 例

Real-time RT-qPCR儀（CFX96TM，美國BIORAD），低溫高速離心機（美國BIO-RAD），蛋白電泳儀（美國BIO-RAD），PCR儀（C1000TM，美國BIO-RAD），凝膠成像儀（美國BIO-RAD）核酸蛋白測定儀（NanoDrop1000，美國Thermo）。

1.4 標本采集及處理采集術(shù)前微創(chuàng)穿刺或者術(shù)后腫瘤組織，一分為二，其中一份迅速經(jīng)液氮冷凍后轉(zhuǎn)至超低溫冰箱中保存。另外一份經(jīng)10%甲醛溶液固定。

1.5 real-time RT-PCR檢測Survivin和Caspase-9表達取冰凍組織50 g，于液氮中迅速研磨，采用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，分別檢測Survivin和Caspase-9基因的表達；引物由大連寶生物公司設(shè)計并合成，引物序列見表2。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95.0℃/3 min，變性95.0℃/10 s，退火30 s，Survivin、Caspase-9和 β-actin退火溫度分別58.6、61.2和53.9℃，分別38個循環(huán)；實驗以β-actin作為內(nèi)參進行數(shù)據(jù)分析［1］。

表2 實時熒光定量PCR引物序列Tab.2 Real-time quantitative PCR primer sequences

1.6 免疫組化檢測Survivin和Caspase-9表達取固定好的組織標本，石蠟包埋切片，免疫組化染色，具體參考課題組前期實驗步驟［1］。實驗設(shè)置陰性對照和陽性對照。兩位病理科高年資醫(yī)生，采取雙盲法在400倍下隨機選擇5個不重復(fù)視野，Survivin和Caspase-9表達以細胞漿或（和）細胞膜被染成棕黃色或黃色者定義為陽性細胞，讀取染色深度（0分為陰性，1分弱陽性，2分中等強度陽性，3分為強陽性）和面積（0分：＜5%，1分：5%～24%，2分：25%～50%，3分：51%～75%，4分：＞75%）。兩者賦分乘積大于1分定義為陽性［1］。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法利用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件包分析，計量資料用±s表示，多組分析用方差分析，進一步組間比較用LSD檢驗，計數(shù)資料用卡方檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 real-time RT-PCR檢測Survivin mRNA結(jié)果Survivin/β-actin比值作為相對表達量，在3組組織中均有一定表達，但表達各有差異（F=3.08，P＜0.05）。A組與B組比較，A組與C組比較，Survivin表達均增強，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。B組與C組比較，Survivin表達前者略高，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3、圖1。

表3 Survivin mRNA在維吾爾族乳腺癌與正常對照組中的表達Tab.3 Expression of Survivin mRNA in Uygur ethnic breast cancer and control group ±s

表3 Survivin mRNA在維吾爾族乳腺癌與正常對照組中的表達Tab.3 Expression of Survivin mRNA in Uygur ethnic breast cancer and control group ±s

分組HER-2陽性組（A組）HER-2陰性組（B組）對照組(C組)例數(shù)39 33 40 Survivin/β-actin(×10-5)1.135±0.581 1.036±0.461 0.495±0.321 F值3.08＜0.05 P值

2.2 real-time RT-PCR檢測Caspase-9 mRNA結(jié)果Caspase-9/β-actin比值作為相對表達量，在各組中均有一定表達，但表達各有差異（F=3.01，P＜0.05）。A組與B組比較，A組與C組比較，Caspase-9表達均減弱，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。B組與C組比較，Caspase-9表達前者略低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4、圖2。

2.3 免疫組化檢測Survivin蛋白表達結(jié)果根據(jù)免疫組化檢測結(jié)果顯示，Survivin蛋白在各組組織中均有一定表達，其表達量不全相同（χ2=32.409，P＜0.001）。A組與B性組比較，A組與C組比較，Survivin表達均增強，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。B組與C組比較，Survivin表達前者略高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表5、圖3。

圖1 Survivin在維吾爾族不同HER-2表達狀態(tài)乳腺癌組織中表達的PCR結(jié)果圖Fig.1 PCR results of Survivin expression of different HER-2 status in Uighur breast cancer

表4 Caspase-9 mRNA在維吾爾族乳腺癌與正常對照組中的表達Tab.4 Expression of Caspase-9 mRNA in Uygur ethnic breast cancer and Control group ±s

表4 Caspase-9 mRNA在維吾爾族乳腺癌與正常對照組中的表達Tab.4 Expression of Caspase-9 mRNA in Uygur ethnic breast cancer and Control group ±s

分組HER-2陽性組（A組）HER-2陰性組（B組）對照組（C組）例數(shù)39 33 40 Caspase-9/β-actin(×10-6)7.374±0.803 8.325±0.898 8.472±0.926 F值P值3.01＜0.05

圖2 Caspase-9在維吾爾族不同HER-2表達狀態(tài)乳腺癌組織中表達的PCR結(jié)果圖Fig.2 PCR results of Caspase-9 expression of different HER-2 status in Uighur breast cancer

2.4 免疫組化檢測Caspase-9結(jié)果根據(jù)免疫組化檢測結(jié)果顯示，Caspase-9蛋白在各組組織中都有一定表達，其表達量不全相同（χ2=29.843，P＜0.001）。A組與B組比較，Caspase-9表達均減弱，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。A組與C組比較，Caspase-9表達減弱，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。B組與C組比較，Caspase-9表達前者低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表6、圖4。

表5 免疫組化檢測Survivin表達情況Tab.5 Immunohistochemical detection of Survivin expression例

2.5 Survivin和Caspase-9基因的相關(guān)性分析對納入實驗的新疆維吾爾族婦女HER-2陽性乳腺癌患者進行數(shù)據(jù)分析，real-time RT-PCR檢測結(jié)果顯示Survivin和Caspase-9表達呈負相關(guān)（r=-0.648，P＜0.01，表7）。免疫組化檢測結(jié)果顯示Survivin和Caspase-9表達呈負相關(guān)（r=-0.581，P＜0.05）。見表8。

圖3 Survivin在乳腺癌組織中表達的IHC結(jié)果圖（SP×400）Fig.3 IHC results of Survivin expression in breast cancer（SP × 400）

圖4 Caspase-9在乳腺癌組織中表達的IHC結(jié)果圖（SP×400）Fig.4 IHC results of Caspase-9 expression in breast cancer（SP × 400）

表6 免疫組化檢測Caspase-9表達情況Tab.6 Immunohistochemical detection of Caspase-9 expression 例

表7 HER-2陽性患者Survivin和Caspase-9的相關(guān)性（real-time RT-PCR）Tab.7 Correlation between Survivin and Caspase-9 of HER-2 positive patients（real-time RT-PCR） 例

3 討論

乳腺癌為乳腺腺上皮來源的惡性腫瘤，作為 女性的多發(fā)癌，是威脅她們身心健康的癌腫之首，也是女性最常見的惡性腫瘤之一。乳腺癌的發(fā)生與患者的遺傳背景、生活環(huán)境等因素有著密切的關(guān)系。在我國不同種族和（或）地區(qū)之間，其發(fā)病率和預(yù)后有所不同［2］。維吾爾族是我國西北地區(qū)主要的少數(shù)民族之一，具有人口眾多、婚配大多局限本民族等特點。維吾爾族女性乳腺癌的發(fā)病與其他種族人群相比，既有共性也有特性。然而，維吾爾族人群乳腺癌的具體發(fā)病機制及特點目前尚未見文獻報道［2，4-5］。

表8 HER-2陽性患者Survivin和Caspase-9的相關(guān)性（免疫組化）Tab.8 Correlation between Survivin and Caspase-9 of HER-2 positive patients（Immunohistochemistry） 例

HER-2在正常人體的細胞膜表面也有HER-2蛋白的表達；由于HER-2蛋白可以參與信號傳導(dǎo)，調(diào)控細胞生長及分裂；因此，當乳腺癌細胞HER-2過表達時，其信號可刺激癌細胞的不斷生長或增加癌細胞的侵襲性，進而使得乳腺癌患者的病情快速進展，最終導(dǎo)致不良的預(yù)后。因此，HER-2或是判斷乳腺癌預(yù)后因素的指標之一［6］，也是研究乳腺癌發(fā)病及治療的重要環(huán)節(jié)之一。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族成員之一。具有對抗細胞周期G2～M期凋亡的誘導(dǎo)［7］作用，同時有調(diào)節(jié)細胞增殖和誘導(dǎo)血管生成的作用［8］。其具有腫瘤特異性，在正常分化成熟組織中很少表達，當癌變時，其表達增加。因此Survivin主要表達于癌組織表面，被認為是惡性腫瘤診斷和治療的良好指標和靶點［8-9］。GUZMAN 等［10］和管海濤等［11］研究表明：乳腺癌等癌變組織中Survivin基因表達增強。Survivin表達下調(diào)反而可誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細胞凋亡［12］。本研究結(jié)果顯示：免疫組化和real-time RT-PCR結(jié)果均顯示，HER-2陽性組、HER-2陰性組Survivin基因表達均強于對照組。而進一步分析顯示：HER-2陽性組較HER-2陰性組Survivin基因表達增強；而HER-2陰性組也較正常對照組表達增強，但差異沒統(tǒng)計學(xué)意義。該結(jié)果顯示：維吾爾族HER-2陽性乳腺癌組織中Survivin基因高表達，這與GUZMAN等［13］及阿衣夏木古麗等［1］報道一致。這也初步說明Survivin高表達可能在促進維吾爾族HER-2陽性乳腺癌變過程中起著一定的促進作用。當然這需要進一步的研究進行證實。

ZUMBR?GEL等［14］發(fā)現(xiàn)Survivin作為生存素，其抗凋亡作用是主要是通過抑制Caspase-9的作用參與的內(nèi)源性凋亡途徑而實現(xiàn)的。具體機制是Survivin基因可直接參與并抑制凋亡終末效應(yīng)酶Caspase3和Caspase7的活性［15］；然而這二者的活化可以由由活化后的Caspase-9所誘導(dǎo)［16］。在凋亡終末效應(yīng)酶誘導(dǎo)的整個凋亡過程中，Caspase-9與Survivin則表現(xiàn)為抑制的效應(yīng)［17］。本研究在免疫組化和real-time RT-PCR的結(jié)果均顯示：HER-2陽性組、HER-2陰性組Caspase-9基因表達均低于正常對照組。這與張丙信等［18］的研究結(jié)果有相似之處。進一步分析，real-time RT-PCR結(jié)果表明：HER-2陽性組較HER-2陰性組Caspase-9基因表達減弱；而HER-2陰性組較對照組Caspase-9基因表達略低，差異沒統(tǒng)計學(xué)意義。免疫組化結(jié)果卻顯示：HER-2陽性組、HER-2陰性組與正常對照組均無統(tǒng)計學(xué)差異。分析兩種試驗方法檢測結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，在新疆維吾爾族婦女HER-2陽性乳腺癌患者中，Survivin基因表達增強，Caspase-9基因表達減弱，Survivin和Caspase-9基因呈負相關(guān)；根據(jù)如上研究結(jié)果可初步說明，Survivin基因可能通過抑制Caspase-9基因的激活，從而導(dǎo)致維吾爾族女性HER-2陽性乳腺癌的發(fā)生。但結(jié)果不是很明確，究其原因，一方面可能和納入研究的樣本數(shù)量較少有一定關(guān)系；另一方面，也可能是Caspase-9在維吾爾族HER-2陽性及HER-2陰性乳腺癌發(fā)病過程中差異不明顯，但是其具體機制這需要進一步的深入研究得以證實。

終上所述，Survivin基因作為抑制凋亡發(fā)生的重要因子之一，可能在維吾爾族女性HER-2陽性乳腺癌發(fā)病過程中中起著潛在的促進作用，主要通過該基因過表達發(fā)揮其促進作用。研究還顯示，Caspase-9基因通過低表達在維吾爾族HER-2陽性乳腺癌中也起到促進作用，且二者可能存在負相關(guān)關(guān)系。當然，本研究尚處于基礎(chǔ)的階段，二者的確實關(guān)系需要進一步明確。這需要在進一步在兩基因相互作用機制中更加深入和更廣的研究；以探明Survivin和Caspase-9基因在維吾爾族HER-2陽性乳腺癌中的意義，為乳腺癌的發(fā)病機制研究奠定基礎(chǔ)。

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