血清膽紅素在肺癌患者中的抗氧化作用

劉利東 馬梓欣 林琪英 周承志

廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院1檢驗科，2輸血科，4廣州呼吸健康研究院、呼吸疾病國家重點實驗室、國家呼吸系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學研究中心（廣州 510120）；3廣州醫(yī)科大學金域檢驗學院（廣州 510182）

膽紅素是體內鐵卟啉類化合物的降解產物，主要來源于衰老紅細胞。血清膽紅素作為肝膽及血液系統(tǒng)疾病的診斷和治療指標在臨床應用廣泛，并一直認為其濃度升高對人體有害［1］，事實上膽紅素具有強還原性，在首次被確認為內源性抗氧化劑后［2］，它的抗氧化功能越來越受到重視。膽紅素在多種疾病發(fā)病過程中起重要作用，其中包括惡性腫瘤，但并不具有特異性［3］。肺癌的發(fā)生受多種因素影響，肺癌組織存在氧化/抗氧化失衡，這種失衡可能與肺癌的發(fā)生和發(fā)展有關［4］。有研究［5-7］表明在正常范圍內較高的膽紅素可以降低肺癌的發(fā)病率，提示膽紅素可能對肺癌的發(fā)生有一定的抑制作用。為探明膽紅素是否通過抗氧化作用對肺癌的發(fā)生造成影響，本文將通過測定血清膽紅素、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和自由基作用于脂質的終產物丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量，分析它們之間的相關性，了解肺癌患者體內存在的氧化應激狀態(tài)及膽紅素在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 標本來源

1.1.1 肺癌患者組2013年1月至2014年11月在廣州醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院確診為肺癌患者為病例組。入選本次研究病例標準為：（1）原發(fā)性肺癌，經細胞學或組織病理學確診，符合美國胸科醫(yī)師學會（The American College of Chest Physicians，ACCP）肺癌診治標準；（2）經病理免疫組化及腹部B超、CT或MR等檢查排除肝膽系統(tǒng)疾病及其他腫瘤；（3）既往無其他腫瘤病史；（4）未進行化療、放療及手術切除等治療。最終入選402例，其中男234例，女168例，年齡27～86歲，平均（60.09±9.9）歲。按美國聯(lián)合癌癥分類委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）和國際癌癥研究協(xié)會（International Association for the Study of Lung Cancer，IASLC）2009年制定的TNM分期標準（第7版）［8］進行分期，其中 T1 72例，T2 147例，T3 95例，T4 88例。

1.1.2 對照組隨機抽取同時期廣州醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院體檢中心體檢人群，排除心、腦、肝、膽、腎、內分泌疾病及腫瘤等疾病，最終入選422例，其中男199例，女220例，年齡22～80歲，平均（47.15±10.97）歲。

1.2 儀器與試劑膽紅素檢測儀器為Beckman Coulter AU5821全自動生化分析儀及配套試劑、標準品及質控品；SOD和MDA測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，分別采用黃嘌呤氧化酶法（羥胺法）和硫代巴比妥酸法（TBA法）。

1.3 標本采集和處理

1.3.1 對照者于清晨空腹采取靜脈血3 mL，患者于入院后次日清晨空腹采取靜脈血3 mL，選用含分離膠負壓采血管采血。室溫，3 300 r/min離心4 min，總膽紅素及結合膽紅素的檢測為離心后立刻檢測，SOD及MDA則取血清置于-40℃冰箱保存，并在3個月內檢測。

1.3.2 總膽紅素及結合膽紅素含量的檢測儀器為Beckman Coulter AU5821全自動生化分析儀，試劑為Beckman Coulter配套重氮法檢測膽紅素試劑盒；104例肺癌患者（其中T1-T4分期分別有16例、35例、31例和22例）和57例健康對照者檢測SOD活性與MDA含量的檢測，操作按試劑說明書進行手工操作，吸光度用752紫外光柵分光光度計進行測定。

1.4 統(tǒng)計學方法所有實驗數(shù)據采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據用均值±標準差表示，組間均值比較采用獨立樣本的t檢驗，相關性分析應用配對樣本的t檢驗，當P＜0.05時為組間差異具有顯著性。

2 結果

2.1 對照組與肺癌組膽紅素、SOD和MDA的測定結果肺癌組結果與對照組進行比較，總膽紅素、結合膽紅素及未結合膽紅素和SOD均有明顯的下降（P＜0.05），而MDA則顯著性升高（P＜0.05）（表1）。這一結果提示，肺癌患者體內膽紅素和SOD水平降低，可能導致患者體內抗氧化能力不足的原因，使細胞更容易遭到體內產生的氧化物質的破壞，促進細胞癌變。

表1 對照組與肺癌組膽紅素、SOD和MDA的測定結果Tab.1 The concentrations of bilirubin,SOD and MDA in controls and patients with lung cancer ±s

表1 對照組與肺癌組膽紅素、SOD和MDA的測定結果Tab.1 The concentrations of bilirubin,SOD and MDA in controls and patients with lung cancer ±s

注：△部分樣本檢測，對照組檢測57例，肺癌組檢測104例

2.2 對照組與不同肺癌分期的測定結果為進一步研究膽紅素是否與肺癌的發(fā)展有關，本研究組按肺癌TNM分期標準將肺癌患者分為T1、T2、T3及T4四組，比較對照組與不同分期肺癌患者差異。對照組總膽紅素、結合膽紅素、未結合膽紅素、SOD和MDA與肺癌T1～T4組進行比較，結果顯示總膽紅素和未結合膽紅素T1～T2期與對照組差異無顯著性，與T3～T4組則差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而結合膽紅素與T2～T4組差異有顯著性（表2）。對照組SOD和MDA與T1～T4組均差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表3）。雖然T1～T4各組間所有檢測項目有一定的變化趨勢，但統(tǒng)計學分析相鄰組間差異并沒有顯著性（P＞0.05，數(shù)據未顯示）。提示膽紅素可能是在肺癌的發(fā)展中起作用，而在早期肺癌發(fā)生時變化并不明顯。

2.3 膽紅素與性別關系有研究［9-10］認為膽紅素與性別有關，為了解性別差異對膽紅素的影響，我們將對照組男女之間及肺癌組男女之間的膽紅素進行比較，發(fā)現(xiàn)對照組女性膽紅素比男性低，差異有統(tǒng)計學意義；但肺癌組男女之間差異無統(tǒng)計學意義（表4）。筆者也分析了所檢測項目在不同肺癌TNM分組中男女之間差異，結果顯示并無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，數(shù)據未顯示）。這說明健康男性膽紅素比女性高，這一結果與前期研究一致。但對于肺癌患者來說，正常的膽紅素抗氧化平衡被破壞，膽紅素水平處于較低水平。

表2 對照組與肺癌組分期膽紅素的測定結果Tab.2 The concentrations of bilirubin in controls and patients in different TNMs ±s

表2 對照組與肺癌組分期膽紅素的測定結果Tab.2 The concentrations of bilirubin in controls and patients in different TNMs ±s

注：*P為對照組與肺癌患者組各分期均數(shù)兩兩比較

組別對照組T1分期T2分期T3分期T4分期未結合膽紅素（μmol/L）10.32±3.00 10.39±3.39 9.99±3.13 9.26±2.66**9.42±2.73*例數(shù)422 72 147 95 88總膽紅素（μmol/L）12.53±3.59 12.50±4.12 11.89±3.73 11.19±3.41**11.44±3.26**結合膽紅素（μmol/L）2.22±0.66 2.17±0.73 2.00±0.67**2.00±0.71**2.02±0.66*

表3 對照組與肺癌組分期膽紅素的SOD、MDA測定結果Ta.3 The concentrations of SOD and MDA in controls and patients in different TNMs ±s

表3 對照組與肺癌組分期膽紅素的SOD、MDA測定結果Ta.3 The concentrations of SOD and MDA in controls and patients in different TNMs ±s

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

表4 膽紅素在不同性別的分布Tab.4 The distribution of bilirubin in different genders ±s

表4 膽紅素在不同性別的分布Tab.4 The distribution of bilirubin in different genders ±s

2.4 膽紅素與SOD及MDA的相關性分析SOD是細胞內主要的抗氧化系統(tǒng)，而MDA是脂質氧化的產物。通過對膽紅素與SOD和MDA的相關性分析，除在對照組中總膽紅素和未結合膽紅素與SOD有低正相關（r分別為0.377和0.395，P＜0.05），其余的均無顯著相關性。具體相關系數(shù)見表5。這一結果可能是因為膽紅素的抗氧化功能與SOD不一樣，膽紅素獨立發(fā)揮抗氧化功能。

表5 膽紅素與SOD和MDA的相關性分析Tab.5 The relativity among bilirubin，SOD and MDA

3 討論

腫瘤細胞過氧化物酶體的過氧化氫酶數(shù)量的減少及活性的減弱直接影響了氧化劑的清除，同時也使自由基的生成增加。有研究表明［11］，血清SOD活性測定對判斷腫瘤分期及預后具有一定意義，亦是檢測腫瘤標志物之一。本研究結果顯示，與對照組相比，肺癌患者的SOD活性降低，而MDA含量升高，對照組與TNM分期T1～T4分期肺癌患者SOD活性和MDA含量差異均有顯著性，但各分期間無顯著性的變化趨勢。表明肺癌患者存在著氧化/抗氧化失衡，肺癌腫瘤發(fā)生與抗氧化能力的下降有關，這與國內前期研究數(shù)據一致［4，12］。

較早前有研究認為與白蛋白結合的膽紅素（未結合膽紅素）具有較強的氧自由基清除能力［2，13］，近期研究［14］也認為未結合膽紅素可以抑制鼻咽癌在肺組織中的轉移，提高鼻咽癌的無轉移生存率，但它的生物學作用機制并不十分明確［15］。膽紅素的抗氧化活性主要在于能清除體內的自由基，膽紅素經血紅素加氧酶作用后轉變?yōu)槟懢G素，再經還原酶的作用，轉變?yōu)槲唇Y合膽紅素，在此還原過程中可提供二個氫原子，起到抗氧化作用。膽紅素在正常人體內濃度約為3.4～17.1 μmol/L，比已知的抗氧化劑谷胱甘肽的組織濃度的0.1%還少，它強大的抗氧化作用是通過膽綠素還原酶的接觸性擴增作用實現(xiàn)的，占機體總抗氧化能力的30%左右［16-17］。健康人膽紅素水平并不很高，可能是因為膽紅素作為強抗氧化劑在體內很快被消耗。雖然有關肺癌發(fā)生發(fā)展與氧化抗氧化的相關性分析研究報道很多，但有關血清膽紅素在肺癌的病理過程中的作用研究報道較少。HORSFALL等［5］通過統(tǒng)計英國綜合醫(yī)療研究數(shù)據庫中1988-2008年記錄的504 206名成人的血清總膽紅素數(shù)據發(fā)現(xiàn)血液中膽紅素濃度處于正常但卻相對較高范圍內的人，其肺癌、慢性阻塞性肺疾病及全因死亡風險會有所下降，其中膽紅素濃度增加0.1 mg/dL，男性中的肺癌發(fā)病率會減少8%，而女性中的肺癌發(fā)病率會降低11%。WEN等［18］的研究也提示在男性吸煙者中，低水平的血清膽紅素與高肺癌發(fā)生率有相關。筆者對比肺癌患者與健康對照，無論是總膽紅素，還是未結合或結合膽紅素均有明顯下降，兩組差異具有顯著性。肺癌的發(fā)展過程與細胞內的氧化/抗氧化失衡加重有關，本研究中T1～T4分期的肺癌患者膽紅素與SOD一樣，呈現(xiàn)下降趨勢，提示膽紅素含量的變化可預測腫瘤的發(fā)生與進展。機體大量的SOD、膽紅素等抗氧化劑在腫瘤組織集中，以清除腫瘤組織產生的氧化物質，隨著腫瘤的惡性增強，機體氧化損傷加劇，脂質過氧化反應終極產物增加，抗氧化劑不足以拮抗氧化產物，從而表現(xiàn)為抗氧化劑活性或含量在肺癌中后期較早期下降。

本研究中，在TNM各分期比較中總膽紅素、未結合膽紅素呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，而結合膽紅素未出現(xiàn)此趨勢，可能是結合膽紅素性質上水溶性強，不易通過生物膜，難與胞內氧自由基作用。另外，它作為白蛋白配基雖然也在血漿中轉運，但其結合不如未結合膽紅素緊密，抗氧化性相對較弱［19］。筆者認為膽紅素在肺癌患者中的抗氧化作用主要由未結合膽紅素作用實現(xiàn)。雖然膽紅素有抗氧化作用，在肺癌發(fā)生過程中可清除逐漸增高的自由基，但研究認為膽紅素對白細胞的抗氧化作用時發(fā)現(xiàn)在生理條件下高濃度的膽紅素才具有抗氧化作用［20］。本研究中，肺癌T1和T2分期的膽紅素濃度較T3和T4組的高，但無統(tǒng)計學差異（數(shù)據未顯示），這可能與標本量有關。

有研究認為膽紅素與性別相關［9-10］，男性的外周血循環(huán)膽紅素比女性高，而隨年齡的增長膽紅素呈現(xiàn)下降趨勢。本研究結果發(fā)現(xiàn)，在正常對照組膽紅素男性比女性高，與前期研究相符，但肺癌組則兩者間差異無顯著性，可能是因為癌變發(fā)生后，體內的膽紅素抗氧化體系被打亂，不能執(zhí)行正常的功能，均呈現(xiàn)低膽紅素水平。

本研究的初步結果顯示，正常范圍內的膽紅素含量與肺癌有一定的相關性，濃度變化與肺癌的進展也相關，高濃度的膽紅素可能是通過細胞內抗氧化機制降低肺癌發(fā)生的風險［21］。研究表明［22］，對于手術切除非小細胞性肺癌患者，術前膽紅素適當升高可以提高總體生存率、無疾病生存率和無轉移生存率，同時，結合膽紅素可以作為一個對非小細胞性肺癌的手術預后的指標。因本研究是對肺癌患者的小樣本調查，其結果可能會受到樣本量的影響，還需增加更大的樣本量，從而收集得到的數(shù)據分析可能會更有說服力?？梢越⒍嘀行暮献鞯幕颊邤?shù)據庫，可以通過大量樣本的研究，建立這一疾病的相關模型，當膽紅素水平出現(xiàn)有意義的變化時，可提示疾病的發(fā)生幾率，早發(fā)現(xiàn)早治療，從而提高疾病的痊愈率及治療后的生活質量。

［1］林青，熊尚全，許少鋒，等.膽紅素及氧化修飾低密度脂蛋白與冠心病的關系［J］.臨床心血管病雜志，2002，18（5）：204-206.

［2］STOCKER R，YAMAMOTO Y，MCDONAGH A F，et al.Bilirubin is an antioxidant of possible physiological importance［J］.Science，1987，235（4792）：1043-1046.

［3］HAN S，YANG J D，DINN D H，et al.Higher bilirubin levels of healthy living liver donors are associated with lower posttransplant hepatocellular carcinoma recurrence［J］.Transplantation，2016，100（9）：1993-1938.

［4］操敏，李琦，張宗德，等.肺癌組織中抗氧化酶及氧化代謝產物變化的定量分析［J］.中國肺癌雜志，2009，12（4）：322-326.

［5］HORSFALL L J，RAIT G R，WALTERS K，et al.Serum bilirubin and risk of respiratory disease and death［J］.JAMA，2011，305（7）：691-697.

［6］LIM J E，KIMM H，JEE S H.Combined effects of smoking and bilirubin levels on the risk of lung cancer in Korea：the severance cohort study［J］.PLoS One，2014，9（8）：e103972.

［7］ZHANG Y W，XU J L，LOU Y Q，et al.Pretreatment direct bilirubin and total cholesterol are significant predictors of overall survival in advanced non-small-cell lung cancer patients with EGFR mutations［J］.Int J Cancer，2017，140（7）：1645-1652.

［8］DETTERBECK F C，BOFFA D J，TANOUE L T.The New Lung Cancer Staging System［J］.Chest，2009，136（1）：260-271.

［9］霍雯，楊嵐，劉宇，等.血清總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素生物參考區(qū)間的建立［J］.國際檢驗醫(yī)學雜志，2017，38（3）：391-392.

［10］孟凡飛，蒲曉允.重慶地區(qū)健康人群總膽紅素和直接膽紅素參考范圍的調查［J］.檢驗醫(yī)學與臨床，2015，22：3397-3339.

［11］唐煦，周國林.關于血清Cu、Zn及CuZn-SOD與惡性腫瘤關系的探討［J］.微生物學免疫學進展，1997，25（2）：35-37.

［12］孫昕，王義高.超氧化物歧化酶、丙二醛和細胞因子在肺腫瘤患者的表達［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2009，17（11）：2120-2122.

［13］STOCKER R，GLAZER A N，AMES B N.Antioxidant activity of albumin-bound bilirubin［J］.Proc Natl Acad SCI，1987，84（16）：5918-5922.

［14］DENG C C，XU M，LI J，et al.Unconjugated Bilirubin Is a Novel Prognostic Biomarker for Nasopharyngeal Carcinoma and Inhibits Its Metastasis via Antioxidation Activity［J］.Cancer Prev Res，2016，9（2）：180-188.

［15］GAZZIN S，VITEK L，WATCHKO J，et al.A Novel Perspective on the Biology of Bilirubin in Health and Disease［J］.Trends Mol Med，2016，22（9）：758-768.

［16］楊俊娟，程宇彤，張鈞華.膽紅素和氧自由基與心血管疾病的關系［J］.中國動脈硬化雜志，2006，14（8）：728-730.

［17］BARANANO D E，RAO M，F(xiàn)ERRIS C D，et al.Biliverdin reductase：a major physiologic cytoprotectant［J］.Proc Natl Acad Sci，2002，99（25）：16093-16098.

［18］WEN C P，ZHANG F，LIANG D，et al.The ability of bilirubin in identifying smokers with higher risk of lung cancer：a large cohort study in conjunction with global metabolomic profiling［J］.Clin Cancer Res，2015，21（1）：193-200.

［19］FLORCSZYK U M，JOZKOWICZ A，DULAK J.Biliverdin reductase：new features of an old enzyme and its potential therapeutic significance［J］.Pharmacol Rep，2008，60（1）：38-48.

［20］YESILKAYA A，ALTINAYAK R，KORQUN D K.The antioxidant effect of free bilirubin on cumene hydroperoxide treated human leukocytes［J］.Gen l Pharmacol，2000，35（1）：17-20.

［21］BOLAND B S，DONG M H，BETTENCOURT R，et al.Association of Serum Bilirubin with Aging and Mortality［J］.J Clin Exp Hepatol，2014，4（1）：1-7.

［22］LI N，XU M，CAI M Y，et al.Elevated serum bilirubin levels are associated with improved survival in patients with curatively resected non-small-cell lung cancer［J］.Cancer Epidemiol ，2015，39（5）：763–768.