生豬養(yǎng)殖環(huán)境及豬肉中金黃色葡萄菌腸毒素基因分布研究

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaurues，S.aureus)廣泛分布于自然界，也存在于人和動物的體表、鼻腔和消化道等部位，是一類共生的人獸共患條件致病菌[1]。在獸醫(yī)臨床上可廣泛引起疾病，降低動物生產(chǎn)力，嚴(yán)重危害家畜健康。豬養(yǎng)殖場、生豬屠宰過程和市售生豬肉雖受到嚴(yán)格的衛(wèi)生安全控制，但還有一定程度的金黃色葡萄球菌污染，生豬肉生產(chǎn)鏈中污染的金黃色葡萄球菌及其分泌的毒素可能會引起人的感染或食物中毒。據(jù)美國疾病預(yù)防控制中心報告，金黃色葡萄菌引起的食物中毒事件在細(xì)菌性食物中毒事件中高達(dá)33%，僅次于大腸桿菌，而在加拿大此比例可高達(dá)45%[2]。在我國，細(xì)菌性食物中毒主要由沙門氏菌和副溶血弧菌引起，而金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件僅次于前兩者位居第三[3]。

金黃色葡萄球菌能夠分泌腸毒素(staphylococcal enterotoxins, SEs)、溶血毒素(haemolysins)、脫皮毒素(exfoliative toxins，ETs)和殺白細(xì)胞素(paton-valentine leucocidin,Pvl)等多種外毒素[4-7]。腸毒素是一種高耐熱、具有超抗原活性的外毒素，它是引發(fā)食物中毒或食源性疾病暴發(fā)的主要致病因子[8]。目前已發(fā)現(xiàn)的腸毒素有18種，分為sea、seb、sec、sed、see5種傳統(tǒng)型腸毒素基因和seg、seh、sei、sej、sek、sel、sem、sen、seo、sep、seq、ser、seu13種新型腸毒素基因，其中引起食物中毒主要以sea或seb基因為主[5]。溶血素是金黃色葡萄球菌的一種重要致病因子，分為α、β、γ、δ 4 種類型，可引起人和動物敗血癥等疾病，以α-溶血素對人的致病性為主[8]。脫皮毒素和殺白細(xì)胞素在金黃色葡萄球菌的分布不高，約由5%的金黃色葡萄球菌產(chǎn)生，脫皮毒素能夠引發(fā)皮膚損傷等皮膚炎癥反應(yīng)，而殺白細(xì)胞素除能引發(fā)皮膚炎癥外，還能引發(fā)軟組織感染和肺炎等疾病[9-11]。

近年來，國內(nèi)外關(guān)于豬肉、雞肉和牛肉等肉類食品中金黃色葡萄球菌污染狀況及其毒力基因攜帶狀況的研究較多[12-16]，但國內(nèi)外較少有關(guān)于生豬肉生產(chǎn)鏈中金黃色葡萄球菌的污染狀況及其毒力基因攜帶狀況的報道。生鮮肉類食品，尤其是生鮮豬肉食品已成為我國人們的主要肉食消費品，生鮮豬肉食品安全的監(jiān)控必不可缺，鑒于生鮮豬肉生產(chǎn)鏈中存在一定的金黃色葡萄球菌污染，因此檢測污染的金黃色葡萄球菌中毒力基因的分布狀況具有重要意義。本研究采用PCR方法對養(yǎng)殖場和市售生鮮豬肉分離的130株金黃色葡萄球菌進(jìn)行腸毒素基因檢測，初步了解金黃色葡萄球菌中腸毒素基因的分布情況，對生鮮豬肉生產(chǎn)鏈的衛(wèi)生安全提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 實驗所用的金黃色葡萄球菌是在2014年某養(yǎng)殖場、超市和農(nóng)貿(mào)市場采集樣品中分離檢出的菌株，其中養(yǎng)殖場樣本中分別是從養(yǎng)殖環(huán)境(土壤、豬欄門、豬鼻拭子)、屠宰車間生鮮豬肉、生產(chǎn)車間肉制品及豆干成品中檢出29株、62株和9株，共計檢出100株；超市和農(nóng)貿(mào)市場樣本是從生鮮豬肉中檢出30株。本實驗所用的金黃色葡萄球菌共130株，且均被確定為革蘭氏陽性和血漿凝固酶陽性。

1.2儀器與設(shè)備 GeneAmp PCR system 2700，美國Applied Biosystems公司；Gel Doc EQ凝膠成像系統(tǒng)，美國BIO-RAD公司；核酸電泳儀，美國BIO-RAD公司；高速離心機(jī)，美國Thermo公司；恒溫培養(yǎng)箱，德國Binder公司。

1.3培養(yǎng)基和主要試劑 腦心浸出液肉湯(BHI)，廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒，北京博邁德生物技術(shù)有限公司；Taq DNA聚合酶(5 U/μL)、dNTPs、2000 bp DNA marker、瓊脂糖，日本TaKaRa公司；溶菌酶，德國Sigma公司。

1.4菌株的活化及DNA的提取 將保存于實驗室-80 ℃的菌株劃線接種至BHI瓊脂平板，在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，然后挑取單菌落至液體BHI培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)10～16 h后，采用北京博邁德生物技術(shù)有限公司DNA提取試劑盒說明進(jìn)行金黃色葡萄球菌DNA的提取。

1.5PCR擴(kuò)增及引物的選擇 根據(jù)參考文獻(xiàn)[12-17]執(zhí)行毒力基因引物的合成和擴(kuò)增條件。引物均由上海生工生物股份有限公司合成。引物序列及片段長度如表1所示。

2 結(jié) 果

2.1腸毒素基因的檢測結(jié)果及分布情況 通過PCR檢測18個毒力基因在130株金黃色葡萄球菌的檢出率如圖1和表2所示。在130株金黃色葡萄球菌中，有123株菌檢測出腸毒素基因，攜帶率為94.6%。各腸毒素基因中seb的檢出率最高，占60.8%，其次為sem占53.8%，seg占43.1%，而sed、sej、seo、sep、seq、ser、seu均未檢出。其他腸毒素基因的檢出情況如表2所示。在130株金黃色葡萄球菌中，18個腸毒素基因的分布情況如表3所示。在傳統(tǒng)型腸毒素基因中，sea和see只在生豬肉和豆干樣品分離株中檢出，在超市和農(nóng)貿(mào)市場的生豬肉樣品分離株中sea和see的檢出率高于養(yǎng)殖場屠宰車間生豬肉樣品分離株。seb在養(yǎng)殖場樣品和超市及農(nóng)貿(mào)市場樣品分離株中的檢出率相當(dāng)，且均高于其他腸毒素基因。在新型腸毒素基因中，seg和sem的檢出率較高，且主要分布在養(yǎng)殖場樣品分離株中。seh和sek只在養(yǎng)殖場屠宰車間生豬肉樣品分離株中檢出，其它菌株均為檢出。sei、sel、sen只在養(yǎng)殖樣品分離株中有檢出，而在超市和農(nóng)貿(mào)市場生豬肉樣品分離株中未檢出。

表1 金黃色葡萄球菌毒力基因引物及序列
Tab.1 Target genes, primer sequences and pcr conditions

基因引物序列(5′—3′)產(chǎn)物長度/bp退火溫度/℃seasea?FGGATATTGTTGATAAATATAAAGGGAAAAAAG43952sea?RGTTAATCGTTTTATTATCTCTATATATTCTTAATAGTsebseb?FAGATTTAGCTGATAAATACAAAGATAAATACG49454seb?RTCGTAAGATAAACTTCAATCTTCACATCTsecsec?FAGATTTAGCAAAGAAGTACAAAGATG49053sec?RAAGGTGGACTTCTATCTTCACACTTsedsed?FAGATTTAGCAAAGAAGTACAAAGATG48154sed?RCTACTTTTCATATAAATAGATGTCAATATGseesee?FGGGAAAAAAGTAGACTTATATGGTG34852see?RATCATAACTTACCGTGGACCsegseg?FTGCTATCGACACACTACAACC70455seg?RCCAGATTCAAATGCAGAACCsehseh?FTGATTTAGCTCAGAAGTTTAAAAATAAAAATG46652seh?RTTTCTTAGTATATAGATTTACATCAATATGseisei?FGACAACAAAACTGTCGAAACTG60355seiRCCATATTCTTTGCCTTTACCAGsejsej?FATGAAAAAAACAATATTTATACTGATTTTCTCCC80755sej?RTCTACAGAACCAAAGGTAGACTTATTAATACseksek?FATGAATCTTATGATTTAATTTCAGAATCAA54551sek?RATTTATATCGTTTCTTTATAAGAAATATCGselsel?FATGAAAAAAAGATTATTATTTGTAATTGTTATTAC72352sel?RATCATCTTTTTGAAATTTCGACATCTAGsemsem?FATGAAAAGAATACTTATCATTGTTGTTTTATTG72053sem?RCTTCAACTTTCGTCCTTATAAGATATTTCsensen?FATAAAAAATATTAAAAAGCTTATGAGATTGTTC77751sen?RACTTAATCTTTATATAAAAATACATCAATATGseoseo?FTATGTAGTGTAAACAATGCATATGCA68553seo?RTCTATTGTTTTATTATCATTATAAATTTGCAAATsepsep?FTTAGACAAACCTATTATCATAATGGAAGT61853sep?RTATATAAATATATATCAATATGCATATTTTTAGACTseqseq?FGGAAAATACACTTTATATTCACAGTTTCA54253seq?RATTTATTCAGTTTTCTCATATGAAATCTCserser?FAGCGGTAATAGCAGAAAATG36355ser?RTCTTGTACCGTAACCGTTTTseuseu?FAATGGCTCTAAAATTGATGG21555seu?RATTTGATTTCCATCATGCTC

圖1 18種腸毒素基因在130株金黃色葡萄球菌的陽性檢出率Fig.1 Positive rate of 18 enterotoxin genes among 130 S. aureus based on PCR

2.2腸毒素基因型別的分布情況 金黃色葡萄球菌主要的腸毒素基因型別如表3所示。通過PCR擴(kuò)增18個腸毒素基因發(fā)現(xiàn)，同一菌株中最多攜帶5種腸毒素基因，占6.2%(8/130)，且這8株菌均為養(yǎng)殖場分離株，攜帶3種及以上腸毒素基因的菌株為65株，占50%。130株金黃色葡萄球菌中腸毒素基因型sea+seb+see的比例最高，占9.2%(12/130)。其次seb+seg+sem+sen、seg+sem的比例均為6.2%(12/130)，seg+sei+sem+sen、seb+seg+sem、seg+sem+sen的比例均為5.4%(7/130)。

3 討 論

表2 腸毒素基因在130株金黃色葡萄菌中的分布情況
Tab.2 Distribution of staphylococcal enterotoxin or SE-like genes in 130 S.aureus strains

菌株來源菌株數(shù)傳統(tǒng)腸毒素基因新型腸毒素基因seasebsecsedseesegsehseiseljselksellselmselnseloselpselqserselu養(yǎng)殖場豬鼻拭子22011(50．0)00022(100)08(36．4)00020(90．9)19(86．4)00000 環(huán)境樣705(71．4)0007(100)000007(100)5(71．4)00000 生豬肉629(14．5)35(56．5)2(3．2)05(8．1)23(37．1)3(4．8)9(14．5)02(3．2)2(3．2)29(46．8)6(9．7)00000 豆干91(11．1)4(44．4)1(11．1)01(11．1)3(33．3)00001(11．1)5(55．6)1(11．1)00000超市和農(nóng)貿(mào)市場 生豬肉3021(70．0)24(80．0)1(3．3)017(56．7)1(3．3)0003(10．0)09(30．0)000000總計13031(23．8)79(60．8)4(3．1)023(17．7)56(43．1)3(2．3)17(13．1)05(3．8)3(2．3)70(53．8)31(23．8)00000

注：括號內(nèi)為百分比

表3 主要的金黃色葡萄球菌腸毒素基因型別
Tab.3 Prevalence of S.aureus enterotoxin toxin genotypes in this study

毒力基因型養(yǎng)殖場市場豬鼻拭子(n=22)環(huán)境樣品(n=7)生豬肉(n=62)豆(n=9)生豬肉(n=30)總計(n=130)sea+seb+see003(2．3)09(6．9)12(9．2)seb+seg+sem+sen2(1．5)06(4．6)1(0．8)08(6．2)seg+sem5(3．8)3(2．3)0008(6．2)seg+sei+sem+sen4(3．1)03(2．3)007(5．4)seb+seg+sem1(0．8)2(1．5)3(2．3)01(0．8)7(5．4)seg+sem+sen4(3．1)2(1．5)01(0．8)07(5．4)seb+seg+sei+sem+sen4(3．1)02(1．5)006(4．6)sea+seb+see+sem3(2．3)00003(2．3)sea+seb+sek002(1．5)01(0．8)3(2．3)表3(續(xù))毒力基因型養(yǎng)殖場市場豬鼻拭子(n=22)環(huán)境樣品(n=7)生豬肉(n=62)豆(n=9)生豬肉(n=30)總計(n=130)sea+seb00003(2．3)3(2．3)sea+see+sem00002(1．5)2(1．5)sec+sel+sem00002(1．5)2(1．5)seb+see00002(1．5)2(1．5)sea+seb+see+seg+sem001(0．8)001(0．8)seb+seg+sei+sem001(0．8)001(0．8)seg+seh+sei+sem001(0．8)001(0．8)sec+seg+sel+sem+sen001(0．8)001(0．8)sea+seb+sec+see00001(0．8)1(0．8)sea+seb+sek+sem00001(0．8)1(0．8)

注：括號內(nèi)為百分比

金黃色葡萄球菌是一種重要的人獸共患病致病菌，其分泌的毒素嚴(yán)重威脅了人獸健康，在養(yǎng)殖業(yè)和食品安全中要嚴(yán)格監(jiān)控。本研究對在豬養(yǎng)殖場和市售生鮮豬肉中分離的金黃色葡萄球菌進(jìn)行腸毒素毒力基因檢測。汪永碌等[17]對不同來源分離的金黃色葡萄球菌腸毒素基因(sea～sej)研究表明，腸毒素基因的檢出率為68.6%，seb基因的檢出率最高，其中食品樣品72.5%，食物中毒樣品58.3%，腹瀉患者樣品50.0%，傳統(tǒng)型腸毒素基因(sea～see)的檢出率為88.5%。沈玄藝等[18]對分離自食物中毒和食品樣品的金黃色葡萄菌腸毒素基因(sea～see)研究發(fā)現(xiàn)，腸毒素基因的檢出率為27.3%，其中食物中毒樣品100%，食品樣品16.7%，腸毒素基因中seb的檢出率最高。而沈偉偉等[19]通過多重PCR的方法對2005-2010年臺州市食品中分離的金黃色葡萄球菌18種腸毒素基因(sea～seu)研究表明，腸毒素基因的檢出率為52.4%，sea基因的檢出率最高，傳統(tǒng)型腸毒素(基因sea～see)的檢出率為33.3%。本研究中腸毒素基因(sea～seu)的檢出率為94.6%(123/130)，其中養(yǎng)殖場分離株中腸毒素基因攜帶率最高的是seb和seg，均為55%(55/100)，市售生鮮豬肉分離株中腸毒素基因攜帶率最高的是seb，占80%(24/30)，腸毒素基因中seb檢出率最高，與汪永碌和沈玄藝的研究結(jié)果一致，但檢出率有一定的差異。此外，本研究中養(yǎng)殖場分離株以腸毒素基因seb、seg和sem為主，而市售生豬肉分離株則以腸毒素基因seb、sea和see為主。這可能與菌株來源不同、不同樣品的處理方式、樣品環(huán)境中工作人員攜帶情況的不同和地區(qū)不同等因素有關(guān)，進(jìn)一步說明了不同地區(qū)、不同樣品中金黃色葡萄球菌的腸毒素基因流行性情況有所差異。

本研究通過采用PCR的方法對130株金黃色葡萄球菌進(jìn)行18個腸毒素基因的分布研究，但腸毒素基因可能存在不表達(dá)的情況，尤其是易引起食物中毒的腸毒素基因的表達(dá)。目前現(xiàn)有方法中對腸毒素的檢測僅限于傳統(tǒng)腸毒素SEA、SEB、SEC、SED和SEE，而越來越多的研究表明新型腸毒素基因(seg～seu)表達(dá)的腸毒素也能引起食物中毒[2, 20]。本研究通過采用PCR方法不僅能夠鑒定傳統(tǒng)腸毒素基因(sea～see)的存在，而且能夠鑒定新型腸毒素基因(seg～seu)的存在，初步判定可能存在的腸毒素引發(fā)的食物中毒風(fēng)險。

本實驗通過對養(yǎng)殖場豬鼻拭子、屠宰車間生鮮豬肉和市售生鮮豬肉分離的金黃色葡萄球菌腸毒素基因檢測發(fā)現(xiàn)，不同樣品來源的分離株毒力基因的分布情況有所差別，說明在生鮮豬肉生產(chǎn)和售賣過程中均有可能存在不同的金黃色葡萄球菌污染源，進(jìn)一步說明生鮮豬肉生產(chǎn)中可能存在一定的安全隱患。豬肉作為我國人民的主要肉食消費品，其安全性必須引起足夠的關(guān)注和重視。相關(guān)企業(yè)應(yīng)按照國家標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格生產(chǎn)，同時相關(guān)部門也應(yīng)大力監(jiān)督，保障我國肉類食品的消費安全。

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