2001-2016年廣州市登革3型病毒E基因序列及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

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登革病毒(dengue virus，DENV)屬于黃病毒科黃病毒屬，是引起登革熱(dengue fever，DF)和登革出血熱(dengue haemorrhagic fever，DHF)的病原。在DENV的3種結(jié)構(gòu)蛋白，衣殼蛋白(C蛋白)、膜蛋白(PrM蛋白和M蛋白)和包膜蛋白(E蛋白)中，由E基因編碼的E蛋白構(gòu)成病毒顆粒的表面凸起，具有血凝活性，在與宿主細(xì)胞融合和誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。中和抗體需要通過(guò)識(shí)別病毒的E蛋白發(fā)揮中和作用[1]。

登革熱在中國(guó)最早的記載是1873年發(fā)生于廈門(mén)。1978年登革熱首次從廣東佛山市傳入廣州市后，登革熱在廣州開(kāi)始流行。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在廣東省2001-2011年報(bào)告的3 577例登革熱病例中，70.90%(2 536例)出現(xiàn)在廣州市。在廣東省暴發(fā)歷史上最大規(guī)模登革熱流行的2014年，廣州市病例占82.63%(37 340例)[2-3]。2001-2016年，廣州市共發(fā)生登革熱病例4萬(wàn)余例。因此，了解廣州市登革熱流行狀況，對(duì)于登革熱防控意義重大。

根據(jù)蝕斑減少中和試驗(yàn)(plaque reduction neutralization test,PRNT)，可以將登革病毒分為4個(gè)血清型，血清型之間有交叉抗原反應(yīng)。雖然在某些地區(qū)曾報(bào)道發(fā)現(xiàn)第5個(gè)血清型的登革病毒，但登革病毒的流行仍然以4個(gè)血清型為主[4]。同一血清型的登革病毒又可以根據(jù)E基因序列劃分為不同的基因型。4種血清型的登革病毒在廣州市登革熱的流行中均有出現(xiàn)，并且以登革1型病毒為主[5]。自1980年首次分離到登革3型病毒(dengue virus serotype 3，DENV3)以來(lái)，DENV3在廣州銷(xiāo)聲匿跡近30年，直到2009年，才再次被分離到[6]。自2009年以來(lái)，幾乎每年都能分離到DENV3。在2010年和2012年，DENV3還引發(fā)了小范圍的流行。因此，通過(guò)對(duì)DENV3在廣州市的輸入和流行的分析，并結(jié)合病毒E基因序列和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，從分子水平追蹤其可能的傳染來(lái)源，分析廣州市DENV3流行特點(diǎn)，為正確了解廣州市登革熱流行狀況提供重要線索，為預(yù)測(cè)未來(lái)流行趨勢(shì)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1血清標(biāo)本 廣州市確診的登革熱病例急性期血清標(biāo)本。確診病例診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS216-2008)，國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)發(fā)布的《登革熱診療指南》(2014年第 2 版)和中國(guó)疾病預(yù)防控制中心下發(fā)的《登革熱病例監(jiān)測(cè)指南》。

1.2核酸檢測(cè)及病毒分離 使用江蘇碩士生物科技有限公司生產(chǎn)的登革3型病毒核酸檢測(cè)試劑(熒光PCR法)，對(duì)確診病例標(biāo)本進(jìn)行熒光檢測(cè)及分型，并將陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行病毒分離。病毒分離方法參考已發(fā)表文獻(xiàn)[7]。

1.3E基因RT-PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定 使用Primer軟件，參考DENV3標(biāo)準(zhǔn)株H87設(shè)計(jì)引物(見(jiàn)表1)。收集病變細(xì)胞的上清液，按照文獻(xiàn)方法提取登革病毒RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，挖膠回收后，送上海英濰捷基公司測(cè)序[7]。

表1 登革3型病毒E基因擴(kuò)增引物序列
Tab.1 Primers used for amplification of E genes of dengue virus serotype 3

引物序列(5′-3′)長(zhǎng)度/bpD3?793FAGTCGAGAAGTAGAGACATGG1710D3?2503RCTCTGTCCAGGTGTGGACCT

1.4E基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 使用Mega 4.0軟件，Kimura 2 parameter模型繪制基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，步長(zhǎng)設(shè)為1 000。

2 結(jié) 果

2.1登革病毒核酸檢測(cè)結(jié)果 2001-2016年，用熒光PCR共檢測(cè)到DENV3陽(yáng)性60份。其中，2001-2008年確診病例標(biāo)本中，無(wú)DENV3核酸檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本。

2.2病毒分離結(jié)果 將60份熒光PCR檢測(cè)DENV3陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行病毒培養(yǎng)，共分離到DENV3毒株24株，分離率為40.00%，2009年(7株)，2010年(6株)，2012年(9株)，2015年(1株)和2016年(1株)。2009年和2010年分離到的毒株在以往發(fā)表的文章中已有提及[5]。分離到的24株DENV3毒株中，15株為本地病例標(biāo)本中分離得到，占總毒株數(shù)的62.50%，9株為從輸入標(biāo)本中分離得到，占總毒株數(shù)的37.50%，輸入國(guó)家如表2所示。

表2 2001-2016年登革3型病毒分離毒株按年統(tǒng)計(jì)表
Tab.2 Statistics of isolated dengue virus serotype 3 from 2001 to 2016

年份分離毒株數(shù)分離株中本地病例數(shù)分離株中輸入病例數(shù)分離株輸入國(guó)家參考文獻(xiàn)2009743Vietnam，Thailand[5]2010624Tanzania，Thailand，Indonesia，Malaysia[5]2012981Malaysia本研究2015110None本研究2016101Malaysia本研究

2.4 病毒E基因特征

2.4.1核苷酸及氨基酸同源性比較 將分離到的24株DENV3的E基因進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序后序列分析，核苷酸相似率為88.9%～100%，氨基酸相似率為92.2%～100%。分離株與其他地區(qū)分離到的DENV3如KT187290(馬達(dá)加斯加2010年)、AB549332(坦桑尼亞2010年)、JF504679(中國(guó)浙江2009年)、KT452799(柬埔寨2010年)、AY858040(印度尼西亞2004年)、AB609590(菲律賓1956年)、以及JF968093(泰國(guó)2010年)有很高的相似性，核苷酸同源性為97.02%～99.80%，氨基酸同源性為92.56%～99.60%。每年的輸入病例毒株與本地病例毒株的E基因序列有很高的相似率，如表3所示。

表3 輸入病例毒株與本地病例毒株的E基因序列相似率
Tab.3 Similarity rate of E gene of local strains and imported strains

年份本地分離毒輸入分離株相似率(%)2009GZ1483/HM466963/2009GZ1081/HM466962/200999．86GZ11144/HM466966/2009GZ10616/HM466965/200999．72GZ11194/HM466967/2009GZ10616/HM466965/200999．762010GZ9534/JN009096/2010，GZ9721/JN009097/2010GZ4898/JN009093/2010，GZ5536/JN009094/2010，GZ9119/JN009095/20101002012GZ9805/KY673719/2012GZ5724/KY673718/20121002015GZ27852/KY673727/2015NoneNone2016NoneGZ14687/KY673728/2016None

2.4.2E基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 將分離到的24株病毒的E基因序列上傳到National Center for Biotechnology Information (NCBI)。其中，2009-2010年分離到的13株毒株的E基因序列已在其他雜志發(fā)表[5](序列號(hào)為：HM466962-HM466968，JN009093-JN009098)，其余2011-2016年分離的11株毒株的E基因序列為首次發(fā)表(序列號(hào)為：KY673718-KY673728)。將分離到的24株病毒與33條NCBI上的標(biāo)準(zhǔn)株序列及其他國(guó)家歷年來(lái)獲得的代表株序列的E基因進(jìn)行分析比對(duì)，經(jīng)Mega 4.0軟件，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。按照基因亞型分類(lèi)，DENV3可分為5個(gè)基因亞型[8]，除基因亞型IV外，其余亞型在廣州市2001-2016年均有發(fā)現(xiàn)，如圖1所示。

注：標(biāo)注2001-2016年廣州市分離的登革3型病毒圖1 2001-2016年廣州市登革3型病毒E基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of dengue virus serotype 3 in Guangzhou, 2001-2016

3 討 論

與DENV1和DENV2相比，DENV3在廣州市流行時(shí)間不長(zhǎng)，流行年份也不多。2001-2008年，無(wú)DENV3核酸檢測(cè)陽(yáng)性和毒株分離。從1980年在廣州市首次分離到DENV3，到2009年再次分離出DENV3，相隔近30年未分離到DENV3毒株，并且沒(méi)有出現(xiàn)DENV3的流行[5, 7]。但在2009年之后，DENV3出現(xiàn)的周期明顯縮短，并引發(fā)小范圍的流行。DENV3的出現(xiàn)，使以DENV1流行為主的廣州市登革熱流行形勢(shì)更加復(fù)雜和嚴(yán)峻。由于登革病毒存在抗體依賴(lài)的病毒感染增強(qiáng)作用(ADE，antibody-dependent enhancement)，不同血清型登革病毒的二次感染更易引發(fā)重癥登革熱，進(jìn)而可能導(dǎo)致廣州市登革出血熱或者登革休克綜合征(DSS，dengue shock syndrome)患者數(shù)量的增加。因此，有必要加強(qiáng)對(duì)DENV3的監(jiān)測(cè)和控制，防止DENV3的流行。

DENV3毒株輸入的國(guó)家以東南亞為主。東南亞與廣州貿(mào)易交往密切，東南亞旅游是近年來(lái)出國(guó)旅游熱點(diǎn)，這為登革熱的輸入和傳播提供了有利條件。除2015年外，每年本地DENV3病例出現(xiàn)之前，都有輸入病例出現(xiàn)。并且通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)，在2009年、2010年和2012年，輸入病例引起二代本地病例，甚至在2010年和2012年引發(fā)本地DENV3小范圍流行。對(duì)比輸入病例毒株和本地病例毒株E基因，核苷酸的相似率達(dá)99.5%以上，進(jìn)一步印證了輸入病例引發(fā)本地病例的可能性。因此認(rèn)為，廣州市DENV3的流行仍以輸入病例為主要來(lái)源，尚未觀察到本地化的現(xiàn)象。這也與目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為我國(guó)登革熱流行方式屬于輸入病例引起本地暴發(fā)流行的觀點(diǎn)相同[9]。自2009年來(lái)，DENV3的輸入毒株和頻率有增多的趨勢(shì)。所以，增強(qiáng)出國(guó)人員的傳染病防控意識(shí)，加強(qiáng)國(guó)境檢驗(yàn)檢疫，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和診斷登革熱病例，對(duì)登革熱病例進(jìn)行隔離和控制，對(duì)登革熱的防控有重要意義。

DENV3可以根據(jù)E基因的核苷酸序列的同源性，進(jìn)一步劃分為5個(gè)基因亞型?；騺喰虸-III主要與東南亞、印度次大陸、南太平洋、東非和美洲的登革熱疫情有關(guān)；基因亞型IV和V基本無(wú)引起登革熱疫情的報(bào)道，主要流行于美洲、南太平洋和亞洲[10]。從進(jìn)化樹(shù)上分析，在2001-2016年，廣州市流行的DENV3的各種基因亞型交替出現(xiàn)，共計(jì)出現(xiàn)4個(gè)基因亞型。在引起本地DENV3小范圍流行的2010年分離毒株以基因亞型III為主，2012年分離毒株以基因亞型II為主?？傮w來(lái)說(shuō)，基因亞型III在流行年份和分離毒株數(shù)上稍占優(yōu)勢(shì)。基因亞型III由于分布的廣泛性，被認(rèn)為是一個(gè)全球型的基因亞型[10]。因此，基因亞型III在廣州能否成為優(yōu)勢(shì)毒株，是否會(huì)本地化并引起流行，值得進(jìn)一步的關(guān)注和研究。

2009年分離到的DENV3主要屬于基因亞型III和基因亞型V，2010年出現(xiàn)基因亞型I，而2012年僅分離到基因亞型II毒株，2015年和2016年分離到的毒株又回歸到基因亞型III。在不同的年份，廣州流行的DENV3屬于不同的基因亞型，揭示了DENV3可能有不同的輸入來(lái)源。在一項(xiàng)關(guān)于DENV1抗體的研究中，79只小鼠感染基因亞型II毒株并產(chǎn)生抗體，結(jié)果僅有2只小鼠產(chǎn)生的抗體對(duì)DENV1的5個(gè)基因亞型都有保護(hù)作用[11]。同時(shí)有研究顯示，DENV3流行株從基因亞型V向III的轉(zhuǎn)換，很可能是導(dǎo)致1990年后印度登革熱流行的原因[10]。這些結(jié)果與以往我們認(rèn)為的，DENV感染產(chǎn)生的抗體對(duì)再次感染相同血清型的毒株有保護(hù)作用這一觀點(diǎn)有所不同。感染DENV某一血清型的某一基因亞型所產(chǎn)生的抗體可能對(duì)同一血清型的不同基因亞型沒(méi)有保護(hù)作用。這就為新基因亞型輸入導(dǎo)致登革熱的流行提供了可能性。同時(shí)基因亞型的增多，有可能使得不同毒株間發(fā)生基因交換，使本地DENV變異率增大，并導(dǎo)致自然選擇出更有感染力的毒株[12]。因此，廣州市DENV3基因亞型的增多和轉(zhuǎn)換，使得廣州市登革熱流行傳播更為復(fù)雜，流行風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步增高，防控壓力增大。

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