陜西省手足口病重癥和死亡病例的流行特征及腸道病毒71型VP1區(qū)基因特征分析

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手足口病(Hand，foot and mouth disease，HFMD)，是由人腸道病毒引起的兒童常見傳染病，臨床以發(fā)熱、手、足、口腔和臀部等部位出現(xiàn)皮疹為主要臨床表現(xiàn)[1]。大多數(shù)HFMD患者預后良好，少數(shù)患者可在短期內(nèi)出現(xiàn)無菌性腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹、神經(jīng)源性肺水腫和心肌炎等并發(fā)癥，個別重癥患兒可因多種原因?qū)е滤劳?。人腸道病毒71 型(human enterovirus71，EV-A71)和柯薩奇病毒A 組16 型(Coxasckievirus A16，CV-A16)是HFMD的常見和主要病原。我國于2008年將 HFMD納入丙類法定傳染病報告與管理，其防控工作一直備受關注。為了解陜西省HFMD重癥和死亡病例的流行特征和病原學特點，本研究對2010-2015年監(jiān)測的HFMD重癥和死亡病例進行了分析，為全省制定預控措施提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1資料來源 HFMD監(jiān)測資料來源于中國疾病預防控制信息系統(tǒng)中上報的數(shù)據(jù)。HFMD診斷標準依據(jù)《手足口病診療指南》(2010年版)[2]，結合臨床癥狀及實驗室檢查結果做出判定。

1.2標本采集 按照《手足口病預防控制指南(2009版)》[3]要求，采集臨床診斷的HFMD 患者標本。標本以肛拭子、咽拭子和糞便為主。

1.3病毒型別鑒定 標本使用Qiagen 公司的QIAamp Viral Mini RNA Extraction 試劑盒或西安天隆公司核酸提取試劑盒提取病毒RNA。采用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)進行腸道病毒的型別鑒定。檢測試劑盒為江蘇碩世或上海之江生產(chǎn)，嚴格按照說明書進行操作。檢驗儀器為ABI 7500 實時熒光定量PCR儀。

1.4病毒分離培養(yǎng) 取核酸檢測陽性標本200 μL接種于RD 細胞和Hep2細胞，36 ℃培養(yǎng)7 d，連續(xù)培養(yǎng)2代。如果出現(xiàn)典型的腸道病毒特征性細胞病變效應 (CPE)， 則收獲病毒培養(yǎng)液，凍存于-20 ℃冰箱。

1.5病毒VP1區(qū)擴增及序列測定 收獲的陽性毒株提取病毒RNA，引物序列及反應條件參照相應文獻[4]，陽性產(chǎn)物送上海生工生物有限公司進行序列測定。使用Squencher 5.0軟件進行序列拼接比對，MEGA5.0軟件進行序列分析并構建親緣進化樹，建樹采用相鄰連接方法(Neighbor-joining)。

1.6統(tǒng)計學方法 采用Excel 2003軟件建立數(shù)據(jù)庫，描述性流行病學方法分析HFMD病例資料，SuperMap、SPSS軟件進行統(tǒng)計學分析，率的比較用χ2檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1HFMD重癥和死亡病例流行概況 2010-2015年，陜西省共報告HFMD病例 339 573例，年均報告發(fā)病率為149.917 1/10 萬；報告死亡病例118例，年均報告死亡率0.052 09/10萬；報告重癥病例5 054例，年均病死率為2.32%(表1)。陜西省HFMD發(fā)病呈波動上升趨勢，重癥病例和死亡病例呈現(xiàn)一年高一年低的現(xiàn)象，病死率在逐年降低。

表1 2010-2015年陜西省HFMD重癥和死亡病例發(fā)病情況
Tab.1 Annual incidence of severe and dead cases of HFMD in Shaanxi Province, 2010-2015

時間病例數(shù)發(fā)病率(1/10萬)重癥數(shù)死亡數(shù)重癥病死率(%)201058538155．2679340319．1220113165084．8358657152．28201257766154．40341428372．59201352647140．364454591．65201470202186．53031385201．44201568770182．166469960．86

2.2時間分布 陜西省重癥病例每月均有報告，發(fā)病高峰出現(xiàn)在5-7 月，占報告重癥病例總數(shù)的64.58%。之后逐漸下降，到9-10月份又不斷上升，出現(xiàn)一個小高峰。死亡病例發(fā)病高峰也集中在5-7 月，占死亡病例總數(shù)的69.49%(圖1)。

2.3地區(qū)分布 陜西省HFMD重癥病例高發(fā)地區(qū)主要為西安、渭南、咸陽和商洛市，4市重癥病例占全省重癥病例總數(shù)的79.28%(圖2)。死亡病例相對集中在西安、渭南、咸陽市，占報告死亡病例總數(shù)的56.78%。

圖1 2010-2015年陜西省HFMD重癥和死亡病例月分布圖Fig.1 Monthly distribution of severe and dead cases of HFMD in Shaanxi Province, 2010-2015

2.4人群分布 2009-2015年陜西省HFMD重癥病例中，男性3158例、女性1 896例，男女性別比1.67∶1。病例中0～歲組597 例，1～歲組2 068例，2～歲組1 241例，3～歲組685例，4～歲組272例，5～歲組165例，≥10歲26例，發(fā)病以≤3歲兒童為主，占重癥病例總數(shù)的90.84%，其中1歲年齡組重癥病例最多占40.92%(圖3)。 報告的118例死亡病例中，男性78 例，女性40 例，男女性別比1.95∶1，死亡病例也主要為≤3歲兒童，占死亡病例總數(shù)的93.22%。

2.5病原學監(jiān)測 2010-2015年陜西省共檢測HFMD病例標本12 953份，其中重癥病例2 698例，死亡病例63例。重癥病例中，檢出EV-A71型陽性1791 例(66.39%)，CV-A16 型陽性169 例(6.26%)，其他腸道病毒738例(27.35%)，不同年份之間各病原構成型別有統(tǒng)計學差異(χ2=307.827，P<0.001)。死亡病例的病原主要以EV-A71型為主，除2例檢出其它腸道病毒外，其余61例均為EV-A71型，占96.83%(圖4)。重癥和死亡病例的各病原構成型別差異有統(tǒng)計學意義(χ2=23.261，P<0. 001)。

圖2 2010-2015年陜西省HFMD重癥病例地區(qū)分布圖Fig.2 Geographical distribution of severe HFMD cases in Shaanxi Province, 2010-2015

圖3 2010-2015年陜西省HFMD重癥病例年齡分布Fig.3 Age distribution of severe HFMD cases in Shaanxi Province, 2010-2015

圖4 2010-2015年陜西省HFMD重癥和死亡病例病原構成情況Fig.4 Pathogenic composition of severe and dead cases of HFMD in Shaanxi Province, 2010-2015

分析不同病原型別的重癥病例年齡分布，可見不同年齡組的各病原構成型別不同，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=58.536，P<0.001)。 EV-A71型在各年齡組中均檢出率最高，且隨著年齡的增加不斷增高，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=50.688 18，P<0.001)。

2.6EV-A71病毒進化分析 對引起重癥和死亡病例的主要病原EV-A71進行序列測定和進化分析。按照病例的發(fā)病年份、時間和不同地區(qū)來源，選取28株重癥病例和1株死亡病例的EV-A71病毒分離株進行VP1 基因序列分析。結果顯示：29株EV-A71分離株的核苷酸和氨基酸序列同源性分別94.2%～99.7%和98.0%～100%，與GenBank 中EV71原型株(BrCr) 的核苷酸和氨基酸同源性分別為80.6%～82.7% 和92.3%～94.9%。與我國C4 亞型代表株(SHZH98)的核苷酸和氨基酸同源性分別為90.8%～92. 6% 和96.3%～97.6%，具有高度的同源性。系統(tǒng)發(fā)生樹上，這29株EV-A71分離株均位于EV-A71的C4 基因亞型C4a 進化分支上，屬于同一個傳播鏈(圖5)。

圖5 陜西省HFMD 重癥和死亡病例EV-A71 分離株VP1 序列進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of VP1 region of EV-A71 strains isolated from severe and dead cases of HFMD in Shaanxi Province

3 討 論

HFMD傳染性強，流行強度大，傳播快，是嚴重危害嬰幼兒健康的傳染病。陜西省2010-2015年HFMD監(jiān)測系統(tǒng)共報告病例339 573例，年均報告發(fā)病率為149.917 1/10 萬，報告死亡病例118例，年均報告死亡率0.052 09/10萬，高于全國報道的0.03/10萬，報告重癥病例5054 例，重癥病死率為2.323%，低于全國平均水平3.0%[5]。陜西省HFMD發(fā)病呈波動上升趨勢，重癥病例和死亡病例呈現(xiàn)一年高一年低的交替現(xiàn)象，病死率逐年降低，至2015年已降至0.86%。

2010-2015年陜西省HFMD重癥和死亡病例的發(fā)病具有明顯的季節(jié)性特征，發(fā)病高峰均集中在5-7 月，分別占全省重癥和死亡病例總數(shù)的64.58%和69.49%，之后病例逐漸下降，到9-10月份又不斷上升，出現(xiàn)一個小高峰。與我國大部分地區(qū)呈現(xiàn)春夏季和秋季的雙峰流行模式[6-7]相吻合。有學者[8]認為手足口病的季節(jié)性流行特征與降水量、日照時長、溫度和氣壓等氣候因素相關。夏季濕熱環(huán)境對腸道病毒存活有利，戶外感染機會增多，導致病例頻繁發(fā)生。

HFMD重癥病例主要集中在西安、渭南、咸陽和商洛市，四市重癥病例占全省重癥病例總數(shù)的79.28%；死亡病例以西安、渭南、咸陽市報告較多，占死亡病例總數(shù)的56.78%。我省重癥和死亡病例主要集中在關中地區(qū)，可能與關中地區(qū)人口密度大，流動人口相對較多，傳播途徑易于實現(xiàn)，導致發(fā)病機率增高有關。

陜西省 HFMD 重癥病例以≤3歲兒童為主，占重癥病例總數(shù)的90.84%，其中1 歲年齡組重癥病例最多達40.92%，男性高于女性。死亡病例也主要為≤3歲兒童，占死亡病例總數(shù)的93.22%?？赡茉撃挲g段兒童免疫系統(tǒng)不完善、自身抵抗力弱，健康衛(wèi)生習慣尚未養(yǎng)成，對病毒普遍易感；同時兒童監(jiān)護人缺乏HFMD防病知識，易造成病例漏診或病程遷延轉為重癥或死亡。因此，加強≤3歲兒童的監(jiān)測管理，養(yǎng)成其健康衛(wèi)生習慣，盡可能接種EV-A71疫苗，提高兒童監(jiān)護人防病知識和防護意識，對預防HFMD重癥和死亡病例的發(fā)生至關重要。

2009-2015年陜西省HFMD實驗室確診的重癥病例中，EV-A71、CV-A16 和其他腸道病毒的構成比分別為66.39%、6.26%和27.35%，不同年份間各病原構成型別不同。不同年齡組各病原構成型別有統(tǒng)計學差異，EV-A71在各年齡組中檢出率最高，且隨著年齡的不斷增加逐漸增高。死亡病例中EV-A71檢出率達到 96.83%。從病原學監(jiān)測結果可見，EV-A71檢出率與重癥和死亡病例的發(fā)生密切相關[9]，當EV-A71為某年份流行優(yōu)勢病原時，重癥和死亡病例就高，反之則低。EV-A71作為一種嗜神經(jīng)性病毒，能引起無菌性腦膜炎、腦炎、神經(jīng)源性肺水腫等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，甚至導致死亡。因此應重點關注HFMD中EV-A71病原變化趨勢，當其處于較高水平時，要及時預測、預警重癥和死亡病例的發(fā)生。

對引起重癥和死亡病例的主要病原EV-A71進行序列測定和進化分析，進一步探索病原遺傳進化特征和致病性的關系。陜西29株EV-A71分離株的核苷酸同源性為94.2%～99.7%，氨基酸同源性為98.0%～100%，與我國C4亞型代表株之間具有高度的核苷酸和氨基酸同源性；在系統(tǒng)發(fā)生樹上形成一個基因簇，均位于EV-A71 的C4 基因亞型C4a分支上，屬于同一個傳播鏈。我國EV-A71分子流行病學研究表明：EV-A71病毒C4基因亞型的C4a分支為2004年以來我國流行的優(yōu)勢基因型[10]。2010-2015年陜西省流行的EV-A71病毒，與近年來全國流行的毒株具有相同的進化來源，均屬于C4基因亞型C4a進化分支，病毒在本地區(qū)已存在廣泛流行和傳播。

參考文獻:

[1] 金奇.醫(yī)學分子病毒學[M]. 北京：科學出版社，2001，1-920.

[2] 中華人民共和國衛(wèi)生部.手足口病診療指南(2010年版)[S]. 北京：中華人民共和國衛(wèi)生部，2010.

[3] 中華人民共和國衛(wèi)生部.手足口病預防控制指南(2009版)[S]. 北京：中華人民共和國衛(wèi)生部，2009.

[4] Zhang Y, Tan XJ, Wang HY, et al. An outbreak of hand foot and mouth disease associated with subgenotype C4 of human enterovirus 71 in Shandong, China[J]. J Clin Virol, 2009, 44(4): 262-267.

[5] 曹洋,洪志恒,金連梅,等. 2011-2012年全國手足口病疫情監(jiān)測分析[J]. 疾病監(jiān)測, 2013,28(12)：975-980. DOI: 10. 3784 / j. issn. 1003- 9961. 2013. 12. 006

[6] 常昭瑞,張靜,孫軍玲,等.中國2008-2009年手足口病報告病例流行病學特征分析[J].中華流行病學雜志，2011，32(7):676-680. DOI：10．3760/cmad．issn．0254-6450．2011．07.009

[7] 冀天驕,譚小華,劉冷,等. 廣東省2008-2015年手足口病流行病學特征及病原學監(jiān)測分析[J]. 病毒學報，2016，32(6)：713-720．DOI：10.13242/j.cnki.bingduxuebao.003067

[8] Xing WJ, Liao QH, Viboud C, et al. Hand, foot, and mouth disease in China, 2008-12: an epidemiological study[J]. Lancet Infect Dis, 2014, 14: 308-318.

[9] 于石成,周征奇,楊芳,等．中國2008-2013年度重癥手足口病的時空聚集性及其變化趨勢分析[J]. 中華流行病學雜志，2014，35(3): 271-275． DOI：10．3760/ema．j．issn．0254-6450．2014．03．012

[10] Tan X, Huang X, Zhu S, et al. The persistent circulation of enterovirus 71 in People’s Republic of China: causing emerging nationwide epidemics since 2008[J]. PLoS One, 2011, 6(9): e25662.