廣東省鼠形動物攜帶巴爾通體的調(diào)查和基因特征分析

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鼠形動物是一類種類多，數(shù)目龐大的小型哺乳類動物，其繁殖能力強(qiáng)，生活環(huán)境多樣，并且對自然環(huán)境有著極強(qiáng)的適應(yīng)性，是多種病原體的儲存宿主。巴爾通體是一種通過媒介傳播的革蘭陰性菌，近年來，隨著人獸共患病的增多，巴爾通體在鼠形動物中的攜帶情況引起了國內(nèi)外研究者的關(guān)注。目前在全球范圍內(nèi)，嚙齒類動物具有較高的巴爾通體感染率，并且已有30余種巴爾通體被成功分型[1]。人可通過節(jié)肢動物的叮咬引起菌血癥或與鼠形動物密切接觸而感染巴爾通體，主要引起貓抓病、戰(zhàn)壕熱、心內(nèi)膜炎及菌血癥等典型和常見疾??；此外，一些癥狀不典型的發(fā)熱病例也證實(shí)為巴爾通體感染[2]。

廣東省地處我國大陸南端，貿(mào)易發(fā)達(dá)，是人口活動最頻繁，最開放的省份之一，其豐富的雨水環(huán)境和亞熱帶季風(fēng)氣候?yàn)樽匀灰咴葱约膊∷拗鲃游锾峁┝藘?yōu)質(zhì)的生存條件。目前我國許多地區(qū)已開展鼠形動物攜帶巴爾通體的調(diào)查研究，但關(guān)于廣東省巴爾通體的分布情況和病原特征還未見報道，人群中巴爾通體引起的疾病資料也有限。本研究旨在通過對廣東地區(qū)巴爾通體病原體的研究，了解該地區(qū)鼠形動物攜帶巴爾通體的情況及其生物多樣性特征，為疾病的預(yù)防和控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1樣本采集 研究分別選擇地處廣東省中部、西部和東部的惠州市惠東縣，茂名市高州市，云浮市羅定縣，潮州市潮安縣，揭陽市惠來縣共5個地區(qū)作為監(jiān)測點(diǎn)，采樣區(qū)分布見圖1。鼠形動物的捕捉主要以籠夜法進(jìn)行：即居民區(qū)每戶放置5個籠，連續(xù)布放3 d，100籠次/d；野外每5 m放置1個籠，連續(xù)布放3 d；100籠次/d，晚放晨收。捕獲的動物帶回實(shí)驗(yàn)室后進(jìn)行種類鑒定，記錄每只鼠形動物的背景資料，包括編號、釆集時間、地點(diǎn)、鼠種、雌雄等。麻醉后無菌采集血清、肝、脾、肺、腎等臟器組織材料，標(biāo)本冷藏保存并帶回至廣東省疾病預(yù)防控制中心。

1.2 試劑與設(shè)備

1.2.1分子生物學(xué)檢測 肝組織材料核酸提取試劑盒(Qiagen cador pathogen kit), real time PCR試劑盒(QuantiTect Probe PCR Kit)，2000 bp DNA marker(Takara)，菌落DNA提取試劑盒(Bio-Rad InstaGene Matrix)；引物，探針由英濰捷基貿(mào)易有限公司廣州合成部合成。

1.2.2組織分離培養(yǎng) 胰酶大豆肉湯，5%羊血胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(廣州迪景微生物科技有限公司)，磁珠菌株保存液，含30%甘油的腦心浸液。

1.2.3儀器設(shè)備 組織研磨儀(Precellys 24 均質(zhì)器)，熒光定量PCR儀(Bio-Rad CFX96型)，CO2培養(yǎng)箱。

1.3 方法

1.3.1巴爾通體的分子生物學(xué)檢測 稱取約25 mg的肝臟組織，加入PBS，運(yùn)用均質(zhì)研磨器充分研磨臟器后按照試劑盒說明提取總核酸。熒光定量PCR反應(yīng)體系25 μL，模板DNA加5 μL，2Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL(10 μmol/L)，探針0.5 μL，加去離子水定容至25 μL，反應(yīng)用文獻(xiàn)[2]中所用引物，上游引物：5′-GCTATGGTAATAAATGGACAATGAAATAA-3′；下游引物：5′-GCTTCTGTTGCCAGGTG-3′；探針：FAM-ACCCCGCTTAAACCTGCGACG-BHQ1；反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性，30個循環(huán)：94 ℃ 30 s，60 ℃退火40 s，收集熒光信號。每次實(shí)驗(yàn)為防止假陽性，樣本處理，反應(yīng)體系的制備，PCR擴(kuò)增均在不同區(qū)域進(jìn)行，并設(shè)定陽性對照和空白對照。

1.3.2分離培養(yǎng) 將經(jīng)熒光定量PCR鑒定為陽性的樣本進(jìn)行分離培養(yǎng)，每份肝組織樣本取約25 mg，加入約400 μL的胰酶大豆肉湯研成勻漿，然后吸取約100 μL接種于含5%羊血的胰酶大豆瓊脂培養(yǎng)基上，置于含5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，觀察生長情況，最長觀察時間25 d，并進(jìn)行菌落分純，對疑似菌落進(jìn)行PCR鑒定，最后收集陽性純菌保存。

1.3.3序列測定與分析 熒光定量PCR擴(kuò)增非編碼RNA(ssrA)基因，經(jīng)研究證明與gltA基因具有相同的遺傳學(xué)分類功能[3]， PCR產(chǎn)物送至廣州艾基生物有限公司進(jìn)行測序，在NCBI上將序列與參考序列進(jìn)行搜索比對，運(yùn)用MegAlign軟件進(jìn)行同源性分析，并用Mega6.0，采用鄰接法，bootstrap 1000構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，率的比較采用卡方檢驗(yàn)和Fisher’s概率確切法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1各地區(qū)鼠形動物的分布 2016-2017年，于廣東省惠來縣、惠東縣、潮安縣、羅定縣和高州市5個地區(qū)共捕獲鼠形動物375只，隸屬2目3科6屬8種。5個地區(qū)樣本量分別為惠東縣143份，高州市26份，潮安縣81份，羅定縣46份，惠來縣79份；其中以褐家鼠(R.norvegicus)和黃胸鼠(R.flavipectus)數(shù)量占優(yōu)勢，分別為239只和53只。其余捕獲的鼠形動物中，有屋頂鼠(R.rattus)9只，臭鼩鼱(Suncusmurinus)32只，黃毛鼠(R.losea)19只，田鼠(Microtinae)2只，板齒鼠(Bandicotaindica)17只，卡式小鼠(Muscaroli)4只。各地的鼠種構(gòu)成中基本均以褐家鼠為優(yōu)勢鼠種，云浮羅定市主要以板齒鼠居多。見表1。

表1 廣東省鼠形動物分布和巴爾通體感染情況
Tab.1 Distribution and Bartonella prevalence of rodents in Guangdong Province

鼠種陽性數(shù)/樣本數(shù)(%)合計(jì)惠東縣高州市潮安縣羅定縣惠來縣褐家鼠49/239(20．50)28/137(20．44)6/20(30．00)9/39(23．08)0/16/42(14．28)黃胸鼠10/53(18．87)1/6(16．67)0/2(0)5/22(22．73)4/10(40．00)0/13(0)屋頂鼠2/9(22．22)0/0/01/1(100．00)0/0/(0)1/8(12．5)0/0(0)臭鼩鼱4/32(12．50)0/0(0)2/2(100．00)0/16(0)1/1(100．00)1/13(7．69)黃毛鼠7/19(36．84)0/0(0)0/1(0)1/1(100．00)4/6(66．67)2/11(18．18)田鼠0/2(0)0/0(0)0/0(0)0/2(0)0/0(0)0/0(0)板齒鼠1/17(5．88)0/0(0)0/0(0)0/1(0)1/16(6．25)0/0(0)卡氏小鼠0/4(0)0/0(0)0/0(0)0/0(0)0/4(0)0/0(0)合計(jì)73/375(19．47)29/143(20．27)9/26(34．62)15/81(18．52)11/46(23．91)9/79(11．39)

2.2巴爾通體檢測結(jié)果 用具有巴爾通體種屬水平特異性的ssrA基因引物[3]進(jìn)行熒光定量PCR基因檢測，獲得73份陽性樣本。經(jīng)測序確認(rèn)，該73份均為巴爾通體序列，總陽性率為19.47%。感染鼠種為褐家鼠、黃胸鼠、屋頂鼠、臭鼩鼱、黃毛鼠、板齒鼠，其中以黃毛鼠陽性率最高36.84%，田鼠和卡式小鼠陽性率為0%，但樣本量太少，缺乏代表性；不同鼠形動物間巴爾通體陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.361，P=0.254)。5個地區(qū)巴爾通體檢測陽性率最高的為茂名市高州市34.62%，其次為云浮市羅定縣23.91%，但各地區(qū)陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.778，P=0.100)。見表1。不同性別鼠形動物間巴爾通體陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.292，P=0.589)。不同生活環(huán)境之間陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.621，P=0.431)。見表2。

2.3巴爾通體分離培養(yǎng)結(jié)果 對73份PCR陽性肝組織樣本進(jìn)行巴爾通體分離培養(yǎng)，共有10份樣本有明顯的菌落生長。接種后每天觀察1次，一般接種5～6 d后開始長出菌落，可觀察到呈灰白色，略透明，邊緣光滑或粗糙的圓形凸起菌落。有時平板可有較多雜菌生長，挑取單個菌落進(jìn)行克隆，可于最多一周后長出菌落，大小較大于原代，有些呈現(xiàn)菜花樣，經(jīng)接種環(huán)刮起后可見圓形小凹陷，與文獻(xiàn)中描述形態(tài)相符[4]。對菌落進(jìn)行PCR鑒定后確定為巴爾通體，見圖2。

表2 不同性別、棲息環(huán)境間巴爾通體陽性率的比較
Tab.2 Comparison of the positive rate of Bartonella infection in different gender and habitats

因素例數(shù)陽性數(shù)陽性率(%)雌性1753218．28雄性2004120．50χ2=0．292P=0．589居民區(qū)—庭院3016120．26農(nóng)田、竹林、灌叢741216．22χ2=0．621χ2=0．431

圖2 5%羊血TSA培養(yǎng)基上巴爾通體菌落(分離自肝)Fig.2 Culture result of Bartonella isolates(isolated from liver)

圖3 基于巴爾通體ssrA基因片段的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Fig.3 Phylogenetic relationships of B. isolates constructed based on Neighbor-Joining for ssrA gene

2.4基因特征分析 對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，獲得69份有效序列，GenBank序列號為MF765614-MF765682，并基于GenBank中ssrA基因的參考序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示共存在6種基因型的巴爾通體，均處于L1(鼠相關(guān)巴爾通體)的大分支中；而L2中的巴爾通體主要分離自反芻類動物，L3分支則代表了2014年從泰國分離的新的巴爾通體。每個地區(qū)菌株基因型均至少存在3種，其中潮安縣存在5種基因型的巴爾通體。從褐家鼠和黃胸鼠分離的菌株基因型多樣；而臭鼩鼱和板齒鼠分離的主要為B.elizabethae。以GDHD66為代表的巴爾通體與來自泰國的B.tribocorumKT355808處于同一分支，同源性達(dá)到98.8%～100%；以GDGZ21為代表的樣本與美國的B.elizabethaeJN029774分為一支；分離自惠來縣褐家鼠的GDHL62與B.phoceensisJN029770相聚集；以GDLD09為代表的與日本的B.japonicaJN029784最為親近；以GDCA08為代表的與分離自美國褐家鼠的B.henselaeHouston JN029785處同一分支；其余的巴爾通體與秘魯?shù)腂.rochalimaeFN645497同源性最高。見圖3。

3 討 論

我國自1999年白瑛[5]等于云南地區(qū)鼠形動物中成功分離到B.elizabethae后，越來越多的研究者開始關(guān)注這一病原體。從2002-2017年，幾乎每年我國均有從不同宿主分離巴爾通體的文獻(xiàn)報道，覆蓋區(qū)域包括云南、山東、北京、河南、福建、浙江、黑龍江、青海、上海、內(nèi)蒙古、寧夏、山西、廣西、臺灣等多個地區(qū)[4, 6-10]，各地區(qū)從鼠形動物中檢出巴爾通體的陽性率為2.3%～57.26%。其中，我國北部和西南部的陽性率較高，最高可達(dá)57.6%[7]。目前還沒有人對廣東省鼠形動物感染巴爾通體的情況展開調(diào)查，而通過本次研究，獲得鼠形動物感染巴爾通體的陽性率為19.47%，相比海南和廣西的研究數(shù)據(jù)較高，進(jìn)一步證實(shí)了華南地區(qū)鼠形動物中存在巴爾通體感染，填補(bǔ)了廣東省對該病原體的研究空白。

目前，已知能檢測到巴爾通體的鼠種至少包括褐家鼠，黃胸鼠、黃毛鼠、小家鼠、屋頂鼠、田鼠、大絨鼠、斑胸鼠、大足鼠等以及食蟲目動物臭鼩鼱，本研究是我國首次從板齒鼠中檢測到巴爾通體。同時，國內(nèi)外有研究報道證實(shí)可從貓、狗、反芻動物，甚至獼猴類動物中檢測[11-14]到巴爾通體，提示巴爾通體對哺乳類動物可能有著較強(qiáng)的適應(yīng)性，而這種廣泛的宿主適應(yīng)性是否對動物和人類健康有著潛在的威脅，值得進(jìn)一步研究探索。

目前，巴爾通體感染最為高效便捷的手段就是進(jìn)行PCR檢測。SsrA(tmRNA)是存在于細(xì)菌中一類穩(wěn)定的小RNA，同時具備信使RNA和轉(zhuǎn)錄RNA的功能。本研究運(yùn)用文獻(xiàn)中[3]ssrA基因引物進(jìn)行熒光定量檢測，該基因與傳統(tǒng)的gltA片段具有相同的種屬鑒定功能，說明在大量樣本的鑒定中，通過擴(kuò)增ssrA片段并進(jìn)行序列比對，可作為一種分類巴爾通體的快速準(zhǔn)確的方法。

此次研究中，共檢測到6種基因型的巴爾通體，分別為B.elizabethae、B.phoceensis、B.japonica、B.henselae、B.rochalimae、B.tribocorum，表明廣東省鼠形動物中巴爾通體基因型具有多樣性和復(fù)雜性。其中B.elizabethae,B.henselae,B.rochalimae,B.tribocorum都已證實(shí)與人類疾病有關(guān)，可引起貓抓病、桿菌性血管瘤、菌血癥、心內(nèi)膜炎、發(fā)熱等[15]。人群中巴爾通體感染的血清學(xué)調(diào)查研究顯示，人巴爾通體抗體的血清陽性率大多在3.6%～11.0%之間，而不明原因發(fā)熱的病人中血清抗體陽性率可達(dá)到30.17%[2]。人群中大多因貓抓病引起淋巴結(jié)腫大發(fā)現(xiàn)感染，而結(jié)合這些血清學(xué)的調(diào)查表明，除了貓抓病，其他癥狀的巴爾通體感染誤診和隱性感染不容忽視。

鼠形動物可攜帶多種病原體，同時也是節(jié)肢動物的宿主，不同病原體的共生及媒介的傳播對疾病的發(fā)生起著重要作用。人類和鼠形動物之間直接和間接接觸密切，因此做好鼠傳疾病的防控工作顯得尤為重要。本研究首次證實(shí)廣東省內(nèi)鼠形動物存在巴爾通體感染，且板齒鼠也是巴爾通體的易感動物，這為廣東省內(nèi)人獸共患病防控工作提供了新的依據(jù)和研究方向。由于巴爾通體對人類潛在的危險性，有必要進(jìn)一步對巴爾通體在人群中的流行情況和傳播途徑進(jìn)行探索研究。

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