金花茶組培芽不定根誘導(dǎo)技術(shù)研究

劉芳　俞建妹　劉玉軍

摘要[目的]篩選出高生根率培養(yǎng)基配方和適宜的光照條件。[方法]以金花茶組培壯芽為材料，研究培養(yǎng)基養(yǎng)分含量、生長素種類組合和濃度配比對金花茶組培芽生根的影響，篩選適宜生根的光照條件。[結(jié)果]J、1/2 J、1/3 J和2/3 J基本培養(yǎng)基對金花茶組培芽生根率的影響存在顯著差異，大小排序為2/3 J>1/2 J>1/3 J>J；不同濃度的IBA、IAA、NAA組合對金花茶組培芽生根率影響差異顯著，正交極差分析和方差分析結(jié)果顯示，IAA起主導(dǎo)作用，IBA起輔助作用；在2/3J培養(yǎng)基中添加不同濃度Ca2+，結(jié)果表明培養(yǎng)基Ca2+濃度以2/3J的79.20 mg/L基礎(chǔ)上添加19.60 mg/L處理對金花茶組培芽生根培養(yǎng)比較適宜。[結(jié)論]最佳誘導(dǎo)金花茶組培芽生根培養(yǎng)基配方為2/3J+Ca2+ 16.90 mg/L[100 mg/L Ca（NO3）2·4H2O]+2.0 mg/L IBA+5.0 mg/L IAA+0.3 mg/L NAA。

關(guān)鍵詞金花茶；組織培養(yǎng)；根系誘導(dǎo)

中圖分類號S503.53文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2018）25-0084-03

Study on Adventitious Root Inducement of Camellia nittidissima Chi Tissue Culture Shoots

LIU Fang，YU Jianmei，LIU Yujun et al

（Nanning Tree Garden， Nanning， Guangxi 530031）

Abstract[Objective] The formulation of high rooting rate culture medium and appropriate lighting conditions were screened out.[Method] Camellia nittidissima Chi tissue culture shoot was chosen as study materials in this experiment. This study investigated factors related to type of medium， type and concentration of auxin， concentration of calcium and lighting condition.[Result] There was significant difference in rooting rate among basic mediums of J， 1/2 J， 1/3 J， 2/3 J， in which the 2/3 J medium was the best， and the following was that in 1/2 J， 1/3 J and J. Rooting rate did differ significantly among combinations of concentrations of auxins including IBA， IAA and NAA， in which shows that IAA plays a leading role and IBA plays a subsidiary role. The concentration of calcium adding 19.60 mg/L to the 2/3 J medium of 79.20 mg/L offered a better growth condition to shoot of tissue culture.[Conclusion] The optimal rooting medium for C. nittidissima tissue culture shoot was 2/3J+Ca2+ 16.90 mg/L[100 mg/L Ca（NO3）2·4H2O]+ 2.0 mg/L IBA+5.0 mg/L IAA+0.3 mg/L NAA.

Key wordsCamellia nittidissima Chi；Tissue culture；Root inducement

金花茶（Camellia nittidissima Chi）屬山茶科山茶屬，是山茶花家族中唯一具有金黃色花瓣的種類，是我國特有的傳統(tǒng)名花，是世界珍稀觀賞植物和種質(zhì)資源，也是國家8種一級重點(diǎn)保護(hù)植物之一，國內(nèi)將金花茶譽(yù)為“茶族皇后”“植物界的大熊貓”[1]，國外則稱之為“幻想中的黃色山茶”“神奇的東方魔茶”。金花茶可直接用于室內(nèi)外綠化，創(chuàng)造出獨(dú)具特色的優(yōu)美景觀。金花茶含有天然有機(jī)鍺、鋅、硒、礬等多種對人體有重要保健作用的微量元素，以及茶多酚和人體所必需的氨基酸、維生素等，在降低血糖、血脂，防癌、抗癌方面有特殊功效[2]。目前，市場上的金花茶產(chǎn)品倍受群眾青睞，而金花茶主產(chǎn)區(qū)——廣西只能滿足其銷售量的1/10。為了盡快將金花茶優(yōu)良資源應(yīng)用于社會，許多學(xué)者開展了金花茶組織培養(yǎng)技術(shù)研究。顏慕勤等[3]從1980年起陸續(xù)對7種具有重瓣、大花、芳香等特性的金花茶種進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，在1981年獲完整植株并已移栽成活；1987年廖漢刃等[4]已開展金花茶嫩莖的組織培養(yǎng)，將繼代培養(yǎng)所得莖段插于1/2MS+6-BA 1～6 mg/L培養(yǎng)基，生根率30%～80%，移栽成活率較低，最高為53%，將無根苗剪下嫁接到普通油茶或越南油茶的芽苗砧木上，成活率為78%；黃曉娜等[5]就金花茶進(jìn)行了組培苗試管外生根研究，生根率可達(dá)85%；李桂娥等[6]將無菌苗基部浸泡于500 mg/L IBA溶液中2 min，而后轉(zhuǎn)于1/3改良MS生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，生根率達(dá)86%，但生根率不穩(wěn)定或生根技術(shù)復(fù)雜。為了既能簡化生根技術(shù)，降低生產(chǎn)成本，又能獲取高的生根率，筆者就金花茶組培芽生根技術(shù)進(jìn)行了深入研究，現(xiàn)將其組培生根關(guān)鍵技術(shù)介紹如下。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為從廣西南寧樹木園標(biāo)本園內(nèi)優(yōu)選出的生長健壯、花朵繁多的金花茶植株當(dāng)年生嫩枝，通過消毒滅菌、繼代培養(yǎng)獲取高4～6 cm的壯芽。

1.2方法

1.2.1

培養(yǎng)基篩選。將組培壯芽分別接種于含有IBA 1.0 mg/L和IAA 2.0 mg/L的J（MS+NH4NO3 1 650 mg/L+Na2SO4 50 mg/L）、1/2 J、1/3 J和2/3 J基本培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基接種30瓶，6株/瓶，3次重復(fù)。培養(yǎng)40 d，記錄始根時間，統(tǒng)計每瓶苗木生根數(shù)量及每株苗木根系數(shù)量，計算生根率。

1.2.2

生長調(diào)節(jié)劑對不定根的誘導(dǎo)。IBA設(shè)0、1.0、2.0 mg/L 3個梯度，IAA設(shè)0、2.5、5.0 mg/L 3個梯度，NAA設(shè)0、0.3、0.5 mg/L 3個梯度，以2/3 J為基本培養(yǎng)基，采用L9（34）正交試驗設(shè)計，共設(shè)計9個處理，每個處理3瓶，每瓶接種5個組培壯芽，重復(fù)3次，接種40 d統(tǒng)計芽生根率。

1.2.3

Ca2+濃度對不定根的誘導(dǎo)。以①2/3 J+IBA 2.0 mg/L+IAA 5.0 mg/L+NAA0.3 mg/L為對照，對照培養(yǎng)基Ca2+ 濃度79.20 mg/L，在此基礎(chǔ)上分別添加②Ca2+ 濃度8.45 mg/L[50 mg/L Ca（NO3）2·4H2O]，③Ca2+ 濃度16.90 mg/L[100 mg/L Ca（NO3）2·4H2O]，④Ca2+ 濃度25.40 mg/L[150 mg/L Ca（NO3）2·4H2O]，⑤Ca2+ 濃度33.80 mg/L[200 mg/L Ca（NO3）2·4H2O]，每個處理接種45個組培壯芽，3次重復(fù)，接種40 d統(tǒng)計芽生根率。

1.2.4

光照強(qiáng)度對不定根的誘導(dǎo)。將組培壯芽接種于2/3 J+Ca2+ 16.90 mg/L+IBA 2.0 mg/L+IAA 5.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L培養(yǎng)基內(nèi)，首先置于800～2 000 lx的光照條件下培養(yǎng)7～10 d，之后分別置于自然散射光為800～2 000、2 500～3 500、4 000～6 000和6 500～8 000 lx的光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每種處理擺放10瓶，9株/瓶，3次重復(fù)，培養(yǎng)40 d統(tǒng)計生根率，記錄根的形態(tài)特征。

1.3培養(yǎng)條件

在上述所有培養(yǎng)基中添加蔗糖30 g/L、瓊脂4.5 mg/L，pH 5.8，培養(yǎng)基經(jīng)高溫高壓（121 ℃，0.14 MPa）滅菌20 min。除試驗外，將生根瓶苗置于800～2 000 lx的光照條件下培養(yǎng)7～10 d，再置于4 000～6 000 lx的光照條件下培養(yǎng)，光照時間12～14 h/d，培養(yǎng)室溫度（25±3）℃，光照主要來源于太陽光。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Office Excel 2007，DPS7.05統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，公式如下：生根率=生根苗數(shù)/接種芽總數(shù)×100%；平均根數(shù)=生根苗根系總數(shù)/生根苗數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)基養(yǎng)分含量對組培芽生根的影響

在植物組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)物不同的生長發(fā)育階段對培養(yǎng)基養(yǎng)分的要求不一致，芽增殖和生長階段需要培養(yǎng)基內(nèi)含有較高濃度的無機(jī)鹽，而生根階段為了避免芽徒長，利于芽生根，要求培養(yǎng)基無機(jī)鹽濃度相對偏低。為了篩選適宜的生根基本培養(yǎng)基，將組培壯芽接種于不同無機(jī)鹽濃度的培養(yǎng)基中進(jìn)行試驗，結(jié)果詳見表1。

由表1可知，不同養(yǎng)分培養(yǎng)基中金花茶組培芽生根率大小排序為4號、2號、3號、1號，除3號外，隨著培養(yǎng)基無機(jī)鹽的減少，組培芽生根率由0逐漸提高，生根率最高的是4號培養(yǎng)基（51.70%）。MS屬高濃度無機(jī)鹽培養(yǎng)基，NH+4和NO-3含量均較高，高N培養(yǎng)基對芽生長有利但對根系的發(fā)生和生長存在抑制作用。該試驗中，使用J全量的1號培養(yǎng)基，N含量較高，芽生根率為0；3號培養(yǎng)基，芽始根時間較晚，接種25 d才生根，且根系細(xì)弱，這可能是因為3號培養(yǎng)基養(yǎng)分含量少，僅1/3 J，無法提供足夠芽生根需要的養(yǎng)分；4號培養(yǎng)基無機(jī)鹽濃度比較適宜金花茶不定根誘導(dǎo)和生長，始根時間早，僅15 d，分別比2號和3號培養(yǎng)基早4、10 d，且根系健壯。

2.2生長調(diào)節(jié)劑對不定根誘導(dǎo)的影響

極差分析結(jié)果表明（表2），參試因素之間極差值大小排序為B>A>C，B對金花茶繼代芽不定根誘導(dǎo)起著主導(dǎo)作用，A為輔助作用。在A濃度為0、2.0 mg/L時，芽的生根率隨著B濃度的增加而提高，A濃度為2.0 mg/L的處理中，B濃度增加到5.0 mg/L的9號處理，芽的生根率最高（80.00%），比7號和8號處理的生根率分別高349.94%和157.15%，最適宜的組合是A3B3C2。極差分析結(jié)果表明，A、B因素 k3值分別為42.96和49.63，均大于相應(yīng)因素的k1和k2，C因素k2值則最大（40.74），結(jié)果最優(yōu)組合也是A3B3C2，可見理論分析結(jié)果和試驗實(shí)際結(jié)果相一致，該試驗金花茶組培芽生根培養(yǎng)基最理想的生長調(diào)節(jié)劑組合和濃度配比為IBA2.0 mg/L+IAA5.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L。

為了進(jìn)一步檢驗IAA、IBA和NAA組合和濃度配比對金花茶組培芽生根影響的差異性，對芽生根率結(jié)果進(jìn)行了方差分析，結(jié)果表明生根率方差分析結(jié)果的P=0<0.05，說明IAA、IBA和NAA對組培芽生根率影響的差異極顯著，影響大小表現(xiàn)為IAA>IBA>NAA，與極差分析結(jié)果一致。

2.3Ca2+濃度對組培芽生根的影響

由圖1可知，隨著培養(yǎng)基內(nèi)Ca2+的增加，金花茶組培芽生根率先增加后減少，生根率大小排序為③>②>④>①>⑤。①～③處理，組培芽生根率隨著培養(yǎng)基內(nèi)Ca2+濃度的增加逐漸提高，當(dāng)添加Ca2+濃度16.90 mg/L（處理③）時，生根率達(dá)到高峰（95.60%），之后Ca2+濃度增加，生根率逐漸下降，Ca2+濃度最高的處理⑤生根率最低（僅66.70%），且苗木根系數(shù)量也少，因為高Ca2+濃度下根系表面會附著一層白色黏膜抑制新根的生長[7]。該試驗以在對照培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加16.90 mg/L Ca2+的處理③對金花茶組培芽生根培養(yǎng)比較適宜。

2.4光照強(qiáng)度對金花茶組培芽生根的影響

由圖2可知，不同光照條件影響下，金花茶組培芽的生根率不一致。800～2 000 lx光照處理生根率偏低（僅59.30%），2 500～3 500 lx光照強(qiáng)度有所提高，生根率隨之提高（72.60%），4 000～6 000 lx光照處理生根率達(dá)最大值（96.30%），分別比800～2 000、2 500～3 500 lx光照處理的生根率高62.39%和32.64%。光照強(qiáng)度提高到6 500～8 000 lx時，因光照過強(qiáng)，組培芽有不同程度的灼傷現(xiàn)象，有的芽葉片被灼傷，有的整顆芽被灼傷致死，芽的生長力大大減弱，生根率嚴(yán)重下降（僅63.00%）。所以，金花茶組培芽生根培養(yǎng)比較理想的光照條件為接種初期在800～2 000 lx光照下培養(yǎng)7～10 d，然后置于4 000～6 000 lx光照強(qiáng)度下繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)15～20 d根點(diǎn)長出，30～40 d根系長1.0～1.5 cm，此時可以將生根苗移至環(huán)境條件比較接近大氣候的大棚煉苗。

3結(jié)論與討論

（1）試驗結(jié)果表明，IBA、IAA和NAA組合和不同濃度配比對金花茶組培芽生根率的影響存在顯著差異，IAA起主導(dǎo)作用，IBA起輔助作用。金花茶組培芽生根對NAA濃度反應(yīng)比較敏感，當(dāng)培養(yǎng)基內(nèi)NAA濃度提高到0.5 mg/L時，芽基部愈傷組織豐富，愈傷頭直徑一般為0.3～0.7 cm，芽體發(fā)育形成的根系粗短，玻璃化嚴(yán)重。此現(xiàn)象與吳幼媚等[8]在油

茶組培苗生根中的研究結(jié)果一致。是否因為NAA濃度較

高，加速了它在芽體內(nèi)運(yùn)輸和細(xì)胞分裂的速度，引起細(xì)胞分裂失衡，導(dǎo)致萌發(fā)的根系玻璃化有待深入研究。

（2）在2/3 J培養(yǎng)基中添加適量的Ca（NO3）2·4H2O，一方面給培養(yǎng)的苗木提供更充足的Ca2+，同時NO-3能促進(jìn)植物對K+、Ca2+、Mg2+等陽離子的吸收，這與前人的研究結(jié)果一致[9]。試驗中，當(dāng)培養(yǎng)基內(nèi)Ca2+濃度為16.90 mg/L時，生根率從對照的80.00%提高到95.60%，始根時間從25 d提前到15 d。而當(dāng)Ca2+濃度為33.80 mg/L時，抑制了組培芽生根，生根率僅66.70%。這可能是因為Ca2+濃度過高，使根系細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)Ca2+增加過多，液泡中有機(jī)酸的釋放受到影響，液泡中有機(jī)酸的積累加劇，pH平衡受到破壞，導(dǎo)致植株根系衰亡[8]。由此說明金花茶組培芽生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)Ca2+濃度為96.10 mg/L（2/3 J+16.90 mg/L）比較適宜，其生長機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

（3）該試驗組培芽光照來源于太陽散射光，通過對光照強(qiáng)度和光照時間的調(diào)節(jié)，充分發(fā)揮了太陽光對金花茶組培苗生長的促進(jìn)作用。組培壯芽扦插于生根培養(yǎng)基內(nèi)，首先在800～2 000 lx光照下培養(yǎng)7～10 d，然后置于4 000～6 000 lx 光照強(qiáng)度下繼續(xù)培養(yǎng)者，生根率高達(dá)90%～96%，而置于6 500～8 000 lx強(qiáng)光照條件繼續(xù)培養(yǎng)者，因芽受到灼傷生根率顯著下降。因此，金花茶生長雖然需要一定的庇蔭條件，但在組織培養(yǎng)過程中要求光照強(qiáng)度不能過低，否則，滿足不了葉片光合作用需要的光能，降低了有機(jī)養(yǎng)分合成能力而引起營養(yǎng)缺乏，芽生長力減弱，從而影響生根率。但也不能過強(qiáng)，否則會造成芽灼傷，嚴(yán)重致死，導(dǎo)致生根率偏低，其詳細(xì)機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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