HPLC法測定發(fā)酵面制品中苯甲酸和山梨酸的含量

田莉 李靜峰 張仁正

摘要[目的]建立HPLC法測定發(fā)酵面制品中苯甲酸、山梨酸含量的方法。[方法]色譜柱為Thermo AcclaimTM C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.02 mol/L乙酸銨溶液（7∶93，V/V）；流速1.0 mL/min；檢測波長230 nm；柱溫35 ℃。[結(jié)果]該方法具有良好的精密度與穩(wěn)定性，苯甲酸、山梨酸分別在2.33～27.96、2.22～26.63 μg/mL線性良好，其平均回收率分別為93.0%、94.7%。[結(jié)論]該方法簡便、易操作、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，適用于發(fā)酵面制品中苯甲酸、山梨酸含量的檢測。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法；發(fā)酵面制品；苯甲酸；山梨酸

中圖分類號 TS202.3 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）22-0157-02

Abstract[Objective]The research aimed to establish method for determination of benzoic acid and sorbic acid in the fermented flour products by HPLC.[Method]The chromatographic separation was performed on Thermo AcclaimTM C18 column （250 mm×4.6 mm，5 μm）using methanol-0.02 mol/L ammonium acetate solution as mobile phase of 7∶93 at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was set at 35 ℃. The detection wavelength was 230 nm.[Result]The method had good precision and stability.The calibration curves established showed good linearity over the concentration ranges of 2.33-27.96 （benzoic acid），2.22-26.63 μg/mL （sorbic acid）， and average recovery was 91.8%，93.1% respectively.[Conclusion]The method is simple， accurate and reproducible， it is suitable for determination of benzoic acid and sorbic acid in the fermented flour products， it is applicable to determinte benzoic acid and sorbic acid in the fermented flour products.

Key words HPLC；Fermented flour products；Benzoic acid；Sorbic acid

發(fā)酵面制品是以小麥粉和水為原料，添加或不添加雜糧，加入以酵母菌為主的發(fā)酵劑，經(jīng)和面、發(fā)酵、中和、加入其他調(diào)味料、揉和成型、醒發(fā)、汽蒸、冷卻而成的食品[1]。發(fā)酵面制品是我國居民的主要食品，尤其在北方地區(qū)，發(fā)酵面制品占主食的70%以上，主要是家庭自制或作坊式的小規(guī)模生產(chǎn)，也有食品企業(yè)加工好的冷凍發(fā)酵面制品。

苯甲酸、山梨酸是常用的防腐劑，苯甲酸可以用作食品、飼料、乳膠、牙膏的防腐劑，在酸性條件下，對霉菌、酵母和細菌均有抑制作用。山梨酸是國際糧農(nóng)組織和衛(wèi)生組織推薦的高效安全的防腐保鮮劑，廣泛用于食品、煙草、農(nóng)藥、化妝品等行業(yè)，對酵母、霉菌和許多真菌都有抑制作用。山梨酸的毒副作用比苯甲酸小得多，不會對人的身體健康造成不利影響。

發(fā)酵面制品作為我國居民的主要食品，是國家食品安全監(jiān)督每年必抽檢項目，檢驗其中防腐劑、甜味劑、微生物等指標(biāo)，監(jiān)督其質(zhì)量安全和衛(wèi)生狀況。根據(jù)GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)定[2]，在發(fā)酵面制品中不得使用苯甲酸、山梨酸。但有些商家為了延長面制品的保質(zhì)期，在其中非法加入苯甲酸和山梨酸等防腐劑。這些防腐劑對人的身體或多或少都有影響，長期食用或食用過量會對人體產(chǎn)生毒副作用，因此對發(fā)酵面制品等主食進行質(zhì)量安全控制尤為重要[3-4]。此前，也有很多關(guān)于食品中苯甲酸和山梨酸含量測定的文獻[5-7]，但是并無發(fā)酵面制品防腐劑的相關(guān)報道。筆者以高效液相色譜法（HPLC）[8]測定發(fā)酵面制品中苯甲酸、山梨酸的含量，為其防腐劑的檢驗提供了方法，也為監(jiān)督發(fā)酵面制品的質(zhì)量安全提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 戴安Ultimate 3000液相色譜儀（帶紫外檢測器）；梅特勒電子天平（感量0.01 mg）；Centrifuge 5810R型高速冷凍離心機（Eppendorf有限公司）；KQ-500DA型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑 苯甲酸對照品（批號30618，純度99.5%，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；山梨酸對照品（批號90622，純度99.0%，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；乙酸銨（分析純，成都市科龍化工試劑廠），甲醇（色譜純，Tedia Company，lnc）。水為超純水。微孔濾膜：水系0.45 μm。

1.3 陽性樣品的制備 稱取500 g面粉，放于容器內(nèi)，在250 mL 水中加入一定量食品級苯甲酸、山梨酸及5.00 g酵母，混勻，將上述水溶液倒入面粉中，將其揉勻，待發(fā)酵后，蒸熟，即得模擬陽性樣品。

1.4 對照品溶液的配制

1.4.1 對照品儲備液。分別精密稱取對照品苯甲酸0.011 71 g、山梨酸0.011 21 g，分別置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶液溶解，定容至刻度，即得。

1.4.2 混合對照品溶液。分別精密量取10 mL苯甲酸儲備液、5 mL山梨酸儲備液一起置于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，其濃度分別為23.30、11.10 μg/mL。

1.5 供試品溶液的制備 將上述陽性樣品粉碎均勻，稱取5.00 g 均勻樣品，置于50 mL具塞離心管中，加水30 mL，搖勻，在40 ℃水浴中超聲15 min，定容至刻度，離心5 min（8 000 r/min），取上清液過0.45 μm微孔濾膜，待測。

1.6 色譜條件 色譜柱為Thermo AcclaimTM C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.02 mol/L乙酸銨溶液（7∶93，V/V）；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長230 nm；柱溫35 ℃。

1.7 方法學(xué)考察

1.7.1 線性關(guān)系考察。分別精密吸取苯甲酸、山梨酸儲備液0.1、0.3、0.6、0.8、1.0、1.2 mL置于10 mL容量瓶中，定容至刻度。分別注入液相色譜儀測定，進樣體積為10 μL。

1.7.2 重復(fù)性試驗。精密稱取模擬陽性樣品5 g，共6份，按“1.5”方法制備供試品液，按“1.6”色譜條件測定，計算苯甲酸、山梨酸相對峰面積的RSD，要求該值小于3%。

1.7.3 精密度試驗。精密吸取同一供試品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，按“1.6”色譜條件進行測定，計算苯甲酸、山梨酸峰面積的RSD，要求該值小于3%。

1.7.4 穩(wěn)定性試驗。取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，按“1.6”色譜條件測定，計算所測苯甲酸、山梨酸峰面積的RSD，要求其值小于3%。

1.7.5 檢出限的測定。精密量取4.661 μg/mL苯甲酸、4.439 μg/mL山梨酸混合對照品液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 分別置于裝有空白樣品的容量瓶中，按照“1.5”方法制備供試品溶液，按“1.6”色譜條件測定，記錄相應(yīng)保留時間處這2種物質(zhì)的峰高，與基線噪音峰高之比，以信噪比為3∶1來確定最低檢出限。

1.7.6 加樣回收率試驗。分別精密量取23.30 μg/mL苯甲酸、11.10 μg/mL山梨酸混合對照品溶液10、20、30 mL，加入到模擬陽性樣品中，按“1.5”方法制備供試品溶液；分別注入液相色譜儀，計算苯甲酸、山梨酸的含量，計算加樣回收率及RSD。

2 結(jié)果與分析

2.1 對照和樣品色譜圖 分別吸取對照混合溶液及陽性樣品溶液注入液相色譜儀，按“1.6”色譜條件運行，記錄色譜圖，對照色譜峰與相鄰色譜峰完全分離，見圖1。

2.2 線性關(guān)系考察 按“1.6”色譜條件測定，記錄色譜圖，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出苯甲酸和山梨酸的回歸方程分別為y=0.417 0x-0.080 7（r=0.999 5）、y=0.735 0x-0.115 9（r=0.999 4），表明其分別在2.33～27.96、2.22～ 26.63 μg/mL與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.3 重復(fù)性試驗 將6份試樣，按“1.5”方法制備供試品溶液，“1.6”色譜條件進行測定，測得苯甲酸、山梨酸相對峰面積的RSD分別為0.80%、0.75%，表明該方法操作重復(fù)性良好。

2.4 精密度試驗 同一供試品溶液連續(xù)進樣6次，按“1.6”色譜條件進行測定，得出苯甲酸、山梨酸峰面積的RSD分別為0.19%、0.20%，表明該方法與儀器具有良好的精密度。

2.5 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，按“1.6”色譜條件測定，所測苯甲酸、山梨酸峰面積的RSD分別為1.20%、0.91%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 檢出限的測定 按照“1.7.5”操作，結(jié)果表明以苯甲酸0.5 mL、山梨酸0.4 mL作為檢出限。當(dāng)稱樣量為5.00 g，苯甲酸、山梨酸的檢出限分別為0.47、0.36 mg/kg。

2.7 加樣回收率試驗 分別精密量取23.30 μg/mL苯甲酸、11.10 μg/mL山梨酸混合對照品溶液10、20、30 mL，加入到模擬陽性樣品中，苯甲酸、山梨酸的含量、回收率和RSD的結(jié)果見表1。由表1可知，苯甲酸、山梨酸的平均回收率分別為93.0%、94.7%，RSD分別為1.8%和1.2%。

3 討論與結(jié)論

在國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.28—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》中，規(guī)定了部分食品品種中苯甲酸、山梨酸的檢測方法。按照此方法，需要試劑、離心2次，超聲20 min等步驟提取，如果是大批次檢測，其提取方法還是會花費大量時間和成本，該試驗的提取方法簡單、準(zhǔn)確，不用任何試劑，在時間和成本上均有很大的優(yōu)勢。

該試驗中苯甲酸、山梨酸分別在2.33～27.96、2.22～26.63 μg/mL 線性良好，其平均回收率分別為93.0%、94.7%，RSD分別為1.8%和1.2%。表明該方法簡便、易操作、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，適用于發(fā)酵面制品中苯甲酸、山梨酸含量的檢測。

在發(fā)酵面制品的抽檢工作中，每年都有樣品檢出苯甲酸、山梨酸的情況，但是根據(jù)GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，苯甲酸、山梨酸在發(fā)酵面制品中是不得使用的。在市場上，各類包子的面皮也是發(fā)酵面制品。針對包子樣品，該試驗是把餡料全去掉，只做面皮，大部分樣品中也會有微量的苯甲酸或（和）山梨酸檢出，剛開始出現(xiàn)這種情況時，每次都會把餡料也檢測，和面皮做對比判斷。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低含量的陽性樣品是餡料帶入的，因為在各種餡料制作過程中，一般會加入醬油、醬、醬腌菜類或其他調(diào)味料（在這些調(diào)味料中苯甲酸、山梨酸是可以使用的）。當(dāng)檢出低含量的苯甲酸或（和）山梨酸時，根據(jù)餡料的種類，應(yīng)該考慮“帶入原則”，以免誤判樣品不合格。

參考文獻

[1]河南省衛(wèi)生和計劃生育委員會.發(fā)酵型蒸制面制品：DBS 41/002—2015[S].河南省衛(wèi)生和計劃生育委員會，2015.

[2]中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化委員會.食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)：GB 2760—2014[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2015.

[3]劉志皋，高彥祥.食品添加劑基礎(chǔ)[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2012：45-46，168-169.

[4]蘇建國，彭進.UPLC同時測定風(fēng)味飲料中安賽蜜、糖精鈉、苯甲酸、山梨酸方法研究[J]. 中國食品添加劑，2011，21（2）：243-245.

[5]田莉，張仁正，李靜峰，等.HPLC法測定熟肉制品中苯甲酸、山梨酸和脫氫乙酸的含量[J]. 中國食品添加劑，2016（10）：172-175.

[6]田莉，張炯怡，李靜峰，等. HPLC法測定涼拌菜中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的含量[J].中國調(diào)味品，2016，41（6）：132-134.

[7]陳青川.軟飲料中苯甲酸山梨酸含量的測定及其調(diào)查[J].中國公共衛(wèi)生，2000，16（8）：741-742.

[8]中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化委員會.食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定：GB 5009.28—2016[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2017.