山西地區(qū)仔兔腹瀉源大腸桿菌的分離·鑒定及耐藥性分析

王國艷 孫樂天 張國權(quán)

摘要[目的]調(diào)查山西地區(qū)仔兔腹瀉源致病性大腸桿菌的耐藥性。[方法]從山西地區(qū)不同兔養(yǎng)殖場采集110份因腹瀉死亡的仔兔腸道內(nèi)容物，進行病原分離，并通過菌落形態(tài)觀察和生化試驗對其進行鑒定。開展動物致病性試驗，最后采用K-B紙片法用14種抗生素對分離菌株進行藥物敏感性測定。[結(jié)果]共分離出60株細菌，通過菌落形態(tài)觀察和生化試驗均鑒定為大腸桿菌。藥敏試驗結(jié)果表明，分離的60株大腸桿菌對阿米卡星的耐藥率為0，而對慶大霉素、鏈霉素、多粘菌素B、卡那霉素、氧氟沙星、諾氟沙星、痢特靈、頭孢克羅、阿莫西林、頭孢曲松、頭孢哌酮、氯霉素、磷霉素13種常見藥物均表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，其中對頭孢曲松、磷霉素、多粘菌素B、阿莫西林、痢特靈、氯霉素、頭孢哌酮的耐藥率均在80%以上；分離菌株對卡那霉素的耐藥率最低，為3.3%。[結(jié)論]山西地區(qū)仔兔腹瀉源致病性大腸桿菌對13種抗生素產(chǎn)生了普遍的耐藥性，建議進一步擴大藥物的篩選范圍，為大腸桿菌病的防制和臨床用藥的風險評估提供科學依據(jù)。

關(guān)鍵詞 仔兔；腹瀉；大腸桿菌；耐藥性

中圖分類號 S855 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）22-0069-02

Abstract [Objective] To investigate the drug resistance of pathogenic Escherichia coli derived from baby rabbits with diarrhea in Shanxi area. [Method] 110 samples of intestine contents of diarrheainfected rabbits were collected from different rabbit farms of Shanxi to separate pathogen. And the pathogen was identified by colony characteristics observation and biochemical test. The animal pathogenicity test was made and the drug sensitivity of isolated bacteria to 14 kinds of antibiotics were determined by using KB disk diffusion method. [Result] 60 strains of pathogen were isolated and identified as E.coli by colony characteristics observation and biochemical test.The results of drug sensitivity test showed that the drug resistance rate of isolated strains to amikacin was 0，and isolated strains showed different drug resistance to 13 kinds of antibiotics（gentamicin， streptomycin， polymyxin B， kanamycin， ofloxacin， norfloxacin， furazolidone， cefaclor， amoxicillin， ceftriaxone， cefoperazone， chloramphenicol and fosfomycin）. The drug resistance rate of isolated strains to ceftriaxone， fosfomycin， polymyxin B， amoxicillin， furazolidone， chloramphenicol and cefoperazone were all above 80%. The drug resistance rate of isolated strains to kanamycin was the lowest，being 3.3%. [Conclusion] The pathogenic E.coli derived from baby rabbits with diarrhea in Shanxi area had common drug resistance to 13 kinds of antibiotics，therefore it was suggested that the screening scope of drugs should be further expanded ，so as to provide scientific basis for the prevention and control of rabbit colibacillosis and clinical drugs risk assessment.

Key words Baby rabbit；Diarrhea；Escherichia coli；Drug resistance

仔兔腹瀉是兔養(yǎng)殖過程中常見的疾病。該病發(fā)病率高，病因復雜且難以治愈，死亡率高，嚴重制約著兔養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。引起仔兔腹瀉的誘因十分復雜，既有病原微生物因素，也有非病原微生物因素[1-2] 。病原微生物以大腸桿菌、沙門氏菌病、螺形梭菌、魏氏梭菌、輪狀病毒、球蟲、粗毛細紋線蟲等為主[3]。

大腸桿菌廣泛存在于環(huán)境中，發(fā)病率相對較高，無明顯的季節(jié)性。當仔兔感染大腸桿菌時，往往會出現(xiàn)急性腹瀉，造成仔兔短期內(nèi)大量死亡。由于飲水是仔兔感染大腸桿菌的一個重要途徑，因此，一旦發(fā)生容易造成流行[4-5]。

不同動物源大腸桿菌的血清型比較復雜，目前兔源大腸桿菌病尚無理想的疫苗來預防，臨床上治療兔源大腸桿菌感染的主要措施仍是使用各類抗生素，但由于抗生素的超劑量和頻繁使用以及以亞治療劑量添加于飼料中作為促生長劑及藥物的不規(guī)范使用，使其耐藥譜不斷擴大，產(chǎn)生的多重耐藥情況越來越普遍，常使得臨床治療面臨無藥可用的困境[6-9]。大腸桿菌可通過菌毛將耐藥質(zhì)粒傳遞給其他大腸桿菌[6]，因而給大腸桿菌病的防治帶來了較大的挑戰(zhàn)。

筆者從山西地區(qū)不同兔養(yǎng)殖場采集110份因腹瀉死亡的仔兔腸道內(nèi)容物，分離出致病菌，并通過菌落形態(tài)觀察和生化試驗對其進行鑒定，采用K-B紙片擴散法進行藥敏試驗，以期為兔大腸桿菌病的防制和臨床用藥的風險評估提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源

選取山西地區(qū)不同兔養(yǎng)殖場因腹瀉病死亡的仔兔，通過無菌操作，采集其腸內(nèi)容物110份。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

LB瓊脂平板、LB肉湯以及麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基，均購自青島日水生物技術(shù)有限公司；ID32E 腸道菌鑒定試劑條，購自法國梅里埃公司；藥敏紙片，購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.3 試驗器材

超凈無菌工作臺、高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、數(shù)顯水浴恒溫振蕩器、ATB 1525 EXPRESSION微生物鑒定和藥敏分析儀、顯微鏡。

1.4 病原的分離與菌落形態(tài)觀察

用接種環(huán)無菌挑取各腸道內(nèi)容物病料，分別加入5 mL的肉湯培養(yǎng)液中，于37 ℃溫箱培養(yǎng)18～24 h，觀察肉湯濁度；再用接種環(huán)蘸取菌液劃線接種于普通瓊脂平板，37 ℃下培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落顏色和形態(tài)；挑取疑似大腸桿菌的優(yōu)勢菌落再次劃線接種于麥康凱瓊脂平板，37 ℃下培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落顏色；挑取典型的優(yōu)勢菌落接種到伊紅美藍平板上培養(yǎng)，進行革蘭氏染色并鏡檢。

1.5 生化試驗

按照ID32E腸道菌鑒定試劑條說明書對純化培養(yǎng)的分離菌株進行生化試驗。

1.6 動物致病性試驗

20只健康小鼠（平均體質(zhì)量30 g），購自山西醫(yī)科大學實驗動物中心。

挑取純培養(yǎng)物的單個菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃搖菌18～24 h。將所得菌液分別接種10只健康小鼠，腹腔注射菌懸浮液0.2 mL/只。選用10只健康小鼠，腹腔注射 0.2 mL LB液體培養(yǎng)基，作為陰性對照。觀察病變，采集病料并進行細菌分離與培養(yǎng)。

1.7 藥敏試驗

采用K-B紙片擴散法對頭孢克羅、阿米卡星、鏈霉素、氧氟沙星、氯霉素、磷霉素、頭孢曲松、慶大霉素、諾氟沙星、多粘菌素B、頭孢哌酮、痢特靈、卡那霉素、阿莫西林14種抗生素進行藥敏試驗，37 ℃下培養(yǎng)18～24 h后測定抑菌圈直徑。耐藥性結(jié)果根據(jù)美國臨床實驗室國家標準化委員會（NCCLS）制定的標準判定。依據(jù)美國臨床實驗室標準委員會（NCCLS）制定的標準判斷，即抑菌圈直徑≥20 mm，為高度敏感；16 mm<抑菌圈直徑<20 mm，為中度敏感；抑菌圈直徑≤16 mm，為耐藥。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌的分離與菌落形態(tài)觀察

普通肉湯中呈現(xiàn)明顯混濁，有沉淀物，且在管壁形成菌環(huán)。普通瓊脂平板上生長的菌落呈圓形、濕潤、不透明、邊緣整齊、表面隆起的光滑菌落，顏色呈乳白色；將瓊脂平板上的優(yōu)勢菌落接種在麥康凱瓊脂平板后，有粉紅色、圓形、濕潤、不透明、邊緣整齊、表面隆起的光滑菌落生長；在伊紅美藍平板上長出深紫黑色、帶金屬光澤的圓形菌落。革蘭氏染色鏡檢可見兩端鈍圓桿狀菌，與大腸桿菌的培養(yǎng)特性相一致，初步共分離出60株。

2.2 生化試驗結(jié)果

生化試驗結(jié)果表明，60株分離株的V-P試驗結(jié)果均呈陰性，吲哚試驗結(jié)果均呈陽性，均產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解尿素，能發(fā)酵甘露醇、葡萄糖、海藻糖、麥芽糖、阿拉伯糖、鼠李糖等，鑒定均為大腸桿菌，與《伯杰細菌鑒定手冊》中大腸桿菌的生化特性相一致。

2.3 動物致病性試驗

動物致病性試驗結(jié)果表明，對照組小鼠的腹瀉率為0，試驗組小鼠的腹瀉率為90%。剖檢腹瀉小鼠并采集肝臟及腸道內(nèi)容物，進行細菌分離培養(yǎng)，能夠得到與原分離菌株一致的病原菌。

2.4 藥敏試驗結(jié)果

利用14種抗生素分別對60株兔源大腸桿菌進行藥敏試驗，耐藥性結(jié)果見表1。由表1可知，分離的60株兔源大腸桿菌對阿米卡星敏感，而對頭孢曲松、頭孢哌酮、卡那霉素、多粘菌素B、鏈霉素、磷霉素、痢特靈、阿莫西林均呈現(xiàn)出不同程度的耐藥性。其中，分離菌株對頭孢曲松的耐藥性最高，達100%；分離菌株對卡那霉素的耐藥率最低，為3.3%；分離菌株對其余12種抗生素的耐藥性為5.0%～98.3%。

3 結(jié)論與討論

該試驗通過細菌的分離培養(yǎng)、染色鏡檢、生化試驗等方法對110份內(nèi)臟組織及腸內(nèi)容物中的大腸桿菌進行了分離與鑒定。結(jié)合菌落在平板上的乳白色菌落、染色鏡檢呈陰性桿菌、生化試驗結(jié)果，共分離出60株大腸桿菌，通過動物致病性試驗，推測其是引起該兔場仔兔腹瀉的優(yōu)勢菌株。

藥敏結(jié)果表明，分離的60株大腸桿菌除對阿米卡星的耐藥率為0外，對卡那霉素、慶大霉素、氧氟沙星、頭孢曲松、多粘菌素B、磷霉素、阿莫西林、痢特靈、氯霉素、頭孢哌酮、頭孢克羅、鏈霉素、諾氟沙星均表現(xiàn)出不同程度的耐藥性。其中，頭孢曲松的耐藥率最高（100%），這與李守現(xiàn)[10]報道的山東省部分規(guī)模化兔場分離的大腸桿菌對頭孢曲松的耐藥率為 17.98%結(jié)論不同，與張炳亮等[11]報道的洛陽地區(qū)規(guī)?；i場大腸桿菌對頭孢曲松的耐藥率（17.6%）有所差異。這說明不同地區(qū)、不同動物源大腸桿菌的耐藥性不同。該試驗結(jié)果表明分離的大腸桿菌對諾氟沙星的耐藥率為13.3%，與坤清芳等[12]報道的四川省兔源大腸桿菌對諾氟沙星的耐藥率（46.39%）不同。該試驗結(jié)果表明分離的大腸桿菌對慶大霉素的耐藥率為5%，與坤清芳等[13]報道的四川地區(qū)兔源大腸桿菌對慶大霉素的耐藥率（56.52%）不同。該試驗結(jié)果表明分離的大腸桿菌對氯霉素的耐藥率為81.7%，與葉超群等[14]報道的泰安寧陽地區(qū)兔源大腸桿菌對氯霉素的耐藥率（25%）有所不同。這表明不同地區(qū)相同動物源大腸桿菌的耐藥性也不同。該研究結(jié)果與石彬等[15]報道的四川涼山州建昌鴨源大腸桿菌對阿米卡星的耐藥率（0）相同，說明不同地區(qū)不同動物源大腸桿菌的耐藥性有可能相同。該研究結(jié)果與王志宇等[16]報道的山西地區(qū)雞源大腸桿菌對阿米卡星的耐藥率（53.33%）不同，表明同一地區(qū)不同動物源大腸桿菌耐藥性不同。

綜上所述，大腸桿菌的耐藥性比較復雜，而山西省兔源大腸桿菌的耐藥性較為嚴重，已成為獸醫(yī)臨床用藥中的一個嚴重問題，臨床上應避免長期使用同一種藥物；細菌的耐藥性通過染色體或質(zhì)粒介導在細菌間傳播和擴散[6-16]。該研究結(jié)果為進一步深入研究兔源大腸桿菌耐藥性機制奠定了基礎(chǔ)。

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