吡格列酮通過下調Toll樣受體/核因子-κB信號通路對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用

孫 軍 溫昌明 張保朝 聞公靈 周 靜

(南陽市中心醫(yī)院神經(jīng)內科，河南 南陽 473003)

缺血性腦血管病的治療方法主要包括溶栓治療、降纖藥物治療、抗血小板治療、抗凝治療、中藥治療及外科手術治療等。溶栓治療是指通過血管再通恢復局部供血，但進行再灌注則會加重缺血組織的進一步損傷〔1〕。局灶性腦缺血再灌注損傷中先天性免疫應答及炎癥反應起著重要作用〔2～4〕。Toll樣受體(TLR)4在炎癥反應中起重要作用，缺血再灌注中，TLR4/核因子(NF)-κB信號轉導途徑可引起NF-κB轉移，NF-κB的活化可進一步誘導白細胞介素(IL)-6、IL-1、腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎性因子的表達，引起炎癥反應并加重損傷，誘導神經(jīng)細胞凋亡〔5，6〕。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ是一種配體激活型核轉錄因子，屬于Ⅱ型核受體超家族，在體內多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用〔7〕。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ激動劑在多種臟器缺血再灌注損傷動物模型中，能減輕其缺血再灌注病理損傷，說明PPARγ具有抑制炎癥反應和炎性因子表達的功能〔8〕。本試驗觀察吡格列酮對局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用及對大鼠外周血中IL-6、TNF-α含量及腦組織中TLR4、NF-κB表達的影響，探討其腦保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 吡格列酮購于連云港德源藥業(yè)有限責任公司，TLR4、NF-κB抗體購自英國Abcam公司，鼠抗IL-6、TNF-α單克隆抗體、鏈霉親和素-生物素復合物(SABC)免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑購于武漢博士德公司，辣根酶標記山羊抗小鼠免疫球蛋白(Ig)G購于中杉金橋，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購于美國R&D公司，Trizol Trizol、反轉錄試劑盒(PrimerScriptTM RT reagent Kit)、熒光定量試劑(SYBR Green I)購于日本TaKaRa公司。低溫高速離心機購于北京醫(yī)用離心機廠，Multiskan MK3 型酶標儀購于芬蘭 Thermo Labsys2tems公司，熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)儀購于瑞士Roche公司。

1.2大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷模型制備 術前12 h禁食，自由飲水，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3 ml/kg)大鼠，仰臥固定于手術臺上，頸部正中切口，分離左側頸總動脈(CCA)、頸內動脈(ICA)和頸外動脈(ECA)，結扎CCA和ECA，在ECA結扎點近端用1 ml注射器針頭刺一小口，將選取好的栓線自左ECA 插入CCA分叉處，固定線栓，剪斷ECA結扎點近心端。調整方向，將線栓插入左ICA，輕柔推進，長度約為(18±0.5)mm，阻斷大腦中動脈，造成局灶性腦缺血。阻斷2 h后，拔出栓線，進行再灌注。假手術組僅進行麻醉和血管分離，不導入栓線。造模后將大鼠放入干凈的飼養(yǎng)籠中，術中、術后注意保暖，自由采食和飲水。

1.3動物分組及給藥 體重250～300 g的雄性健康SD大鼠60只，隨機分為假手術組、模型組、生理鹽水干預組(造模前3 d及術前1 h灌胃給予生理鹽水2 ml)、吡格列酮治療組〔造模前3 d及術前1 h灌胃給藥(吡格列酮片15 mg/kg)〕各15只。

1.4神經(jīng)功能缺損評分 觀察并記錄大鼠神經(jīng)功能缺失癥狀；0分，無神經(jīng)病學癥狀；1分，對側前爪不能完全伸直；2分，行走時向癱瘓側旋轉；3分，向病灶對側跌倒；4分，意識喪失，不能自發(fā)活動；5分，死亡。取評分在1～3分者納入研究。

1.5腦梗死體積的測定 每組隨機取5只大鼠，用水合氯醛麻醉后快速斷頭取腦，置于-20℃冰箱中冷凍。以2 mm間距冠狀切成5片，將大腦切片浸泡在2%氯化三苯基四氮唑(TTC)緩沖液中，放入37℃烘箱中避光孵育30 min。以4%多聚甲醛固定，腦梗死組織為白色，正常腦組織顯示為紅色。相機拍照采集圖像后用Image J1.37圖像分析軟件，計算梗死體積百分比(腦梗死體積/對側腦體積)。

1.6大鼠血清抽取及組織切片制備 4組再灌注24 h后，用水合氯醛麻醉打開胸腔，抽取心臟血2 ml，待常溫凝固1 h后，3 000 r/min離心20 min，取上清液，用于ELISA檢測。取血之后，剝離腦組織，先用生理鹽水100 ml沖洗，然后用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片，用于免疫組化染色。

1.7ELISA測定血清IL-6和TNF-α的濃度 血清IL-6和TNF-α濃度采用雙抗體夾心SABC-ELISA法測定，按照試劑盒說明書操作步驟進行。用酶標儀測定450 nm處測OD值，通過繪制標準曲線求出樣品中IL-6、TNF-α濃度。

1.8免疫組化技術檢測腦組織TLR4和NF-κB 蛋白的表達 大鼠腦組織按照常規(guī)固定、石蠟包埋、切片后，采用SABC法檢測TLR4和NF-κB蛋白的表達。按照免疫組織化學試劑盒說明書操作步驟，用3%去離子水過氧化氫孵育10 min清除內源性過氧化物酶；3%牛血清白蛋白(BSA)室溫孵育封閉1 h；分別加入TLR4和NF-κB 鼠單克隆抗體(1∶100)4℃過夜，滴加適當比例的辣根酶標記山羊抗小鼠IgG室溫孵育1 h，滴加SABC復合物室溫反應30 min；DAB顯色，酒精脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.9實時熒光定量RT-PCR技術檢測腦組織TLR4和NF-κB mRNA的表達 取大鼠再灌注24 h后的腦組織，用Trozol法提取組織總RNA，總RNA質量用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測；采用PrimeScriptTM反轉錄試劑盒合成cDNA，將反轉錄產(chǎn)物作5倍稀釋用于后續(xù)熒光定量PCR分析。 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的大鼠TLR4、NF-κB 和β-actin的mRNA序列為模板，按照目的片段橫跨兩個外顯子的原則，用oligo6.0軟件設計RT-PCR引物(表1)。所有引物由大連寶生物工程有限公司合成。RT-PCR擴增條件：預變性95℃×5 min，變性95℃×30 s，退火60℃×30 s，延伸72℃×30 s，均為35個循環(huán)。用β-actin作為內參，采用2-△△Ct法對數(shù)據(jù)進行相對定量分析，即基因表達差異=2-△△Ct，△△Ct=實驗組(目的基因Ct值-內參基因Ct值)-對照組(目的基因Ct值-內參基因Ct值)。

表1 實時熒光定量RT-PCR引物信息

1.10數(shù)據(jù)分析 采用SPSS20.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1各組神經(jīng)功能評分比較 模型組及生理鹽水干預組均表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)運動功能障礙，術后神經(jīng)功能評分〔(2.3±0.69)分、(2.5±0.62)分〕顯著高于假手術組(0分，P<0.01)，說明造模成功；而吡格列酮治療組神經(jīng)功能損傷癥狀明顯改善，術后神經(jīng)功能評分〔(1.5±0.73)分〕顯著低于模型組和生理鹽水干預組(P<0.05)。

2.2各組腦梗死體積比比較 假手術組腦組織切片經(jīng)TTC染色全部呈紅色，無梗死灶形成；模型組和生理鹽水干預組腦組織染色可見有明顯的白色梗死灶，主要位于右側額葉、頂葉皮質及紋狀體；吡格列酮治療組腦組織梗死灶體積比〔(14.69±0.94)%〕顯著低于模型組〔(41.65±1.38)%〕和生理鹽水干預組〔(37.21±2.26)%,P<0.05〕。

2.3各組血中 IL-6和TNF-α濃度比較 與假手術組相比，模型組和生理鹽水干預組血清 IL-6和TNF-α含量都顯著升高(P<0.01)；與生理鹽水干預組、模型組相比，吡格列酮治療組血清IL-6和TNF-α含量都顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清中IL-6和TNF-α濃度比較

與假手術組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05；與生理鹽水治療組比較：3)P<0.05，下表同

2.4各組腦組織TLR4和NF-κB 蛋白表達免疫陽性細胞數(shù)比較 TLR4、NF-κB 免疫組化陽性表達呈棕黃色，陽性細胞染色主要位于胞膜及胞質。假手術組偶見TLR4、NF-κB 免疫陽性細胞，模型組及生理鹽水干預組TLR4、NF-κB 免疫陽性細胞顯著增加(P<0.01)，吡格列酮治療組TLR4、NF-κB 免疫陽性細胞明顯減少(P<0.05)，見表3及圖1。

表3 各組腦組織TLR4、NF-κB 免疫陽性細胞個數(shù)比較

圖1 各組腦組織TLR4、NF-κB免疫陽性細胞個數(shù)(SABC法，×200)

2.5各組腦組織TLR4和NF-κB mRNA表達比較 與假手術組相比，模型組和生理鹽水干預組腦組織中TLR4、NF-κB mRNA表達顯著上調(P<0.01)，吡格列酮治療組TLR4、NF-κB mRNA表達與模型組和生理鹽水干預組相比顯著下調(P<0.05)。見表4。

表4 各組腦組織TLR4、NF-κB mRNA表達比較

3 討 論

目前研究發(fā)現(xiàn)有多種藥物如芒果苷〔9〕、葛根素〔10〕、芹菜素〔11〕、熊果酸〔12〕等對腦缺血再灌注損傷都有一定的保護作用，PPARγ激動劑也是在缺血性腦損傷中研究較多的一種藥物。已有大量研究證明，PPARγ激動劑WY14643、羅格列酮、吡格列酮等對腦缺血再灌注損傷具有保護作用，可以抑制炎癥反應，減少組織損傷等。邱林等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)，吡格列酮可以促進缺血再灌注腦組織中PPARγ的表達水平，降低腦組織炎性因子的水平；李萌等〔14〕認為吡格列酮可改善缺血性腦損傷大鼠神經(jīng)功能異常，減輕腦水腫并促進損傷腦細胞的恢復。本研究結果說明吡格列酮具有腦保護作用，這與文獻〔13，14〕報道的結果一致。

研究〔15〕表明氧化應激、炎癥反應、鈣超載、能量代謝紊亂、酸中毒、細胞凋亡等與缺血再灌注腦損傷的發(fā)生密切相關，其中研究最多的是炎癥反應。當前研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷可能與腦細胞內多條信號轉導通路有關〔16，17〕。TLR4受到刺激后會導致炎性細胞因子分泌增多，參與缺血性腦損傷中的炎癥反應、神經(jīng)功能損傷和神經(jīng)細胞凋亡。NF-κB參與調控多種炎癥反應及細胞因子，與腦缺血再灌注損傷有密切關系，腦缺血時會誘發(fā)NF-κB的活化，促使黏附分子、細胞表面受體、趨化因子和細胞因子表達增加，進一步加重缺血區(qū)的腦損傷程度。研究證實TLR4/NF-κB信號轉導通路在腦缺血再灌注損傷過程中起著重要的作用〔18〕，劉軍等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)，TLR4對缺血再灌注損傷導致的細胞凋亡具有保護作用。余偉軍等〔20〕發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷后腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子可能通過降低NF-κB活性，抑制炎癥反應，減少細胞凋亡，從而在腦缺血再灌注損傷后，對神經(jīng)細胞發(fā)揮保護作用。綜上，TLR4/NF-κB信號轉導通路的激活會加重腦缺血再灌注的炎癥損傷。

1湯軼波，孔 冉，白 雪，等.腦缺血再灌注損傷的中西醫(yī)治療研究進展〔J〕.中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2016；14(10)：1100-3.

2Jin AS，Jeong SI，Kim M，etal.Visceral adipose tissue inflammation is associated with age-related brain changes and ischemic brain damage in aged mice〔J〕.Brain Behav Imm，2015；6(50)：221-31.

3Liesz A，Kleinschnitz C.Regulatory T cells in post-stroke immune homeostasis〔J〕.Translational Stroke Res，2016；7(4)：1-9.

4張世應，凃 靜.阿托伐他汀對膿毒癥大鼠急性肺損傷的保護作用及對細胞炎性蛋白-2和Toll樣受體-4表達的影響〔J〕.中國老年學雜志，2016；36(13)：3140-1.

5Tu XK，Yang WZ，Chen JP，etal.Curcumin inhibits TLR2/4-NF-κB signaling pathway and attenuates brain damage in permanent focal cerebral ischemia in rats〔J〕.Inflammation，2014；37(5)：1544-51.

6Zhang Y，Zhang S，Li H，etal.Ameliorative effects of Gualou Guizhi decoction on inflammation in focal cerebral ischemic-reperfusion injury〔J〕.Mol Med Reports，2015；12(1)：988-94.

7Xu J，Zhu Y，Wang G，etal.The PPARγ agonist，rosiglitazone，attenuates airway inflammation and remodeling via heme oxygenase-1 in murine model of asthma〔J〕.Acta Pharmacol Sinica，2015；36(2)：171-8.

8侯春萌，梁貴友.PPARγ及配體在缺血再灌注肺損傷中的作用〔J〕.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2014；52(10)：157-60.

9李 雪.芒果苷對腦缺血再灌注損傷的保護作用及其機制研究〔D〕.廣州：南方醫(yī)科大學，2014.

10Zhou F,Wang L,Liu P，etal.Puerarin protects brain tissue against cerebral ischemia/reperfusion injury by inhibiting the inflammatory response〔J〕.Neural Regeneration Res，2014；9(23)：2074-80.

11Cai M，Ma Y，Zhang W，etal.Apigenin-7-O-β-D-(-6′′-p-coumaroyl)-Glucopyranoside Treatment Elicits Neuroprotective Effect against Experimental Ischemic Stroke〔J〕.Int J Biol Sci，2016；12(1)：42-52.

12陳 鵬，丁志杰.熊果酸對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2015；21(12)：129-33.

13邱 林，蔣 雪，文 玲，等.吡格列酮通過上調PPARγ降低創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦組織炎性細胞因子的水平〔J〕.細胞與分子免疫學雜志，2016；32(2)：182-4.

14李 萌，張 靖，張煥新.PPARγ激活物對缺氧缺血性腦損傷大鼠神經(jīng)行為學功能的影響〔J〕.中國老年學雜志，2016；36(7)：1582-4.

15劉 磊，劉麗華，馬玉奎.腦缺血再灌注損傷機制研究進展〔J〕.藥學研究，2016；35(9)：542-4.

16Hu MZ，Zhou B，Mao HY，etal.Exogenous hydrogen sulde postconditioning protects isolated rat hearts from ischemia/reperfusion injury through sirt1/PGC-1α signaling pathway〔J〕.Int Heart J，2016；57(4)：477-82.

17Zhao GL，Yu LM，Gao WL，etal.Berberine protects the heart from ischemia/reperfusion injury by attenuating endoplasmic reticulum stress via the JAK2/STAT3 signaling pathway〔J〕.Acta Pharmacol Sinica，2016；37(3)：354-67.

18Tiecheng L，Jingui Y，Rongying C，etal.Mycophenolate mofetil attenuates myocardial ischemia-reperfusion injury via regulation of the TLR4/NF-κB signaling pathway.〔J〕.Pharmazie，2014；69(11)：850-5.

19劉 軍，毛善平，董慧敏，等.TLR4參與缺血后處理對缺血再灌注損傷致細胞凋亡的保護作用〔J〕.卒中與神經(jīng)疾病，2014；21(3)：144-7.

20余偉軍，余 智，盧波達，等.腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對腦缺血再灌注損傷大鼠核轉錄因子、腫瘤壞死因子-α和細胞凋亡的影響〔J〕.中國醫(yī)師雜志，2014；16(12)：1645-8.