二氫楊梅素對(duì)絨癌JAR細(xì)胞MMP-2、PI3K和Akt表達(dá)的影響*

雷贇濤，劉 鐳，許 倩，李玉紅，崔 瑩

（承德醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所，河北承德 067000）

絨毛膜癌（簡稱絨癌）是由于滋養(yǎng)層細(xì)胞過度侵襲和增殖導(dǎo)致的一種惡性腫瘤，早期就容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，若診治不及時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致廣泛轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者預(yù)后[1-2]。二氫楊梅素(dihydromyricetin，DMY）屬黃酮類化合物，具有消炎、止咳、祛痰、鎮(zhèn)痛的作用[3]。另外，二氫楊梅素還具有抑制腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲遷移的作用[4-6]。但二氫楊梅素對(duì)絨癌細(xì)胞系的作用文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究以絨癌JAR細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察二氫楊梅素對(duì)絨癌JAR細(xì)胞MMP-2 mRNA、PI3K mRNA、Akt mRNA表達(dá)的影響，為探討二氫楊梅素影響絨癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源和主要試劑 人絨癌JAR細(xì)胞株，購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。二氫楊梅素，購自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)（批號(hào)17031501）；胎牛血清、DMEM、PBS磷酸鹽緩沖液、0.25%胰蛋白酶，美國GIBCOBRL公司；Trizol總RNA提取試劑，美國Invitrogen公司；2步法RT-qPCR試劑盒、染料法qPCR試劑盒、引物MMP-2、引物GAPDH、引物PI3K、引物Akt，日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：JAR細(xì)胞在37℃含5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時(shí)，用含0.25% EDTA的胰酶消化傳代。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量qPCR法檢測JAR細(xì)胞MMP-2 mRNA、PI3K mRNA、Akt mRNA的表達(dá)：取消化后細(xì)胞以2.5×105/ml的濃度種植于60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合度達(dá)到40%～50%時(shí)，給予終濃度為60μg/ml的二氫楊梅素，繼續(xù)培養(yǎng)36h；同時(shí)設(shè)立0μg/ml 二氫楊梅素為對(duì)照組。收集細(xì)胞，提取總RNA。按照試劑盒體系進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃30sec；95℃5sec，60℃30sec；共45個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。采用2-ΔΔCt相對(duì)定量法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組（Ct目的基因-Ct管家基因）-對(duì)照組（Ct目的基因-Ct管家基因），相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料的以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± s ）的形式表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二氫楊梅素對(duì)JAR細(xì)胞MMP-2 mRNA、PI3K mRNA、Akt mRNA表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，濃度為60μg/ml的二氫楊梅素作用JAR細(xì)胞36h，MMP-2 mRNA、PI3K mRNA、Akt mRNA的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見表2：

表2 各組JAR細(xì)胞MMP-2 mRNA、PI3K mRNA、Akt mRNA的表達(dá)情況（± s ）

表2 各組JAR細(xì)胞MMP-2 mRNA、PI3K mRNA、Akt mRNA的表達(dá)情況（± s ）

組別 n MMP-2 mRNA PI3K mRNA Akt mRNA對(duì)照組 4 1.00±0.01 1.00±0.01 1.00±0.01二氫楊梅素組 4 0.62±0.12 0.77±0.11 0.79±0.17 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.2 JAR細(xì)胞MMP-2 mRNA表達(dá)與PI3K mRNA、Akt mRNA表達(dá)的相關(guān)性 濃度為60μg/ml的二氫楊梅素作用36h，JAR細(xì)胞MMP-2 mRNA的表達(dá)水平與PI3K mRNA、Akt mRNA的表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.957、0.953，P＜0.05）。見附圖：

附圖 JAR細(xì)胞MMP-2 mRNA表達(dá)水平與PI3KmRNA、Akt mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性

3 討論

絨癌是發(fā)生于葡萄胎、流產(chǎn)、足月產(chǎn)后數(shù)月至數(shù)年的惡性腫瘤，少數(shù)為原發(fā)性[7]，主要經(jīng)血液播散，轉(zhuǎn)移發(fā)生早且廣泛，最常見的轉(zhuǎn)移部位是肺(80%)[8]。研究表明，絨癌細(xì)胞主要通過MMP-2降解Ⅳ型膠原和破壞靠近腫瘤表面的細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)絨癌細(xì)胞的侵襲和遷移[9-10]。全身性化療是治療轉(zhuǎn)移性絨癌的主要方法，多數(shù)病例可獲得完全緩解，但有部分患者由于對(duì)化療藥物耐藥而預(yù)后不良[8]。因此，優(yōu)化藥物治療絨癌，成為亟待解決的問題。

二氫楊梅素是一種二氫黃酮醇類化合物，具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗腫瘤、降血糖及抗糖尿病并發(fā)癥等多方面的作用[3-6]。并且有研究顯示，二氫楊梅素可明顯抑制人乳腺癌腫瘤細(xì)胞中MMP-2基因和蛋白的表達(dá)[6]。為探討二氫楊梅素對(duì)絨癌JAR細(xì)胞的作用及是否通過影響MMP-2基因影響絨癌的侵襲轉(zhuǎn)移，本研究發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素（60μg/ml）作用36h，絨癌JAR細(xì)胞MMP-2 mRNA的表達(dá)水平明顯降低，說明二氫楊梅素可能通過下調(diào)絨癌JAR細(xì)胞MMP-2基因的表達(dá)影響JAR細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移有著密切關(guān)系[12-13]；王亞欣等的研究也顯示，PI3K/Akt信號(hào)通路與絨癌JAR細(xì)胞和JEG-3細(xì)胞的遷移侵襲能力相關(guān)，且該通路可誘導(dǎo)侵襲表型的發(fā)生[14]；另外，Wang等的研究發(fā)現(xiàn)，二羥環(huán)氧苯并芘可通過PI3K/Akt信號(hào)通路抑制人滋養(yǎng)層HTR-8/SVneo細(xì)胞MMP-2蛋白的表達(dá)，并提出MMP-2為PI3K/Akt的下游分子[15]。本研究亦有類似發(fā)現(xiàn)，濃度為60μg/ml的二氫楊梅素作用36h，JAR細(xì)胞PI3K mRNA、Akt mRNA的表達(dá)水平亦明顯降低，且JAR細(xì)胞MMP-2 mRNA表達(dá)水平與PI3K mRNA、Akt mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系。本研究提示二氫楊梅素可能通過PI3K/Akt信號(hào)通路抑制絨癌MMP-2 mRNA的表達(dá)，進(jìn)而抑制絨癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，但尚需其他研究方法進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果。

【參考文獻(xiàn)】

[1] Nadhan R, Vaman JV, C N, et al. Insights into dovetailing GTD and Cancers[J]. Crit Rev Oncol Hematol, 2017, 114: 77-90.

[2] Shaaban AM, Rezvani M, Haroun RR, et al. Gestational Trophoblastic Disease: Clinical and Imaging Features[J].Radiographics, 2017, 37(2): 681-700.

[3] 張友勝，寧正祥，胡閆勇.黃酮類化合物二氫楊梅素的研究利用現(xiàn)狀[J].中成藥，2002，24(12)：970-972.

[4] Sun Y, Wang C, Meng Q, et al. Targeting P-glycoprotein and SORCIN: Dihydromyricetin strengthens anti-proliferative efficiency of adriamycin via MAPK/ERK and Ca2+-mediated apoptosis pathways in MCF-7/ADR and K562/ADR[J]. J Cell Physiol, 2018, 233(4): 3066-3079.

[5] Lu CJ, He YF, Yuan WZ, et al. Dihydromyricetin-mediated inhibition of the Notch1 pathway induces apoptosis in QGY7701 and HepG2 hepatoma cells[J]. World J Gastroenterol, 2017, 23(34):6242-6251.

[6] 周防震，張曉元，詹遠(yuǎn)京，等.二氫楊梅素抑制人乳腺癌細(xì)胞侵襲和下調(diào)MMP-2/-9蛋白表達(dá)研究[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2012，39(4)：352-358.

[7] 高鐘禹，俞孝庭.妊娠絨毛膜癌的起源[J].國外醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)分冊(cè)，1987（，3）：129-133.

[8] 謝幸.妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2006，15(4)：241-256.

[9] Librach CL, Werb Z, Fitzgerald ML, et al. 92-kD type IV collagenase mediates invasion of human cytotrophoblasts[J]. J Cell Biol, 1991,113(2): 437-449.

[10] Staun-Ram E, Goldman S, Gabarin D, et al. Expression and importance of matrix metalloproteinase 2 and 9 (MMP-2 and -9)in human trophoblast invasion[J]. Reprod Biol Endocrinol, 2004,2:59.

[11] 向陽，趙峻.妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病診治進(jìn)展[J].中國實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志，2017，33(1)：14-18.

[12] Zheng W, Li J, Wang X, et al. Eあects of Antarctic krill docosahexaenoic acid on MCF-7 cell migration and invasion induced by the interaction of CD95 with caveolin-1[J]. Life Sci, 2018, 192:270-277.

[13] Park GB, Chung YH, Kim D. Induction of galectin-1 by TLR-dependent PI3K activation enhances epithelial-mesenchymal transition of metastatic ovarian cancer cells[J]. Oncol Rep, 2017,37(5): 3137-3145.

[14] 王亞欣，張慧娟，劉媛，等.PI3K/PKB信號(hào)激活在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病發(fā)病機(jī)制中的作用[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2015，24(1)：22-29.

[15] Wang R, Wang W, Ao L, et al. Benzo[a]pyrene-7,8-diol-9,10-epoxide suppresses the migration and invasion of human extravillous trophoblast HTR-8/SVneo cells by down-regulating MMP2 through inhibition of FAK/SRC/PI3K/AKT pathway[J].Toxicology, 2017, 386: 72-83.