m TOR抑制劑聯(lián)合替莫唑胺治療惡性膠質(zhì)瘤

武志， 鄭茂華， 張永紅

（蘭州大學(xué)第一醫(yī)院 神經(jīng)外科，甘肅 蘭州730000）

腦膠質(zhì)瘤是一種最常見(jiàn)的顱內(nèi)腫瘤，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，盡管近年來(lái)在手術(shù)、放療及化療等方面已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，化療藥物以替莫唑胺（Temozolomide，TMZ）為主.但腦膠質(zhì)瘤患者總的預(yù)后并沒(méi)有明顯改善，預(yù)后極差，中位生存期低于14個(gè)月[1－5]，其主要原因?yàn)槟X膠質(zhì)瘤存在腫瘤干細(xì)胞可產(chǎn)生明顯耐藥性，導(dǎo)致對(duì)化療藥物的抵抗，腫瘤容易復(fù)發(fā)[6－7].替西羅莫司為 mTOR靶點(diǎn)抑制劑，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G1期，并通過(guò)降低VEGF蛋白合成的方式抑制腫瘤血管生成[8].已證實(shí)抗腫瘤血管生成藥物可抑制腦膠質(zhì)瘤腫瘤干細(xì)胞的增殖，降低腫瘤耐藥性及侵襲性[9－10]，但腫瘤細(xì)胞殺傷作用較差.替莫唑胺對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞殺傷能力較強(qiáng)但存在明顯耐藥性，而替西羅莫司能夠抗腫瘤血管生成抑制腫瘤干細(xì)胞增殖，可能降低腦膠質(zhì)瘤對(duì)替莫唑胺的耐藥性.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)C6大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率、原位移植C6大鼠膠質(zhì)瘤的腫瘤體積、腫瘤中與腫瘤侵襲性相關(guān)MMP1蛋白的表達(dá)[11－12]及腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)檢測(cè)，對(duì)兩種藥物的聯(lián)合應(yīng)用是否存在顯著殺傷惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞、降低其侵襲性進(jìn)行對(duì)比研究，為治療惡性膠質(zhì)瘤的化療方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株為寧夏醫(yī)科大學(xué)顱腦實(shí)驗(yàn)室凍存；替西羅莫司購(gòu)于無(wú)錫金譜生物公司、替莫唑胺購(gòu)于天士力公司；DMEM與胎牛血清購(gòu)于Solarbio公司；MTT、胰酶購(gòu)于美國(guó) Sigma公司；Wister大鼠購(gòu)于甘肅中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；兔抗鼠CD34的單克隆抗體、兔抗鼠MMPl的多克隆抗體和HRP標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)于北京索來(lái)寶公司；Tunel凋亡試劑盒購(gòu)于云天生物技術(shù)研究所.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

C6細(xì)胞株在含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，72～96 h后按1∶3比例傳代，傳3代用于實(shí)驗(yàn).

1.2.2 MTT法檢測(cè)藥物對(duì)C6大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率

C6細(xì)胞以每孔1.00×104的濃度接種于96孔板，培養(yǎng)12 h貼壁后，替西羅莫司組加入質(zhì)量濃度分別為5、10、15、20μg/mL濃度的替西羅莫司，替莫唑胺組加入質(zhì)量濃度分別為 2.5、5、10、15、20μg/mL的替莫唑胺.聯(lián)合用藥組加入質(zhì)量濃度分別為2.5、5、10、15、20μg/mL的替莫唑胺，同時(shí)加入無(wú)細(xì)胞毒性質(zhì)量濃度為10μg/mL的替西羅莫司，每個(gè)質(zhì)量濃度4孔，對(duì)照組不加藥.孵育48 h，隨后每孔加入20μLMTT（質(zhì)量濃度為5 mg/mL），避光孵育 4 h，每孔加入 100μL的DMSO，振蕩儀上振動(dòng)10 min，置酶標(biāo)儀上490 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值（A值），參考波長(zhǎng)為630 nm.

1.2.3 建立C6大鼠膠質(zhì)瘤模型

按文獻(xiàn)[13]取雄性Wistar大鼠40只，200～300 g，用體積分?jǐn)?shù)為10%水合氯醛即每100 g體質(zhì)量0.5 mL腹腔注射麻醉；固定于立體定向儀上，沿中縫略偏右縱向切開(kāi)頭皮，暴露顱骨標(biāo)志，牙鉆鉆開(kāi)顱骨，用微量注射器向右側(cè)額部（前囟中線旁3.4 mm，深6.8 mm）注射C6細(xì)胞懸液10 μL（約1.00×105細(xì)胞），注射時(shí)間為5min，留針時(shí)間為15 min，緩慢拔出針頭，防止細(xì)胞懸液外溢，建立C6大鼠膠質(zhì)瘤模型.

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組

接種腫瘤細(xì)胞10d后，將40只大鼠隨即分為4組，每組10只.替西羅莫司組替西羅莫司質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50 mg/kg，隔日管飼，持續(xù)4周；每天替莫唑胺組替莫唑胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25 mg/kg，隔日管飼，持續(xù)4周；聯(lián)合藥物組隔日管飼質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50 mg/kg替西羅莫司及每天管飼質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25 mg/kg替莫唑胺，持續(xù)4周；空白組腹腔注射相同劑量的體積分?jǐn)?shù)為0.9%氯化鈉溶液，持續(xù)4周.

1.2.5 腫瘤體積的測(cè)量比較

在治療4周后，斷頭法處死Wistar大鼠，取出大腦組織，低溫速凍，－70℃保存，用恒冷切片機(jī)做冠狀位切面5μm厚的冷凍連續(xù)切片，包埋在玻璃片上，作普通HE染色.用組織塊等距抽樣法取相距150μm的切片經(jīng)體視顯微鏡觀察，取腫瘤面積最大的1張切片，用目鏡測(cè)微尺測(cè)量腫瘤最短徑（a）和最長(zhǎng)徑（b），根據(jù)公式算腫瘤體積V＝a2×（b/2），比較各組間腫瘤體積是否有差異.

1.2.6 SP法檢測(cè)腫瘤中MMP1蛋白的表達(dá)

MMPl蛋白，與腫瘤侵襲性相關(guān)，定位于細(xì)胞質(zhì)，染色陽(yáng)性為胞質(zhì)棕黃色.按文獻(xiàn)[11－12]，對(duì)切片隨機(jī)選取10個(gè)不同高倍鏡視野（200倍），計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率，

按SP法染色強(qiáng)度（SI）和陽(yáng)性細(xì)胞百分率（PP）的乘積計(jì)算IRS（免疫反應(yīng)積分）作為標(biāo)記指數(shù)，即IRS＝SI×PP.SI計(jì)分：0分為無(wú)色；1分為淡棕黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色.PP計(jì)分：0分為陽(yáng)性細(xì)胞百分率≤5%；1分為5%～25%；2分為25%～50%；3分為50%～75%；4分為＞75%.計(jì)算IRS得分：0～2分為陰性（－）；3～4分為弱陽(yáng)性（＋）；5～6分為陽(yáng)性（＋＋）；7～8分為強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋＋）.按照IRS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，來(lái)判斷MMP1蛋白的表達(dá)情況.

1.2.7 TUNEL法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)

觀察腫瘤細(xì)胞的凋亡情況，凋亡細(xì)胞為紅褐色.普通光學(xué)顯微鏡下用目鏡網(wǎng)格測(cè)微尺任10個(gè)視野（300倍）下計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù).

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理.數(shù)值以（±s）表示.采用t檢驗(yàn)及方差分析進(jìn)行組間比較，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2 結(jié)果

2.1 替西羅莫司與替莫唑胺對(duì)體外C6細(xì)胞的抑制作用

質(zhì)量濃度分別為5、10、15與20μg/mL的替西羅莫司對(duì)C6細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別（5.88±3.35）%、（6.63±4.45）%、（6.98±4.24）%與（43.30±5.42）%，高質(zhì)量濃度的替西羅莫司（＞15μg/mL）與空白組相比對(duì)C6細(xì)胞有明顯抑制作用（P＜0.05）；而低質(zhì)量濃度（＜15μg/mL）的替西羅莫司對(duì)C6細(xì)胞增殖未見(jiàn)明顯抑制作用（圖1，P＞0.05）.用對(duì)C6細(xì)胞無(wú)明顯毒性的替西羅莫司（質(zhì)量濃度為10μg/mL）聯(lián)合替莫唑胺組對(duì)C6細(xì)胞的增殖抑制比替莫唑胺組明顯增強(qiáng)（P＜0.01），表明替西羅莫司和替莫唑胺聯(lián)合用藥，增加替莫唑胺對(duì)C6細(xì)胞的細(xì)胞毒作用（表1，圖2）.

圖1 替西羅莫司對(duì)C6細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響Fig.1 Effect of Temsirolimus on the growth inhibition rate of C6 cell

表1 替西羅莫司和替莫唑胺聯(lián)合用藥對(duì)C6細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響Table 1 Effect of Temsirolimus andTemozolom ide jointmedication on the grow th inhibition rate of C6 cell（±s）/%

表1 替西羅莫司和替莫唑胺聯(lián)合用藥對(duì)C6細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響Table 1 Effect of Temsirolimus andTemozolom ide jointmedication on the grow th inhibition rate of C6 cell（±s）/%

2.5 5 10 15 20替莫唑胺組 4 12.49±3.35 15.40±2.34 25.42±3.68 45.13±4.分組 n ρ（替莫唑胺）/（μg·mL－1）25 57.66±4.71聯(lián)合藥物組 4 23.64±4.03 33.05±5.41 42.16±3.15 69.42±3.46 79.06±3.04

圖2 替西羅莫司和替莫唑胺聯(lián)合用藥對(duì)C6細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響Fig.2 Effect of Temsirolimus and Temozolomide jointmedication on the growth inhibition rate of C6 cell

2.2 原位移植瘤體積變化

用藥后，對(duì)照組、替西羅莫司組、腫瘤體積分別為（14.52±2.35）mm3、（14.35±1.20）mm3、（9.65±0.65）mm3與（6.5±2.05）mm3，質(zhì)量濃度為 10μg/mL替莫唑胺組腫瘤體積縮小33.5%，與空白組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；質(zhì)量濃度為10μg/mL替西羅莫司組腫瘤體積縮小1.2%，與空白對(duì)照組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；聯(lián)合藥物組腫瘤體積縮小55.2%，與空白對(duì)照組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），提示聯(lián)合藥物組能明顯縮小腫瘤體積，且明顯優(yōu)于單用替莫唑胺組（圖3，P＜0.05）.

圖3 腫瘤最大切面HE染色Fig.3 The largest section of tumor with HE stain

2.3 腫瘤中MMP1蛋白的表達(dá)

胞質(zhì)棕黃色染色為陽(yáng)性表達(dá)，當(dāng)與對(duì)照組比較時(shí)，替西羅莫司組移植瘤MMPl表達(dá)下降，移植瘤中MMPl表達(dá)陽(yáng)性（＋）；替莫唑胺組MMPl表達(dá)無(wú)明顯變化，移植瘤中MMPl表達(dá)為（＋＋）；聯(lián)合藥物組移植瘤MMPl表達(dá)下降，移植瘤中MMPl表達(dá)陽(yáng)性（＋）.結(jié)果表明替西羅莫司的應(yīng)用能夠降低與腫瘤侵襲能力有關(guān)的MMP1蛋白表達(dá)，而替莫唑胺不能降低MMP1蛋白表達(dá)（圖4）.

2.4 移植瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）變化

鏡下凋亡細(xì)胞為紅褐染色，與對(duì)照組（4.23±1.35）比較時(shí)，替莫唑胺組（68.83±5.65）誘導(dǎo)細(xì)胞 AI增加了 64.6%（P＜0.05），聯(lián)合用藥組為（88.23±7.05），AI增加了 84%（P＜0.05），而替西羅莫司組為（4.88±1.40），AI增加不明顯（P＞0.005，圖5）.

圖4 不同藥物組移植瘤MMP1蛋白的表達(dá)情況（×200）Fig.4 Different drug groups xenografts MMP1 protein expression

圖5 不同藥物組移植瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)變化（×300）Fig.5 Different drug groups transplanted tumor apoptosis index change

3 討論

通過(guò)檢測(cè)并比較空白組、替莫唑胺組、替西羅莫司組及聯(lián)合藥物組體外腫瘤細(xì)胞抑制，移植瘤體積，腫瘤侵襲性有關(guān)的MMP1蛋白的表達(dá)，腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）.與替莫唑胺組相比聯(lián)合藥物組移植瘤體積明顯下降，與腫瘤侵襲性相關(guān)的MMP1蛋白表達(dá)下降，腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高.

腦膠質(zhì)瘤中存在具有多向分化潛能和自我復(fù)制能力的原始的未分化細(xì)胞，即腫瘤干細(xì)胞，常聚集在腫瘤血管豐富區(qū).由于其具有干性，在腫瘤細(xì)胞被殺傷后可以迅速分化出耐藥的腫瘤細(xì)胞，故腦膠質(zhì)瘤易復(fù)發(fā).腫瘤干細(xì)胞常被豐富血管保護(hù)，就像保護(hù)在龕內(nèi)，并沿血管密集方向侵襲[14].故抑制血管生成可打破腫瘤干細(xì)胞的保護(hù)，降低腫瘤耐藥性及侵襲性.MMP1蛋白在血管密集腫瘤中高表達(dá)，與腦膠質(zhì)瘤順血管侵襲特點(diǎn)相一致，常被認(rèn)為是評(píng)價(jià)腫瘤侵襲性的重要蛋白，表達(dá)越強(qiáng)腫瘤侵襲性越強(qiáng)[12].

替西羅莫司是口服的小分子mTOR靶點(diǎn)抑制劑，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G1期，并且通過(guò)降低VEGF蛋白合成的方式抑制腫瘤血管生成，而抗腫瘤血管生成藥物可降低腫瘤耐藥性.本研究證實(shí)聯(lián)合用藥與單用替莫唑胺相比不僅能降低腫瘤侵襲能力有關(guān)的MMP1蛋白表達(dá)還能明顯抑制C6大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)，這樣可以在保證藥物對(duì)腫瘤殺傷作用效果的前提下，減少藥物用量，從而減低藥物的不良反應(yīng).殺傷腫瘤細(xì)胞、減少藥物不良反應(yīng)及控制腫瘤侵襲性，可能是理想化療方案.

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