人類WEE1與腫瘤關(guān)系研究進(jìn)展

胡爭波，李文虎，何 軒 ［南方醫(yī)科大學(xué)附屬韶關(guān)醫(yī)院（韶關(guān)市第一人民醫(yī)院）骨科，廣東韶關(guān)512000］

0 引言

Nurse等在1975年從裂殖酵母細(xì)胞（S．pombe）中分離出來WEE1蛋白激酶，它屬于絲／蘇氨酸蛋白激酶家族。由于其可以通過抑制CDC2的活性來抑制細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂［1］，從而控制細(xì)胞周期生物鐘，因此得名為“WEE”家族。WEE1激酶家族在進(jìn)化上高度保守，在人體內(nèi)也找到了WEE1的同源基因編碼產(chǎn)物WEE1。研究［2］表明WEE1除了在胚胎發(fā)育、神經(jīng)元極化、成骨分化、胃腸道生物鐘、植物分化和根表型、細(xì)胞大小等方面具有重要作用外，WEE1在維持癌細(xì)胞生存方面的也具有不可或缺的作用。目前，以WEE1為治療靶點(diǎn)的抗癌研究已經(jīng)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。本文就WEE1的研究進(jìn)展作一綜述。

1 WEE1基因及其產(chǎn)物

WEE1是一個(gè)進(jìn)化上高度保守的酪氨酸激酶。1991年，Igarashi首次克隆出與S pombe WEE1基因相似的人類WEE1基因，并發(fā)現(xiàn)二者功能相似，同時(shí)他們也確定人類細(xì)胞中存在WEE1基因（圖1）。人類WEE1基因位于染色體上的11p15．4，最近DNA測序結(jié)果WEE1基因長度為21 Kbp，mRNA約有3300 bp，有12個(gè)外顯子。在人體中，WEE1基因編碼的核蛋白共有646個(gè)氨基酸殘基。在哺乳動物中，Wee蛋白激酶家族包括WEE1、WEE2和MYT1三個(gè)成員，其中WEE1在體細(xì)胞中表達(dá)，WEE2在胚細(xì)胞中表達(dá)，MYT1在體細(xì)胞和胚細(xì)胞中都表達(dá)。

2 WEE1 mRNA轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)

染色質(zhì)重組因子ATP酶CHD5是NuRD整個(gè)轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的組成部分，在細(xì)胞中過表達(dá)CHD5導(dǎo)致WEE1基因表達(dá)抑制［3］。人 Kruppel樣因子2是一個(gè)cys2／His2含鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，在卵巢腫瘤細(xì)胞中KLF2通過直接結(jié)合到WEE1啟動子抑制WEE1轉(zhuǎn)錄［4］。在人類類風(fēng)濕滑膜細(xì)胞中，cFOS／AP-1可以直接激活WEE1基因［5］。另外，染色體免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)WEE1啟動子上有轉(zhuǎn)錄因子TP53和MyoD結(jié)合位點(diǎn)，但功能是促進(jìn)還是抑制未見報(bào)道。

圖1 WEE1基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)節(jié)因素和因子。1，25［OH］2VD3為人1，25二羥基維生素D3；TP53為抗腫瘤基因p53；MyoD 為 Myogenic Differentiation Antigen，即成肌分化抗原；染色體解螺旋酶DNA結(jié)合蛋白5；cFOS／AP-1為骨肉瘤病毒癌基因同源物／活化蛋白轉(zhuǎn)錄因子；KLF-2是Krppel樣轉(zhuǎn)錄因子2；HuR，胚胎致死異常視覺基因家族中的成員，RNA結(jié)合蛋白；miRNA微小RNA。

WEE1基因轉(zhuǎn)錄mRNA后，很多因子包括蛋白和小分子miRNA調(diào)節(jié)其翻譯過程。HuR是一種大量存在于腫瘤的RNA結(jié)合蛋白，在壓力應(yīng)激下從細(xì)胞核心轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)中調(diào)節(jié)mRNA。研究［6］發(fā)現(xiàn)HuR直接結(jié)合到WEE1 mRNA直接影響其蛋白水平，尤其是DNA損傷后。除了HuR蛋白對WEE1 mRNA調(diào)節(jié)，目前研究較多的是小分子miRNA。miRNA是一些單鏈小分子RNA，通過結(jié)合到靶基因mRNA上的3'末端非編碼區(qū)調(diào)節(jié)mRNA翻譯。用微芯片分析發(fā)現(xiàn)了 3 個(gè) miRNA（128a／155／516a-3p）定位在 WEE1轉(zhuǎn)錄本的3'端非翻譯區(qū)，表達(dá)這些miRNA導(dǎo)致了WEE1蛋白下調(diào)［7］。 功能促進(jìn)和功能抑制試驗(yàn)［8］表明MiR15 家族 miRNA15／16／424／497 等在多種腫瘤細(xì)胞中調(diào)節(jié) WEE1表達(dá)。在某些腫瘤中miR16／26a［9］、 miRNA17-92 基因叢編碼的 miRNA17／18a／19a／20a／19b／92a［10］、 以 及 miR17／20a／106b［11］、 miRNA128［12］、miRNA195［13］、miRNA497［14］等也下調(diào)WEE1 mRNA。而雖有報(bào)道缺氧、維生素1，2［OH］2VD3、生物鐘基因 Per1下調(diào)等均會導(dǎo)致WEE1在mRNA水平升高，但它們上調(diào)WEE1 mRNA的具體機(jī)制不明。

3 WEE1的蛋白水平調(diào)節(jié)

在正常酵母細(xì)胞中，WEE1的穩(wěn)定性由組蛋白合成致死蛋白Hsl1和7調(diào)節(jié)，活性由CDC2和CDC25調(diào)節(jié)。在人WEE1蛋白的調(diào)節(jié)則更為復(fù)雜（圖2）。

圖 2 WEE1 蛋白活性與功能調(diào)節(jié)。 Akt、CrK II、14-3-3σ、Vrp、ISCp1、 CDC2、PKA、Niml、MAPK 、CK1 δ、CK2 β 、PLK1、CD34、pin1、CDC14A、 CDC25c、 β-TrCP、CyclinB、γ-H2AX、Mus81、Eme1、ChK1、Hsp90、p53 等為蛋白或基因名稱；G0／G1、S、G2／M等細(xì)胞周期。

在細(xì)胞周期進(jìn)展中，WEE1存在依賴于從低磷酸化激活到超磷酸化失活，再泛素化降解的反饋回路，以保證其下游因子CDC2快速激活以準(zhǔn)備分裂。1993年，學(xué)者發(fā)現(xiàn)WEE1在分裂間期的107 KD的低磷酸化形式，而在有絲分裂期則是170 KD的超磷酸化形式。而超磷酸化形式催化CDC2磷酸化的活性顯著減少。在M期CDC2催化WEE1的S123p位點(diǎn)，PLK1催化 S53p位點(diǎn)，后被 β-TrCP識別，使得WEE1被超磷酸化失活后降解下調(diào)［15］。而蛋白激酶CK2β亞基在核外通過WEE1上的結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合促成 PLK1-WEE1復(fù)合物形成，促進(jìn) G2／M期過渡［16］。CK2β 也可以與 WEE1在核內(nèi)結(jié)合，CK2β 抑制WEE1催化H1組蛋白磷酸化，上調(diào)CDC2的活性［17］。也有研究證實(shí)CK1δ是泛素溶酶體途徑降解WEE1所必需的［18-19］，β-TrCP 復(fù)合物是 WEE1泛素化的 E3 泛素化連接酶［15，17］，CDC2、PLK1 和 CK2 催化WEE1磷酸化形成降解體后才會被β-TrCP識別，其中WEE1中的S53和S123位點(diǎn)磷酸化是β-TrCp識別的重要位點(diǎn)。此外 CDC2還能夠通過催化WEE1的T186磷酸化，并特異結(jié)合cis／tran羥脯氨酰異構(gòu)酶 Pin1，導(dǎo)致 WEE1失活［20］。 CDC2也通過磷酸化激活CDC25，但CDC25會磷酸化失活WEE1，而CDC14A可結(jié)合到WEE1的N末端逆轉(zhuǎn)CDC2磷酸化的WEE1，由此形成一個(gè)反饋調(diào)節(jié)［21］。WEE1是在核外降解，因此核轉(zhuǎn)位對其降解非常重要［22］。有學(xué)者［23］發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞內(nèi)定位有關(guān)的核內(nèi)信號蛋白CrkII可與WEE1結(jié)合；而Akt在S／G2期直接結(jié)合并磷酸化激活 WEE1的 Ser642位點(diǎn)［24］，且 14-3-3σ 參與了WEE1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)出細(xì)胞質(zhì)中定位［25］。說明這些也與WEE1降解有關(guān)。

另外，Hsp90是WEE1的分子伴侶［26］，既可以結(jié)合 WEE1，又可以結(jié)合 Chk1［27］，這個(gè)過程受 p53 調(diào)節(jié)［28-29］；而 Chk1 磷酸化 WEE1 的 S549 位點(diǎn)［25，30］，Chk1直接靶向作用于WEE1和CDC25［31］，從而調(diào)節(jié)WEE1的功能活性。Tral1是負(fù)責(zé)ATM／ATR相關(guān)的假性激酶，也可通過有絲分裂變化應(yīng)答激酶CDR1／2拮抗Chk1，進(jìn)而抑制 WEE1蛋白活性［32-33］。此外，PKA催化亞基、Niml激酶、促分裂原活化蛋白激酶MAPK、病毒蛋白Vpr誘導(dǎo)WEE1磷酸化增加。抑制泛素結(jié)合激酶復(fù)合物CD34［34］、Rad24和14-3-3σ上調(diào)、高水平肌醇磷酸鞘磷脂酶 C1［35］等均可導(dǎo)致WEE1積累。其他能夠上調(diào)或穩(wěn)定WEE1蛋白還有缺氧、蛋白點(diǎn)突變、HIV 病毒蛋白 Vpr［36-37］。 這些與WEE1的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)功能有關(guān)（圖3）。

圖 3 WEE1 與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)。 CDC2、CDC20、CyclinB、FCP1、Hub、mTOR、PLK1、Rad24、Torin1、USP44、Vrp、VitD、β-TrCP、14-3-3σ等為蛋白或基因名稱；G2／M等為細(xì)胞周期。

在WEE1下游，WEE1調(diào)節(jié)CDC2上Y15位點(diǎn)和CyclinB上的260和270位點(diǎn)磷酸化［38］。WEE1通過核酸內(nèi)切酶Mus81／Eme1調(diào)節(jié)DNA復(fù)制與穩(wěn)定性［39-40］。 此外，WEE1 還通過抑制 γH2AX 磷酸化［39］，催化組蛋白 H2B 的 Y27 磷酸化［41］，與 H3K36作用促進(jìn)RRM2表達(dá)［42］，從而保護(hù)基因組穩(wěn)定。這些與WEE1的生理病理功能密不可分。

4 WEE1在癌組織中的表達(dá)和靶向治療

4．1 WEE1在癌組織中的表達(dá) WEE1是動物胚胎生存的必需基因，細(xì)胞中缺失WEE1基因則導(dǎo)致周期缺陷，異倍體和細(xì)胞凋亡?；蚯贸鲜笈咛ピ?．5天前因細(xì)胞凋亡死亡［43］，因此 WEE1是小鼠胚胎植入前階段必不可少的。有研究表明WEE1在非小細(xì)胞肺癌［44］和惡性黑色素瘤［13］中能夠抑癌（圖 4）。但與這些研究結(jié)論相反的是，又有研究表明在惡性黑色素瘤［45］、外陰鱗癌細(xì)胞［46］、骨肉瘤［47-48］、神經(jīng)母細(xì)胞瘤［14］、惡性卵巢癌［49］、乳腺癌癌細(xì)胞［50］中，WEE1的表達(dá)增加與惡性程度一致。

圖4 WEE1在人體細(xì)胞中的表達(dá)及其與癌細(xì)胞靶向治療。TP53，Trail，H3K36，Chk1／2，Hsp90 等為蛋白或基因名稱。

4．2 WEE1單一靶點(diǎn)作用及與p53的關(guān)系 在髓母細(xì)胞瘤［51］、外陰鱗癌細(xì)胞［46］和惡性卵巢癌化療后復(fù)發(fā)的癌細(xì)胞［49］中，單一WEE1抑制劑AZD1775就可以抑制腫瘤。在沒有組蛋白H3K36癌細(xì)胞中，合成致死作用對WEE1抑制非常敏感，單純抑制WEE1導(dǎo)致S期阻滯，細(xì)胞凋亡增加［42］。在基底乳腺癌細(xì)胞中，抑制WEE1能夠增強(qiáng)TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［52］。但在正常乳腺上皮中抑制WEE1后沒有出現(xiàn)這些反應(yīng)［50］。

p53是細(xì)胞周期G1檢查站的關(guān)鍵因子和細(xì)胞凋亡的決定因子［9］。 很多研究［27-29］表明，WEE1 可通過p53途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞生存。研究［17］表明生物鐘基因Per1下調(diào)后，導(dǎo)致WEE1上調(diào)而p53下調(diào)，其致瘤性增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡抑制。在DNA損傷藥物如阿霉素作用下，p53靶定WEE1和Chk1導(dǎo)致細(xì)胞阻滯在G1／S期，并增加細(xì)胞凋亡［9］。在p53wt和p53mt乳腺癌細(xì)胞系中，沉默WEE1后，p53蛋白上調(diào)，凋亡細(xì)胞增加，且WEE1的抑制效果與p53水平一致［28］。另一方面，也有研究［29，45，63］表明 WEE1 的作用與 p53 無關(guān)。因此，WEE1抑制與p53狀態(tài)對癌細(xì)胞生存的影響還有待進(jìn)一步闡明。

4．3 WEE1的協(xié)同效應(yīng) WEE1抑制劑AZD1775和Chk1抑制劑PD00477736對鞘細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞具有強(qiáng)烈的協(xié)同效應(yīng)［54］。在黑色素瘤細(xì)胞中，WEE1抑制劑AZD1775和Chk1、2抑制劑AZD7762協(xié)同用藥效果更好［55］。WEE1抑制與阿糖胞苷對急性髓系白血病AML也具有協(xié)同效果［56］。WEE1抑制劑增加了HSp90抑制劑的抗癌效果［57］。同時(shí)抑制 WEE1和Hsp90時(shí)，survivin和WEE1轉(zhuǎn)錄下調(diào)，內(nèi)源性凋亡途徑激活，在翻譯水平，這兩種蛋白的表達(dá)和Akt活化被抑制。單一抑制兩者之一則沒有這種效果。AZD1775抑制WEE1后可增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌對光子放射敏感性［58］。WEE1在大多數(shù)骨肉瘤標(biāo)本中檢測到有表達(dá)，抑制WEE1可增強(qiáng)骨肉瘤放療敏感性［47］。4．4 WEE1與DNA損傷藥及其耐藥 癌細(xì)胞耐藥和抗放療是因?yàn)樵赟期能夠很好地修復(fù)DNA的損傷，WEE1起了重要作用。順鉑處理miR497表達(dá)的細(xì)胞和WEE1抑制的細(xì)胞導(dǎo)致凋亡增加［14］。髓母細(xì)胞瘤中，雖然單一抑制WEE1就有抗癌效果，但抑制WEE1協(xié)同CDDP會有更好的抗癌效果［51］。在卵巢腫瘤中，轉(zhuǎn)錄因子KLF2顯著下調(diào)，抑制WEE1后增加DNA損傷藥物的效果。在順鉑耐藥的細(xì)胞中經(jīng)常發(fā)生 WEE1 和 Chk1 過表達(dá)［8］，而 miRNA15、16、195、424、497家族通過調(diào)節(jié)WEE1和Chk1導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞順鉑耐藥［4，53］。 在胰腺導(dǎo)管腺癌中，DNA 損傷藥刺激后HuR從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)［6］。HuR快速上調(diào)WEE1蛋白水平，增加γH2AX水平和誘導(dǎo)CDK1磷酸化，促進(jìn)G2／M過渡期停滯。多表達(dá)HuR導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥，沉默WEE1導(dǎo)致DNA藥物更敏感。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，WEE1抑制增強(qiáng)力DNA損傷藥物的效果，也增強(qiáng)了γ射線的效果［59］。高表達(dá)叉頭蛋白能夠逃避抑制WEE1誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞凋亡，異常表達(dá)T-box轉(zhuǎn)錄因子叉頭在人腫瘤中驅(qū)動上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化以適應(yīng)腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥和耐放療等［60］。

5 存在問題與研究方向

WEE1與癌細(xì)胞生存密切相關(guān)，應(yīng)用前景廣泛，需進(jìn)一步深入研究。目前對WEE1的研究還存在以下問題急需解決。其一，目前學(xué)者對WEE1蛋白的分子量還沒有形成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。多數(shù)學(xué)者傾向于接受人類內(nèi)源性WEE1是含有647個(gè)氨基酸殘基，在SDSPAGE電泳遷徙為94 KD的蛋白。但I(xiàn)garashi等［61］在1991年基于cDNA克隆表達(dá)分析，認(rèn)為WEE1是一個(gè)分子量為49 KD，含有432個(gè)氨基酸殘基的蛋白。這個(gè)49 KD的WEE1蛋白在細(xì)菌、真菌、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞系中表達(dá)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究［62］。然而根據(jù)WEE1含有647氨基酸殘基計(jì)算，其分子量約為71 KD。實(shí)際上目前也有針對分子量為約為72 KD的WEE1的抗體研究。造成這種現(xiàn)象的原因可能與WEE1蛋白的結(jié)構(gòu)、化學(xué)修飾等有關(guān)。因此，WEE1蛋白的分子量及分子結(jié)構(gòu)還是需要進(jìn)一步闡明。其二，以前的研究發(fā)現(xiàn)，很多因素如缺氧、光刺激和維生素D誘導(dǎo)都可以上調(diào)WEE1mRNA的表達(dá)，但WEE1基因究竟是如何被轉(zhuǎn)錄激活還不清楚。其三，WEE1及其家族基因MYT1都能后磷酸化周期依賴激酶2，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)展。有研究［63］表明WEE1家族基因MYT1是炎癥因子NF-kB通路的抑制因子。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子CylinD1被NF-κB通路和Rb1調(diào)節(jié)，WEE1 的穩(wěn)定伴隨著 Rb1［31］和 p53［27］的抑制，p53 狀態(tài)也影響著 WEE1的功能［27］。因此 WEE1與 p53、Rb1和NF-κB之間相互影響的機(jī)制以及WEE1與其家族基因MYT1的分工也需要進(jìn)一步闡明。其四，WEE1的經(jīng)典作用是其通過磷酸化抑制CDC2從而抑制細(xì)胞進(jìn)入M期。其次就是WEE1在S期的基因組DNA穩(wěn)定性作用。但有研究［64］表明WEE1還能與其它細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子p53、Rb1、CylinD1、PLK相互作用，因此WEE1對細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)作用還有待進(jìn)一步研究。其五，體外癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明H3K36、p53、DNA復(fù)制激活通路對WEE1抑制有明顯影響［42］，WEE1抑制劑在不同腫瘤中的抗癌效果也不一致。而目前WEE1抑制劑作為抗癌靶點(diǎn)進(jìn)入臨床Ⅱ期實(shí)驗(yàn)，但WEE1抑制劑敏感性的決定因子及腫瘤基因組特性還不清楚。這些都是后續(xù)研究需要解決的問題。

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