閩南地區(qū)RGS4基因多態(tài)性與精神分裂癥及利培酮血藥濃度關(guān)聯(lián)研究☆

徐志忠 陳彬彬 徐象珍 呂海燕 鄭慧斐 何玨

遺傳因素在精神分裂癥發(fā)病過程中具有重要作用[1-2]。G-蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)子4（regulator of G protein signaling 4,RGS4）基因是精神分裂癥易感基因之一[3]，可能抑制多巴胺D2和D3受體的信號(hào)傳遞以及調(diào)控谷氨酸的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，RGS4基因多態(tài)性與精神分裂癥有一定的關(guān)聯(lián)[4]，但相同位點(diǎn)在不同人群中的研究結(jié)果并不完全一致[5-6]。利培酮（risperidone）是一種非典型抗精神病藥，對(duì)多巴胺D2受體和5-羥色胺能受體具有抑制作用，單核苷酸多態(tài)性 （single-nucleotide polymorphisms,SNPs）有可能是引起利培酮血藥濃度個(gè)體化差異的原因之一[7-8]。本研究選取位于RGS4基因調(diào)控區(qū)域 3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn) rs2842029、rs6678136和rs10799897，檢測(cè)其在閩南地區(qū)精神分裂癥患者和正常對(duì)照中的分布差異，同時(shí)檢測(cè)患者服用利培酮后的血藥濃度，分析多態(tài)性位點(diǎn)與利培酮血藥濃度的關(guān)聯(lián)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 2016年1月至2017年8月就診于廈門市仙岳醫(yī)院門診及住院治療的患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合《國(guó)際疾病與相關(guān)健康問題統(tǒng)計(jì)分類》（International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems，ICD-10）精神分裂癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②來(lái)自中國(guó)閩南地區(qū)（廈門、漳州、泉州）[9]；③單獨(dú)服用利培酮2周以上；④詳細(xì)了解本研究的目的和流程，并簽署臨床科研知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①同時(shí)服用其他精神科藥物；②患有嚴(yán)重軀體疾病。納入精神分裂癥患者共132例，男82 例，女 50 例，年齡（42.87±15.06）歲。 選取同期在廈門市仙岳醫(yī)院體檢的志愿者作為對(duì)照。入組標(biāo)準(zhǔn)：①無(wú)精神疾病史及家族史；②來(lái)自中國(guó)閩南地區(qū)（廈門、漳州、泉州）；③簽署臨床科研知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①與患者有血緣關(guān)系；②有重大軀體疾病。納入正常對(duì)照140名，男81名，女59名，年齡（34.54±11.34）歲。

1.2 研究方法

1.2.1 外周靜脈血采集 患者服用利培酮2周后，抽取外周靜脈血，離心分離血漿和血細(xì)胞，分別用于血藥濃度測(cè)定和基因組DNA提取。同時(shí)抽取對(duì)照者的外周靜脈血用于提取基因組DNA。

1.2.2 利培酮血藥濃度測(cè)定 采用高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用 （high performance liquid chromatography and mass spectrometry,HPLC/MS）技術(shù)檢測(cè)利培酮血藥濃度。色譜和質(zhì)譜條件參考既往研究報(bào)道[10]。為了消除用藥劑量、體重對(duì)血藥濃度的影響，采用劑量校正濃度和標(biāo)準(zhǔn)濃度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析[11]：劑量校正濃度=血藥濃度（ng/mL）/劑量（mg/d）；標(biāo)準(zhǔn)濃度=劑量校正濃度/體重（kg）。

1.2.3 受試者基因組DNA提取 使用Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒（B518253-0100，上海生工生物）從血細(xì)胞中提取基因組DNA，溶于TE緩沖液。

1.2.4 RGS4基因多態(tài)性位點(diǎn)擴(kuò)增 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （polymerase chain reaction,PCR） 擴(kuò)增RGS4基因各多態(tài)性位點(diǎn)片段。根據(jù)RGS4基因序列 （NCBI:NG_023312.1）設(shè)計(jì) PCR引物，rs2842029正向引物為 5’-GGTCTGAGGGCCTTC CTAGTT-3’， 反向引物為 5’-AAGTCTAAACCG GCAGCTCG-3’；rs6678136 正 向 引 物 為 5’-TTGGGCAAGTGAACACTCCT-3’，反向引物為 5’-TCTTTGTTTACCTGGGCACCT-3’；rs10799897 正向引物為 5’-CAGCAACCTGGGATGAGGTA-3’，反向引物為 5’-TGGTTGCCTGGACTGAGATG-3’。反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5 min，然后每一循環(huán)95℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.2.5 DNA測(cè)序 PCR擴(kuò)增完成后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，片段大小符合后送至上海生工測(cè)序公司，采用毛細(xì)管電泳法測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析由SPSS 20.0（IBM，USA）完成。Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)采用χ2檢驗(yàn)，基因型和等位基因頻率在患者組和對(duì)照組中分布比較使用χ2檢驗(yàn)，不同基因型患者、不同性別患者對(duì)應(yīng)的利培酮血藥濃度比較分別使用方差分析和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 基因分型結(jié)果 RGS4基因各多態(tài)性位點(diǎn)的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為 899 bp、530 bp、741 bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，片段大小符合，見圖1。在患者組和對(duì)照組中，rs2842029位點(diǎn)只有1種基因型AA，rs6678136位點(diǎn)和rs10799897位點(diǎn)均具有AA、AG、GG 3種基因型。

圖1 RGS4基因各多態(tài)性位點(diǎn)電泳結(jié)果

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) rs2842029位點(diǎn)的基因型均為純合子，rs6678136、rs10799897位點(diǎn)各基因型在各組中的觀察值和理論值之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2.3 基因型和等位基因頻率 患者組和對(duì)照組rs6678136 位點(diǎn)的基因型（χ2=6.753，P=0.034）和等位基因（χ2=4.592，P=0.032）頻率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，rs10799897 位點(diǎn)的基因型 （χ2=0.250，P=0.883）和等位基因頻率（χ2=0.035，P=0.852）差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

2.4 利培酮血藥濃度 精神分裂癥患者中，rs6678136位點(diǎn)各基因型所對(duì)應(yīng)的血藥濃度 （F=0.690，P=0.504）、 劑量校正濃度 （F=0.432，P=0.650）和標(biāo)準(zhǔn)濃度（F=0.244，P=0.784）差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而rs10799897位點(diǎn)各基因型所對(duì)應(yīng)的血藥濃度 （F=3.601，P=0.030）、劑量校正濃度（F=3.656，P=0.029） 和 標(biāo) 準(zhǔn) 濃 度 （F=3.466，P=0.034）差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩兩比較發(fā)現(xiàn)AA型血藥濃度（q=3.574，P＜0.05）、劑量校正濃度（q=3.807，P＜0.05）以及標(biāo)準(zhǔn)濃度（q=3.735，P＜0.05）均低于GG型，而AA型與AG型、AG型與GG型的血藥濃度、劑量校正濃度、標(biāo)準(zhǔn)濃度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見表 2。

表1 RGS4基因各多態(tài)性位點(diǎn)基因型和等位基因頻率[n(%)]

表2 RGS4基因rs6678136位點(diǎn)和rs10799897位點(diǎn)各基因型精神分裂癥患者利培酮血藥濃度（±s）

表2 RGS4基因rs6678136位點(diǎn)和rs10799897位點(diǎn)各基因型精神分裂癥患者利培酮血藥濃度（±s）

1）方差分析后，與GG型比較，經(jīng)SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05

多態(tài)性位點(diǎn)rs6678136 rs10799897基因型AA AG GG AA AG GG n 32 57 43 46 70 16血藥濃度（ng/mL）28.62±12.48 32.16±16.42 29.22±15.67 26.65±11.921)32.52±18.64 39.67±20.32劑量校正濃度7.54±3.29 7.70±3.57 7.01±3.93 6.74±3.581)7.78±4.09 10.09±5.26標(biāo)準(zhǔn)濃度0.13±0.06 0.13±0.07 0.12±0.06 0.12±0.061)0.13±0.07 0.17±0.10

男女患者的血藥濃度（t=-1.232，P=0.220）和劑量校正濃度（t=-0.567，P=0.572）差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而標(biāo)準(zhǔn)濃度差異則具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=-3.153，P=0.002），見表 3。

表3 不同性別精神分裂癥患者利培酮血藥濃度（±s）

表3 不同性別精神分裂癥患者利培酮血藥濃度（±s）

1）與女性患者比較，經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05

性別男性女性n 82 50血藥濃度（ng/mL）29.56±16.11 33.34±17.70劑量校正濃度7.36±4.02 7.74±3.11標(biāo)準(zhǔn)濃度0.12±0.061)0.15±0.06

3 討論

本研究探討閩南人群中RGS4基因多態(tài)性位點(diǎn)與精神分裂癥的相關(guān)性。rs2842029位點(diǎn)位于RGS4基因的上游啟動(dòng)子區(qū)，本研究發(fā)現(xiàn)閩南人群中該位點(diǎn)只有1種基因型，說(shuō)明該位點(diǎn)可能不存在變異。rs6678136位點(diǎn)也位于RGS4基因的上游啟動(dòng)子區(qū)，NEED等[12]在歐洲人群中研究發(fā)現(xiàn)，rs6678136位點(diǎn)在精神分裂癥患者和正常人群中沒有差異，該位點(diǎn)變異和精神分裂癥沒有相關(guān)性，而本研究則發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與精神分裂癥具有相關(guān)性，可能是精神分裂癥的風(fēng)險(xiǎn)因子，出現(xiàn)不同結(jié)果可能與研究方法、對(duì)象差異等有關(guān)，此外，該位點(diǎn)位于RGS4基因的調(diào)控區(qū)域，與基因表達(dá)的關(guān)聯(lián)也值得進(jìn)一步研究。rs10799897位于RGS4基因的內(nèi)含子區(qū)域，DING等[4]研究RGS4基因多態(tài)性位點(diǎn)與其mRNA表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs10799897位點(diǎn)與mRNA的表達(dá)水平無(wú)關(guān)，PRASAD等[13]也發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與精神分裂癥患者的認(rèn)知能力沒有相關(guān)性，本研究也沒有發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在精神分裂癥患者和正常對(duì)照中存在差異，這說(shuō)明該位點(diǎn)可能不是精神分裂癥的風(fēng)險(xiǎn)因子。

利培酮在體內(nèi)經(jīng)CYP2D6和CYP3A4代謝為9-羥利培酮，利培酮和9-羥利培酮在血漿中的半衰期分別為2.8 h和20.5 h，患者連續(xù)口服5 d左右，血藥濃度達(dá)到穩(wěn)態(tài)，臨床上把利培酮與9-羥利培酮的血藥濃度之和作為評(píng)估利培酮療效的依據(jù)[14-15]。利培酮具有一定的副反應(yīng)，可能會(huì)引起腎功能損傷、代謝紊亂等，因此，檢測(cè)利培酮的血藥濃度及其影響因素具有重要臨床意義[16-17]。RGS4基因多態(tài)性可能與利培酮的臨床療效相關(guān)，LANE等[18]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過利培酮治療后，SNP1、SNP18位點(diǎn)基因型為A/A的患者社會(huì)功能改善更加明顯。本研究利用HPLC/MS技術(shù)檢測(cè)利培酮血藥濃度，準(zhǔn)確度、靈敏度較高，結(jié)果表明rs10799897位點(diǎn)不同基因型所對(duì)應(yīng)的血藥濃度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明該位點(diǎn)可能會(huì)影響利培酮的血藥濃度，雖然該位點(diǎn)可能不是精神分裂癥的風(fēng)險(xiǎn)因子，但可能會(huì)對(duì)利培酮的臨床用藥有指導(dǎo)意義。此外，利培酮標(biāo)準(zhǔn)濃度在男女患者中具有差異，說(shuō)明性別也可能是影響血藥濃度的一個(gè)因素。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)RGS4基因新的與精神分裂癥及利培酮血藥濃度相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)，具有一定的創(chuàng)新性。但由于樣本量偏少，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，同時(shí)需要探討患者多態(tài)性位點(diǎn)與利培酮治療效果及副反應(yīng)的關(guān)系，以提高研究結(jié)果的可信性，這對(duì)個(gè)體化用藥、減少藥物的副反應(yīng)都有重要的臨床意義。

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