低頻電針對心肌缺血損傷大鼠相關(guān)經(jīng)穴和非相關(guān)經(jīng)穴皮膚溫度的影響?

吳嬌娟，程 凱，嵇 波，趙國楨，游 敏，王 丹，嚴(yán)明娜，孫曉敏，白紅新，戴 健，路雅雯，劉翼天，葛云鵬，蘇 杭

(北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029)

人體體表穴位、內(nèi)臟之間存在特定的聯(lián)系，這種“內(nèi)屬臟腑,外絡(luò)肢節(jié)”的經(jīng)穴-臟腑相關(guān)學(xué)說構(gòu)成了經(jīng)絡(luò)學(xué)說的核心內(nèi)容，也成為近年來中醫(yī)針灸研究的熱點(diǎn)。多數(shù)研究思路是從穴位到內(nèi)臟，即刺激體表穴位，監(jiān)測相關(guān)內(nèi)臟指標(biāo)，由外而內(nèi)地研究兩者之間的關(guān)系，而涉及由內(nèi)臟指向體表穴位相關(guān)性的研究較少，由內(nèi)而外的逆向論證研究比較薄弱。有研究表明，機(jī)體處于同一狀態(tài)時(shí)，相關(guān)經(jīng)穴和非相關(guān)經(jīng)穴在陽性反應(yīng)[1]、電阻值[2],、紅外輻射溫度[3]、痛閾值[4]、局部嘌呤物質(zhì)[5]等方面存在差異，而內(nèi)臟處于不同狀態(tài)時(shí)相關(guān)經(jīng)穴與非相關(guān)經(jīng)穴的差異性研究較少。本研究借助大鼠心肌缺血模型，探查相關(guān)經(jīng)穴和非相關(guān)經(jīng)穴在大鼠處于不同心肌狀態(tài)(正常生理態(tài)、病理缺血損傷態(tài)、低頻電針干預(yù)態(tài))下體表溫度的變化差異，以求證相關(guān)經(jīng)穴對于不同機(jī)體狀態(tài)的反應(yīng)較非相關(guān)經(jīng)穴是否存在差異及其特異性變化規(guī)律。進(jìn)一步逆向論證經(jīng)穴-臟腑相關(guān)理論，并為其提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

40只清潔級Wistar健康品系雄性大鼠，9 周齡，體質(zhì)量(230±20) g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供(合格證號SCXK(京)2012-0001)。實(shí)驗(yàn)前將動(dòng)物飼養(yǎng)于室溫(24±1)℃、相對濕度(55±5)%的環(huán)境中，日光燈照射，12 h 明暗交替，以大鼠普通飼料、自由飲水適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，排除飲食及環(huán)境等可能對動(dòng)物產(chǎn)生的影響。

1.2 主要試劑、針具和儀器

20%烏拉坦(天津藥業(yè)焦作有限公司生產(chǎn)，批號 06051121)；青霉素(哈藥集團(tuán)制藥總廠生產(chǎn)，批號 CD1408008-1)；針灸針：華佗牌無菌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)0.20 mm×13 mm；電針儀：二導(dǎo) HAN’s 穴位刺激儀(LH202H，北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)有限公司)；BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)：TM003-0024 成都泰盟科技有限責(zé)任公司；呼吸機(jī)：成都泰盟軟件有限公司 HX-300S 動(dòng)物呼吸機(jī)；冷光源：上海安信光學(xué)儀器制造有限公司 LG100-2 醫(yī)用冷光源；SG-H1 型恒溫恒濕實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)：南京盛光光電醫(yī)療儀器有限責(zé)任公司；紅外熱像儀(FLIR SC640,FLIR SYSTEM，美國)；TX51 顯微鏡：日本 Olympus 公司。

2 方法

2.1 分組

雄性Wistar大鼠40只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為5小組，包括空白對照組、假手術(shù)組、心肌缺血損傷組(簡稱模型組)、低頻電針內(nèi)關(guān)組(簡稱低頻A組)、低頻電針非經(jīng)非穴組(簡稱低頻B組)。

2.2 造模

造模前大鼠處理:實(shí)驗(yàn)前2 d用脫毛膏將心包經(jīng)“內(nèi)關(guān)”、胃經(jīng)“足三里”和膽經(jīng)“陽陵泉”穴區(qū)部位的鼠毛脫掉，并洗凈殘余膏體，再將大鼠放回動(dòng)物房正常飼養(yǎng)。造模按冠脈結(jié)扎法[6]并加以改良制備心肌缺血損傷模型：20%烏拉坦，4.5 mL/kg，腹腔注射麻醉，經(jīng)口腔行氣管插管后連接動(dòng)物呼吸機(jī)(潮氣量 80～90 ml；呼吸頻率8～10次/min，呼吸比1∶1)，保持呼吸通暢；連接BL-420E+生物機(jī)能系統(tǒng)檢測心電。于大鼠胸部正中偏左側(cè)備皮，常規(guī)消毒，沿第4.5肋間胸骨左緣縱向剪開胸部皮膚及肌肉，暴露肋骨及肋間肌，斷開第4.5胸肋連接處，將開瞼器縱向放入胸部切口，暫關(guān)呼吸機(jī)迅速撐開開瞼器，再打開呼吸機(jī)；在冷光源照射下，用眼科彎鑷撕破心包膜，在動(dòng)脈圓錐和左心耳交界下約2 mm處進(jìn)行結(jié)扎，進(jìn)針深度約1～1.5 mm，將左冠狀靜脈和動(dòng)脈一起結(jié)扎，快速排出胸腔氣體和液體后逐層縫合，傷口消毒，并在頸部皮下注射青霉素40萬U/次/d預(yù)防感染。結(jié)扎后心肌結(jié)扎部位的顏色發(fā)紺，心電圖J點(diǎn)抬高，初步證明造模成功。剔除結(jié)扎前心電圖不正常、造模失敗及中途死亡的大鼠。以暖光源照射觀察，待大鼠呼吸心律穩(wěn)定撤除呼吸機(jī)，術(shù)后幫助排痰，注意保暖。

2.3 取穴

根據(jù)大鼠形態(tài)、解剖生理特點(diǎn)，參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7]穴位標(biāo)準(zhǔn)定位如下。內(nèi)關(guān)：在前肢內(nèi)側(cè)，距腕關(guān)節(jié)約3 mm的尺橈骨縫間;足三里：在膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm處;陽陵泉：在足三里上外側(cè)5 mm左右。非經(jīng)非穴：在環(huán)跳穴(后肢髓關(guān)節(jié)后上緣)外5 mm左右。

2.4 處理方法

空白對照組常規(guī)飼養(yǎng)條件下不做任何處理，但在它組電針處理時(shí)抓取和固定1次共3 d；假手術(shù)組在大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支處穿線不結(jié)扎，其余操作同模型組；模型組在大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支處結(jié)扎，形成心肌缺血損傷，其抓取和固定同空白對照組；低頻A組造模成功后，用華佗牌規(guī)格0.20 mm×13 mm毫針直刺左側(cè)“內(nèi)關(guān)”穴約0.2 cm，在穴位外上方0.5 cm非穴處皮下平刺1 mm，連接電針儀。電針參數(shù)設(shè)置：頻率2 Hz，強(qiáng)度以大鼠前肢微微顫動(dòng)為度(1mA),20 min,造模后每日處理1次共3 d; 低頻B組除電針穴位為非穴外，其余均同經(jīng)穴A組。

2.5 指標(biāo)檢測

2.5.1 經(jīng)穴紅外熱成像檢測 儀器設(shè)置:溫度-40～120℃，熱敏感度(FOV)25°× 19°,輻射率:0.98,室溫(24±1)℃，相對濕度55%～60%，反射溫度20.0 ℃，大氣溫度25.0 ℃，且在無日光直射環(huán)境下相對距離1 m。測試前將大鼠麻醉固定于臺(tái)架上，置于電熱板上保溫待測，測試時(shí)鏡頭垂直對準(zhǔn)待測腧穴；經(jīng)穴低頻A組、低頻B組于第3次電針處理后30 min進(jìn)行檢測，另外3組與治療組同時(shí)進(jìn)行檢測，檢測部位為內(nèi)關(guān)、足三里、陽陵泉穴區(qū)；記錄輻射成像圖并用輻射成像處理軟件進(jìn)行分析；通過3個(gè)像素點(diǎn)測溫合成，像素點(diǎn)間距17 μm，檢測范圍51 μm；取左、右側(cè)穴區(qū)溫度的平均值用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2.5.2 心肌組織HE染色 穴區(qū)皮膚溫度檢測完成后，開胸取出心臟置于生理鹽水中，讓其自行收縮排血，大約10 min后用無齒鑷輕壓心臟排盡余血，并用生理鹽水沖洗，再置于4%多聚甲醛液中保存固定。然后將固定好的標(biāo)本常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，石蠟切片、脫蠟、蘇木素染色、分色，返藍(lán)，伊紅染色、脫水、透明、封片，光鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠心肌細(xì)胞HE染色結(jié)果

圖1顯示，空白對照組心肌細(xì)胞排列緊密規(guī)則，胞質(zhì)、胞核顯示清晰，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞核居中，未見炎性細(xì)胞；假手術(shù)組可見心肌細(xì)胞少量壞死，心肌纖維呈波浪狀改變，存在散在的白細(xì)胞浸潤；模型組細(xì)胞核碎裂、消失，胞質(zhì)呈不規(guī)則粗顆粒狀，心肌纖維凝固性壞死并有間質(zhì)水腫，存在少量中性粒細(xì)胞浸潤；低頻A組心肌細(xì)胞排列恢復(fù)緊密化，核居中，在缺血壞死區(qū)內(nèi)開始出現(xiàn)增生細(xì)胞，炎細(xì)胞浸潤明顯減少；低頻B組細(xì)胞核碎裂，胞質(zhì)呈不規(guī)則粗顆粒狀，心肌纖維凝固性壞死且間質(zhì)水腫，有少量中性粒細(xì)胞浸潤。

圖1 各組大鼠心肌組織切片(HE染色 ×100)注：A.空白對照組； B.假手術(shù)組； C.模型組； D.低頻A組； E.低頻B組

3.2 不同心肌狀態(tài)時(shí)內(nèi)關(guān)、足三里、陽陵泉穴區(qū)的溫度變化情況

表1顯示，心肌處于缺血損傷態(tài)時(shí)，相關(guān)經(jīng)穴內(nèi)關(guān)和非相關(guān)足三里皮膚溫度均降低(P<0.01,P<0.05)，其中內(nèi)關(guān)較足三里明顯，而非相關(guān)經(jīng)穴陽陵泉穴的皮膚溫度無明顯變化。低頻電針刺激內(nèi)關(guān)穴3 d后，相關(guān)經(jīng)穴內(nèi)關(guān)穴溫度較模型組顯著升高(P<0.01)，非相關(guān)經(jīng)穴足三里穴有上升趨勢，而非相關(guān)經(jīng)穴陽陵泉穴溫度無明顯變化。低頻電針刺激非經(jīng)非穴后，內(nèi)關(guān)、足三里、陽陵泉穴穴位溫度較模型組均無明顯變化。心肌缺血時(shí)對比電針干預(yù)內(nèi)關(guān)穴和非經(jīng)非穴狀態(tài)下，內(nèi)關(guān)和足三里穴溫度變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05)。

表1 不同心肌狀態(tài)時(shí)內(nèi)關(guān)、足三里、陽陵泉穴溫度變化比較

注：與空白對照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：▲▲P<0.01；與低頻A組比較：▇P<0.05，▇ ▇P<0.01

4 討論

經(jīng)穴-臟腑相關(guān)是經(jīng)絡(luò)學(xué)說的核心內(nèi)容之一。早在2000多年前《素問·調(diào)經(jīng)論》就有記載:“五臟之道，皆出于經(jīng)隧，以行血?dú)猓獨(dú)獠缓?，百病乃變化而生。”?jīng)隧即經(jīng)脈，強(qiáng)調(diào)經(jīng)脈與五臟的密切聯(lián)系?！鹅`樞·海論》云:“夫十二經(jīng)脈者，內(nèi)屬于府藏，外絡(luò)于支節(jié)”，說明十二經(jīng)脈的重要功能是溝通臟腑與體表肢節(jié)。另《素問·藏氣法時(shí)論》有:“心病者，胸中痛……膺背肩甲間痛，兩臂內(nèi)痛”，指出臟腑疾病在體表相關(guān)經(jīng)穴會(huì)出現(xiàn)反應(yīng)。近年來，有關(guān)經(jīng)穴臟腑相關(guān)的諸多基礎(chǔ)和臨床研究[8-12]亦從不同側(cè)面肯定了經(jīng)穴效應(yīng)特異性的存在.

心肌缺血屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”“心痛”“厥心痛”等范疇。根據(jù)經(jīng)脈臟腑相關(guān)理論，心包經(jīng)與此病密切相關(guān)?！鹅`樞·經(jīng)脈》載有:“主手厥陰心包絡(luò)之脈……諸邪之在于心者，皆在于心之包絡(luò)。”而內(nèi)關(guān)為手厥陰之絡(luò)脈，通陰維脈，可寧心理血，為治療心胸病要穴，素有“心胸內(nèi)關(guān)謀”之說，其主治病證如《靈樞·經(jīng)脈》所記載:“心系實(shí)則痛，虛則為煩心。”現(xiàn)代臨床和實(shí)驗(yàn)研究證明[13- 16]，針刺“內(nèi)關(guān)”改善急性心肌缺血療效確切。

自然界中一切高于絕對零度的物體，都在不斷向外發(fā)射紅外線。研究表明，紅外輻射與機(jī)體的能量代謝、體熱平衡、體溫調(diào)節(jié)及組織結(jié)構(gòu)有著密切聯(lián)系，溫度越高輻射紅外線的本領(lǐng)越強(qiáng)[17]。紅外熱成像診斷技術(shù)通過接收人體輻射的紅外線，利用映像光學(xué)和計(jì)算機(jī)技術(shù)，顯示黑白或偽彩色圖像[18]。當(dāng)機(jī)體某處發(fā)生病理或生理變化時(shí)，不同體表結(jié)構(gòu)必將因其血流和代謝變化等產(chǎn)生溫度改變，引起紅外輻射改變，從而可反映組織不同機(jī)體狀態(tài)。

本研究借助心肌缺血大鼠模型，發(fā)現(xiàn)在心肌缺血損傷狀態(tài)下，心肌細(xì)胞存在炎性浸潤，相關(guān)經(jīng)穴內(nèi)關(guān)溫度明顯下降，低頻電針內(nèi)關(guān)干預(yù)時(shí)心肌細(xì)胞排列開始恢復(fù)，相關(guān)經(jīng)穴內(nèi)關(guān)溫度明顯升高，非相關(guān)經(jīng)穴足三里和陽陵泉?jiǎng)t無此變化。且低頻電針非經(jīng)非穴對各穴區(qū)體表溫度變化及心肌改善情況不大，表明心肌在不同狀態(tài)下，相關(guān)經(jīng)穴體表溫度較非相關(guān)經(jīng)穴存在一定的變化特征，能反映心肌所處狀態(tài)，且低頻電針內(nèi)關(guān)穴可以改善心肌缺血及其誘發(fā)的相關(guān)經(jīng)穴溫度下降，其機(jī)制尚有待進(jìn)一步的研究。

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