飛蝗表皮蛋白基因LmNCP1的分子特性及功能分析

楊亞亭，趙小明，秦忠玉，劉衛(wèi)敏，馬恩波，張建珍

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飛蝗表皮蛋白基因的分子特性及功能分析

楊亞亭1,2，趙小明1，秦忠玉1,2，劉衛(wèi)敏1，馬恩波1，張建珍1

（1山西大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所，太原 030006；2山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006）

【】基于飛蝗（）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫搜索并克隆獲得飛蝗表皮蛋白基因（nymph cuticle protein 1），分析其序列特征和表達特性，通過蛻皮激素（20-hydroxyecdysone，20E）誘導(dǎo)和干擾20E受體基因表達研究其表達調(diào)控，并基于RNA干擾（RNAi）方法分析其生物學(xué)功能，為闡明該基因在飛蝗表皮發(fā)育過程中的作用提供理論依據(jù)?！尽恳罁?jù)飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫獲得表皮蛋白基因，結(jié)合RT-PCR技術(shù)克隆獲得其全長開放閱讀框（ORF）序列，并結(jié)合飛蝗基因組序列分析其基因結(jié)構(gòu)及序列特征；使用MEGA 6.0軟件中鄰接法（neighbor-joining，NJ），與其他昆蟲同源序列聚類分析，并根據(jù)聚類結(jié)果進行命名；利用reverse-transcription quantitative PCR（RT-qPCR）分析其在5齡飛蝗不同組織和不同發(fā)育天數(shù)的基因表達特性；通過體內(nèi)注射20E誘導(dǎo)以及干擾20E受體基因的表達，RT-qPCR檢測該基因的表達情況；基于RNAi結(jié)合H&E染色方法分析其生物學(xué)功能?！尽客ㄟ^搜索獲得表皮蛋白基因，并進行了克隆和測序驗證，獲得457 bp的cDNA序列，其全長ORF序列為306bp，編碼101個氨基酸。氨基酸序列分析表明該基因編碼的蛋白含有1個信號肽，不含幾丁質(zhì)結(jié)合域，但包含3個重復(fù)基序，Weblogo分析結(jié)果顯示其在物種間具有保守性。系統(tǒng)進化樹分析顯示該蛋白與蜚蠊目蟑螂（）BcNCP1序列一致度最高，聚為一支。根據(jù)聚類結(jié)果將該蛋白命名為LmNCP1（GenBank登錄號：MF326211）。RT-qPCR結(jié)果顯示在5齡若蟲體壁中高表達，在翅芽、前腸和脂肪體中表達次之，在中腸、后腸、胃盲囊和馬氏管中表達量較低或不表達；在5齡早期（N5D1和N5D2）高表達，隨后表達量逐漸降低（N5D3—N5D6），到下一次蛻皮前表達有所升高（N5D7），其表達量動態(tài)與內(nèi)表皮形成時間一致。20E誘導(dǎo)不同時間結(jié)果顯示，與對照組相比，在20E誘導(dǎo)1 h和3 h后表達量顯著上調(diào)，分別上調(diào)了1.3倍和0.9倍；利用RNAi方法干擾48 h和72 h后，與對照組相比，表達量均顯著降低，分別降低了71%和87%。利用RNAi方法在4齡和5齡第2天分次注射ds后，飛蝗仍能夠正常蛻皮，無致死表型，但對其表皮進行H&E染色發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，其內(nèi)表皮形成減少，導(dǎo)致表皮顯著變薄，表皮層厚度約減少了33%?！尽匡w蝗表皮蛋白LmNCP1含有3個物種間保守的重復(fù)基序，不含幾丁質(zhì)結(jié)合域，屬于其他家族蛋白；主要在體壁中高表達，而且響應(yīng)介導(dǎo)的20E信號通路調(diào)控；RNAi試驗表明，在飛蝗蛻皮過程中參與內(nèi)表皮的沉積。

飛蝗；表皮蛋白；；蛻皮激素

0 引言

【研究意義】昆蟲體壁覆蓋整個蟲體，具有維持蟲體形態(tài)、抑制體內(nèi)水分蒸發(fā)和抵御外源物質(zhì)入侵等作用[1]，其主要由上表皮、原表皮和真皮細胞層組成，原表皮由內(nèi)表皮和外表皮構(gòu)成，其中上表皮和外表皮在蛻皮前形成，內(nèi)表皮在蛻皮后形成[2]。昆蟲表皮的主要成分為幾丁質(zhì)和表皮蛋白，兩者約占昆蟲表皮成分的60%以上，其成分的缺失或含量減少均會導(dǎo)致表皮功能異常甚至喪失，從而影響昆蟲的正常生長發(fā)育[3]。蛻皮激素（20-hydroxyecdysone，20E）在調(diào)控昆蟲蛻皮、變態(tài)和生殖中具有重要作用。目前，對表皮蛋白的研究主要集中于模式昆蟲，而對于非模式的漸變態(tài)昆蟲研究較少。飛蝗（）是一種典型的漸變態(tài)昆蟲，同時也是一種重要的世界性農(nóng)業(yè)害蟲。因此，以飛蝗為對象研究漸變態(tài)昆蟲表皮蛋白基因的分子特性、表達模式、生物學(xué)功能及受20E介導(dǎo)的表達調(diào)控方式，可以為表皮蛋白基因在20E介導(dǎo)的蛻皮過程中的作用及調(diào)控機制研究提供依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】隨著昆蟲基因組學(xué)的發(fā)展，越來越多的表皮蛋白被鑒定，其種類繁多，功能也不盡相同。目前已報道的昆蟲表皮蛋白序列已有1 400條以上，主要分為5個家族，包括CPR家族、CPF/CPFL家族、Tweedle家族、CPAPs家族以及其他家族。其中，CPR家族是數(shù)量最多的表皮蛋白家族，根據(jù)其在表皮層的類型和位置的差異性，CPR家族可分成3個亞族，即RR-1、RR-2和RR-3，據(jù)報道含有RR-1基序的表皮蛋白主要存在于柔軟表皮層，含有RR-2基序的表皮蛋白主要存在于堅硬表皮層[4]，目前對含有RR-3基序的表皮蛋白研究報道不多，具體功能未知。CPAPs家族根據(jù)其含有的幾丁質(zhì)結(jié)合域可分為CPAP1和CPAP3兩種類型，在昆蟲生長發(fā)育中具有重要功能[5-8]。Tweedle家族是含有Tweedle基序的一類表皮蛋白，在昆蟲體形和生長發(fā)育中具有重要作用[9]。CPF/CPFL是低復(fù)雜度表皮蛋白家族，該家族含有44個保守的氨基酸序列，在黃粉蟲（）和飛蝗中被首次鑒定[10]。隨后，Togawa等[11]從岡比亞按蚊（）中鑒定出4個CPF家族表皮蛋白基因，并發(fā)現(xiàn)這4個表皮蛋白基因只在蛹期或羽化前期表達，表明其可能與成蟲體壁上表皮的形成有關(guān)。然而，仍有一些表皮蛋白不屬于上面這些家族中的任一家族，被稱為其他家族，如Jensen等[12]從死人頭蟑螂（）中鑒定了4個蛻皮后表皮蛋白（BcNCP1、BcNCP2、BcNCP3和BcNCP4），該類表皮蛋白含有2—3個重復(fù)基序，但不含幾丁質(zhì)結(jié)合域。該家族表皮蛋白在昆蟲表皮中發(fā)揮怎樣的作用仍不清楚。另外，昆蟲表皮蛋白基因的表達受到多種因素的影響，如激素（20E和JH）、轉(zhuǎn)錄因子和內(nèi)含子等，這些因素之間相互作用，使昆蟲表皮蛋白基因的表達形成一個多級調(diào)控系統(tǒng)[13]。在昆蟲蛻皮過程中20E與其受體（EcR）結(jié)合通過其響應(yīng)因子調(diào)控表皮蛋白基因的表達[13]，如在黑腹果蠅（）和煙草天蛾（）中研究發(fā)現(xiàn)FTZ-F1能夠促進表皮蛋白基因的表達[14-15]。在家蠶（）中，翅原基表皮蛋白基因受到多個轉(zhuǎn)錄因子激活表達，并響應(yīng)20E的誘導(dǎo)[16-20]。但20E對表皮蛋白基因的誘導(dǎo)調(diào)控研究大多集中在CPR家族基因，對其他家族基因的研究較少。在飛蝗中，筆者課題組前期基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫獲得了81個表皮蛋白基因，根據(jù)其保守基序分為CPR家族、CPAPs家族、Tweedle家族、CPF/CPFL家族以及其他家族[21]。隨后，對CPR家族的內(nèi)表皮蛋白基因研究發(fā)現(xiàn)其主要在外胚層形成的組織中表達，可能參與內(nèi)表皮的形成[22]；王燕等[23]基于RNAi方法對CPAPs家族表皮蛋白研究，發(fā)現(xiàn)其在飛蝗生長發(fā)育過程中具有重要作用；Song等干擾Tweedle家族表皮蛋白基因后引起飛蝗蛻皮困難死亡[24]，但對其他家族基因的研究尚未見報道?！颈狙芯壳腥朦c】目前，關(guān)于飛蝗表皮蛋白的研究還比較少，主要集中于表皮蛋白的提取、鑒定和分類。對一些不含幾丁質(zhì)結(jié)合域的表皮蛋白的分子特性及其基因表達模式尚缺乏系統(tǒng)研究。另外，該類表皮蛋白基因是否響應(yīng)20E誘導(dǎo)表達以及在20E介導(dǎo)的蛻皮過程中具有怎樣的功能，有待深入研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】以飛蝗表皮蛋白基因為對象，研究其分子特性、組織分布和時期表達特性及其響應(yīng)20E誘導(dǎo)表達情況，并通過RNA干擾結(jié)合H&E染色方法分析其生物學(xué)功能，為明確其在飛蝗蛻皮過程中的功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2016—2017年在山西大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所完成。

1.1 試驗材料

供試昆蟲：飛蝗蟲卵購自河北滄州蝗蟲養(yǎng)殖公司，將購買的飛蝗蟲卵置于恒溫人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)進行孵化，待其孵化成1齡若蟲時移至養(yǎng)蟲籠內(nèi)置于人工氣候培養(yǎng)箱中，種植新鮮小麥苗用于飼喂，待其長至3齡時開始輔以麥麩飼喂。人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)設(shè)置溫度為（30±2）℃，相對濕度為（40±5）%，光周期為光照14 h﹕黑暗10 h。

試驗試劑：RNAisoTMPlus，Reverse transcriptase M-MLV（RNaseH）購自TaKaRa公司；SYBR?Green real-time PCR Master Mix購自TaKaRa公司；2×Tag PCR Master Mix購自天根公司；AxyPrepTMPCR Cleanup Kit試劑盒購于AXYGEN公司。

1.2 表皮蛋白基因獲得及其分子特性分析

基于課題組飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，獲得表皮蛋白基因Unigene3699，結(jié)合飛蝗基因組數(shù)據(jù)庫[25]，獲得其全長ORF序列，克隆驗證后根據(jù)飛蝗基因組序列對其基因結(jié)構(gòu)進行分析，引物見表1（由上海生工生物有限公司合成）。利用ExPASy網(wǎng)站translate tool對其ORF序列進行翻譯、并預(yù)測蛋白分子量大小及等電點（pI），利用ExPASy網(wǎng)站ProtParam tool分析其帶負電荷的酸性氨基酸（Asp+Glu）和帶正電荷的堿性氨基酸（Arg+Lys）、蛋白脂肪系數(shù)、不穩(wěn)定指數(shù)以及總水平親水性系數(shù)（grand average of hydropathicity，GRAVY），SignalP4.1 server分析其信號肽，利用SMART分析其結(jié)構(gòu)域，通過WEBLOGO工具對其在各物種間的保守基序進行分析。

1.3 系統(tǒng)進化樹分析

根據(jù)Unigene3699氨基酸序列，運用NCBI的BLAST工具搜索其同源序列并進行比對，下載來源于其他物種的同源序列，使用Mega 6.0軟件中鄰接法（neighbor-joining，NJ），將Unigene3699氨基酸序列與死人頭蟑螂、柑橘鳳蝶（）、黑腹果蠅等物種的同源序列進行聚類分析，獨立分析1 000次，數(shù)值代表bootstrap估算值。根據(jù)聚類結(jié)果將其命名為LmNCP1（nymph cuticle protein 1）。用于構(gòu)建進化樹的不同目物種的表皮蛋白（cuticle protein 1，CP1）和飛蝗序列的GenBank登錄號見表2。

1.4 mRNA表達特性

1.4.1 表達的組織特異性檢測 為了探討在不同組織的表達特性，選用5齡第2天飛蝗若蟲，雌蟲和雄蟲各半，設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)4頭試蟲，解剖體壁、翅芽、前腸、胃盲囊、中腸、后腸、馬氏管和脂肪體8個組織，立即凍存于液氮中。按照TaKaRa公司的試劑說明書，用RNAisoTMPlus提取上述組織的總RNA，將所提取RNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，然后使用Nanodrop 2000對所取總RNA進行定量，并以1 μg總RNA為模板，根據(jù)TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，合成cDNA。

利用RT-qPCR方法檢測5齡第2天飛蝗不同組織部位的表達情況，反應(yīng)體系和程序參考文獻[22]。采用ABI Prism 7300 SDS 1.1軟件對數(shù)據(jù)進行分析并記錄。每個樣本作2個技術(shù)重復(fù)，以作為內(nèi)參（KX276642）[26-27]，引物由上海生工生物有限公司合成（表1）。

1.4.2 不同發(fā)育天數(shù)的5齡若蟲體壁中的表達量檢測 為了探討表達的時間動態(tài)，選取并解剖5齡第1—7天飛蝗若蟲的第2—3腹節(jié)處體壁并凍存于液氮中，設(shè)4個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)4頭試蟲。總RNA提取和cDNA模板合成方法同1.4.1。采用RT-qPCR方法檢測在不同發(fā)育天數(shù)的5齡若蟲體壁中的表達情況，引物見表1。

1.5 20E誘導(dǎo)表達分析

根據(jù)課題組20E處理的表皮轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[28]，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，在20E處理組中的表達量顯著上升。為了進一步驗證這一結(jié)果，對5齡第2天若蟲進行體內(nèi)注射20E，具體參考Li等[29]的方法。以注射10%乙醇的若蟲為對照組，分別處理1、3、6和12 h后解剖飛蝗若蟲第2—3腹節(jié)處體壁并凍存于液氮中，設(shè)3個重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)4頭試蟲?？俁NA提取和cDNA模板合成方法同1.4.1。采用RT-qPCR方法檢測在20E處理組和對照組中的表達差異，具體方法同上。

1.6 干擾20E核受體后LmNCP1的表達變化

為了進一步檢測響應(yīng)20E誘導(dǎo)表達情況，基于RNA干擾方法合成并向5齡第2天若蟲注射10 μg 20E受體基因（GenBank登錄號：AAD19828.1）雙鏈RNA（ds），以注射ds（綠色熒光蛋白基因的雙鏈RNA）為對照，ds片段選取位置為和的公共區(qū)域，具體參考Liu等[30]的方法。48 h和72 h后取飛蝗若蟲第2—3腹節(jié)處體壁并凍存于液氮中，設(shè)3個重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)4頭蟲子。總RNA提取和cDNA模板合成方法同上。采用RT-qPCR方法檢測的沉默效率，同時檢測在干擾48 h和72 h后的表達變化，具體方法同上，引物見表1。

表1 本研究中所用引物

表2 本研究中用于構(gòu)建系統(tǒng)進化樹的物種和NCP1的GenBank登錄號

1.7 基于RNAi的LmNCP1功能分析

擴增基因片段（5′-3′：158—451 bp），利用1.6中方法合成并向4齡第2天若蟲注射10 μg該基因雙鏈RNA（ds），以注射ds為對照，24 h后取對照組和處理組飛蝗體壁組織，利用1.6中方法檢測的沉默效率，其余若蟲正常飼養(yǎng)觀察表型。若飛蝗正常蛻皮則于5齡第2天再次注射10 μg ds，正常飼養(yǎng)觀察表型。

1.8 H＆E染色

為了觀察干擾后對飛蝗表皮形成的影響，分別解剖對照組和處理組5齡蛻皮后72 h飛蝗體壁組織。取其一部分腹部（第2、3腹節(jié)）表皮，用3%戊二醛固定，4℃過夜以制備石蠟切片，另一部分速凍后提取RNA再次檢測沉默效率。固定的樣品經(jīng)石蠟包埋后進行切片（5 μm），然后用蘇木精和伊紅（H＆E）染色，具體方法參照文獻[24]，封片后利用顯微鏡（Olympus BX51，Japan）觀察表皮結(jié)構(gòu)。

1.9 數(shù)據(jù)分析

基因相對表達量采用2-△△Ct [31]法進行分析，采用student-test方法進行差異表達分析，*表示在＜0.05水平差異顯著，**表示在＜0.01水平差異顯著，***表示在＜0.001水平差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 LmNCP1特性分析

根據(jù)課題組飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫獲得一個表皮蛋白基因Unigene3699，結(jié)合飛蝗基因組序列獲得其cDNA序列并克隆、測序驗證，結(jié)果顯示該基因cDNA序列長457 bp，具有一個306 bp的開放閱讀框（ORF）；基因結(jié)構(gòu)分析顯示該基因含有兩個外顯子（圖1-A），編碼101個氨基酸，預(yù)測分子量為10.5 kD，等電點為7.5，其編碼的蛋白N末端含有一個信號肽，不含幾丁質(zhì)結(jié)合域，但具有3個重復(fù)基序（圖1-B），而且該重復(fù)基序在不同物種的同源蛋白中具有高度保守性（圖1-C）。該蛋白有3個帶負電荷的酸性氨基酸（Asp+Glu），4個帶正電荷的堿性氨基酸（Arg+Lys），脂肪系數(shù)為69.80%，不穩(wěn)定指數(shù)為66.89。親/疏水性分析發(fā)現(xiàn)，總水平親水性系數(shù)為0.226，屬親水性蛋白。

A：LmNCP1基因結(jié)構(gòu)Gene structure of LmNCP1；B：LmNCP1序列分析Sequence analysis of LmNCP1；C：LmNCP1保守基序分析 Analysis of conserved motifs by Weblogo。下劃線為信號肽The underline: signal peptide；方框為重復(fù)基序The box: Repeated motif

2.2 LmNCP1系統(tǒng)進化樹分析

將獲得的飛蝗NCP1氨基酸序列與其他昆蟲的CP1氨基酸序列進行聚類分析，聚類結(jié)果顯示，飛蝗NCP1與蜚蠊目、鱗翅目、半翅目煙粉虱和彈尾目昆蟲的CP1聚為一支，其中與蜚蠊目昆蟲BcNCP1親緣關(guān)系最近（圖2）。因此，根據(jù)其同源性將該蛋白命名為LmNCP1。

2.3 LmNCP1組織和時期表達特性分析

組織表達顯示，在飛蝗體壁、翅芽、前腸和脂肪體中均有表達，胃盲囊、中腸、后腸和馬氏管表達較低或不表達，其中在體壁中表達量最高，約為翅芽和前腸中表達量的8—10倍（圖3-A），表明可能參與體壁的形成。

對不同發(fā)育天數(shù)的5齡若蟲體壁組織的RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，主要在上一個齡期蛻皮后高表達（N5D1-N5D2），隨后表達量逐漸降低（N5D3-N5D6），到下一個齡期蛻皮前表達有所上升（N5D7），其中在蛻皮后第1天（N5D1）的表達量最高，約為N5D6表達量的55倍（圖3-B），這一表達模式與內(nèi)表皮形成時間一致，推測其可能在飛蝗蛻皮過程中參與內(nèi)表皮形成。蛻皮前后時期表達分析發(fā)現(xiàn)，在蛻皮前表達量極低，蛻皮后表達量逐漸升高（圖3-C）。

用于構(gòu)建系統(tǒng)進化樹的物種和NCP1的GenBank登錄號見表2 Species and GenBank accession number for phylogenetic analysis are listed in table 2

A：LmNCP1在5齡飛蝗不同組織中的表達The relative expression of LmNCP1 in different tissues of 5thinstar nymphs。IN：體壁 Integument；WP：翅芽 Wing pads；FG：前腸 Foregut；GC：胃盲囊 Gastric caeca；MG：中腸 Midgut；HG：后腸 Hindgut；MT：馬氏管 Malpighian tubules；FB：脂肪體 Fat body。B：LmNCP1在5齡飛蝗不同發(fā)育天數(shù)的表達The relative expression of LmNCP1 in different days of 5thinstar nymphs。N5D1—N5D7：5齡第1—7天 1st-7th day of 5thinstar nymphs。C：LmNCP1在4齡到5齡蛻皮過程中的表達The relative expression of LmNCP1 during molting from 4th instar to 5th instar nymphs。BE：蛻皮前Before ecdysis；E：蛻皮中ecdysis；AE：蛻皮后After ecdysis

2.4 20E誘導(dǎo)表達

為了檢測是否響應(yīng)20E誘導(dǎo)表達，選取5齡第2天飛蝗若蟲進行體內(nèi)20E誘導(dǎo)，RT-qPCR檢測在20E誘導(dǎo)1、3、6和12 h后的表達變化。結(jié)果如圖4所示，與對照組相比，在20E誘導(dǎo)1 h和3 h后表達量顯著上調(diào)，約為對照組表達量的1.3倍和0.9倍，表明其響應(yīng)20E誘導(dǎo)表達。

2.5 干擾20E受體基因LmEcR后LmNCP1的表達變化

為了進一步檢測響應(yīng)20E信號通路的調(diào)控，利用RNAi方法向5齡第2天若蟲注射20E受體基因的雙鏈RNA，48 h和72 h后檢測表達變化情況。結(jié)果顯示，注射ds48 h和72 h后的表達被顯著抑制，其沉默效率為86%和82%（圖5-A），同時的表達量均顯著下調(diào)，分別降低了71%和87%（圖5-B），表明受介導(dǎo)的20E信號通路調(diào)控。

圖4 20E誘導(dǎo)后不同時間LmNCP1的相對表達量

A：LmEcR沉默效率檢測The relative expression of LmEcR determined by RT-qPCR after injected with dsLmEcR；B：干擾LmEcR后LmNCP1表達檢測The relative expression of LmNCP1 determined by RT-qPCR after injected with dsLmEcR

2.6 基于RNAi的LmNCP1生物學(xué)功能分析

為了進一步研究對表皮形成的影響，首先向4齡第2天若蟲注射10 μg ds，以注射ds為對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，注射ds的飛蝗的表達能夠被顯著抑制，但飛蝗均能夠正常蛻皮進入5齡。隨后于正常蛻皮的5齡第2天飛蝗再次注射10 μg ds，盡管與對照組相比，處理組的表達量下降了98%（圖6-A），但飛蝗仍能夠正常蛻皮變?yōu)槌上x。為了觀察該基因的缺失是否對飛蝗表皮結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，分別解剖對照組和處理組5齡蛻皮后72 h的成蟲體壁組織，制作石蠟切片進行H&E染色。結(jié)果顯示對照組原表皮結(jié)構(gòu)正常，具有明顯的外表皮和內(nèi)表皮（圖6-B和6-B’），但處理組原表皮層只含有外表皮，幾乎沒有內(nèi)表皮形成（圖6-C和6-C’），厚度測量統(tǒng)計分析顯示處理組原表皮層相對于對照組顯著變薄，表皮層厚度減少了33%（圖6-D），表明參與了飛蝗蛻皮過程中內(nèi)表皮的形成。

A：LmNCP1沉默效率檢測The relative expression of LmNCP1 determined by RT-qPCR after injected with dsLmNCP1。B、B’：注射dsGFP后，表皮顯微結(jié)構(gòu)（B）以及選擇放大區(qū)域（B’）After injection of dsGFP, microstructure (B) and magnification (B’) of cuticle。C、C’：注射dsLmNCP1后，表皮顯微結(jié)構(gòu)（C）以及選擇放大區(qū)域（C’）After injection of dsLmNCP1, microstructure (C) and magnification (C’) of cuticle；紅色為細胞質(zhì)及細胞外基質(zhì)，深藍色為細胞核cytoplasm and extracellular matrix are stained red with eosin, nuclei are stained dark blue with hematoxylin (Scale bars, 20 μm)；Pro：原表皮Procuticle；Exo：外表皮Exocuticle；Endo：內(nèi)表皮Endocuticle。D：對照組與處理組原表皮層厚度（n=8）Relative thickness of procuticle between dsGFP and dsLmNCP1

3 討論

本文根據(jù)課題組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫獲得一個表皮蛋白基因，結(jié)合飛蝗基因組序列獲得其全長ORF序列，并通過基因結(jié)構(gòu)和序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因只有2個外顯子，編碼的蛋白不具有幾丁質(zhì)結(jié)合域，但具有3個重復(fù)基序（C-P-x-P-x-C），而且這3個重復(fù)基序在物種間高度保守。前人研究也有類似發(fā)現(xiàn)，如Jensen等[12]從蟑螂若蟲體壁中提取并鑒定出4個蛻皮后表皮蛋白，其中BcNCP1含有3個重復(fù)基序，根據(jù)其序列特征推測其可能特異性地與金屬離子結(jié)合或與其他蛋白質(zhì)相互作用。然而基于筆者課題組飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫僅發(fā)現(xiàn)一個該類型的表皮蛋白LmNCP1。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，LmNCP1與蜚蠊目蟑螂BcNCP1之間的親緣性最近。

5齡飛蝗組織特異性表達分析發(fā)現(xiàn)，在飛蝗體壁中高表達，表明其可能與體壁的形成有關(guān)；時期表達分析發(fā)現(xiàn)，在5齡早期（上一個齡期蛻皮后）高表達（N5D1-N5D2），之后表達量逐漸降低（N5D3-N5D6），到下一個齡期蛻皮前表達有所上升（N5D7）。蛻皮前后時期表達分析發(fā)現(xiàn)，在蛻皮前表達量極低，蛻皮后表達量逐漸升高。昆蟲的內(nèi)表皮在蛻皮后逐漸形成，約在蛻皮后72 h完全形成[2]，這種表達模式與昆蟲內(nèi)表皮形成時間一致，推測其可能參與內(nèi)表皮結(jié)構(gòu)的形成。目前，RNAi技術(shù)是研究基因生物學(xué)功能的有效工具，而且飛蝗對RNAi具有高度敏感性。因此，基于RNAi方法沉默該基因后，與對照組相比，飛蝗能夠正常蛻皮進入下一齡期，然而H&E染色發(fā)現(xiàn)干擾的蟲體內(nèi)表皮形成減少，與對照組相比原表皮層極顯著變?。p少33%），表明其在飛蝗蛻皮過程中參與了內(nèi)表皮結(jié)構(gòu)的形成。隨著昆蟲基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的發(fā)展，越來越多的表皮蛋白基因被鑒定，然而關(guān)于表皮蛋白基因的功能研究，尤其是內(nèi)表皮蛋白基因的功能研究報道較少。Xiong等從家蠶體形突變體中鑒定出一個表皮蛋白基因，研究發(fā)現(xiàn)其參與家蠶內(nèi)表皮的形成[32]，然而其作用機制有待深入研究。

研究表明，20E在昆蟲蛻皮過程中具有重要作用，而表皮蛋白是結(jié)構(gòu)蛋白，已有研究表明表皮蛋白基因的表達在昆蟲表皮形成中受20E誘導(dǎo)調(diào)控[13]。根據(jù)筆者課題組前期20E處理的表皮轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[28]，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，在20E處理組中的表達量顯著上升，暗示其可能響應(yīng)20E誘導(dǎo)調(diào)控。為進一步研究其是否受20E信號調(diào)控，首先選取5齡第2天若蟲注射20E進行不同時間誘導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在20E誘導(dǎo)后1 h和3 h均能夠上調(diào)表達；隨后，通過RNAi方法沉默20E受體基因后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，表達顯著下調(diào)，表明響應(yīng)介導(dǎo)的20E信號通路調(diào)控。然而，時期表達模式與20E滴度變化并不一致[30]。有研究發(fā)現(xiàn)，一些表皮蛋白基因，其轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)需要20E調(diào)控，但這些表皮蛋白的基因轉(zhuǎn)錄只有在20E信號降低時才會啟動[33-34]。因此，筆者推測可能響應(yīng)低濃度的20E誘導(dǎo)，但其受20E信號通路調(diào)控的具體機制以及在表皮形成中的作用機制還有待進一步研究。

4 結(jié)論

飛蝗LmNCP1具有3個物種間高度保守的重復(fù)基序，其編碼基因主要在飛蝗體壁中高表達，暗示其參與體壁的形成。表達具有時期特異性，其表達模式與內(nèi)表皮形成時期一致?；赗NAi的生物學(xué)功能分析顯示該基因在飛蝗4齡和5齡若蟲期均能被有效沉默，雖無致死表型，但影響內(nèi)表皮的形成。體內(nèi)20E誘導(dǎo)及其受體基因RNAi結(jié)果表明，受介導(dǎo)的20E信號通路調(diào)控。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Molecular characteristics and Function Analysis of Cuticle Protein Gene

YANG YaTing1,2, ZHAO XiaoMing1,QIN ZhongYu1,2, LIU WeiMin1, MA EnBo1, ZHANG JianZhen1

(1Research Institute of Applied Biology, Shanxi University, Taiyuan 030006;2College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006)

【】Theobjective of this study is to search and clone afrom() based on transcriptome database, analyze its sequence and expression characteristics. Then its expression was determined after 20-hydroxyecdysone (20E) induction and interference 20E receptorin individuals by RNAi, respectively. Meanwhile, the function ofwas analyzed by H&E staining based on RNAi with ds. The results will provide a theoretical basis for the pest control.【】A cuticle protein gene was obtained according to the transcriptome database of locusts, and the length of the cDNA sequence was cloned by reverse-transcription PCR (RT-PCR) and sequenced. The gene structure and sequence characteristics were analyzed by using the genome sequence of the locusts. Using the MEGA 6.0 software, the neighbor-joining (NJ) method was used to construct evolutionary tree with the homologous sequences of NCP1 from other insects. Expression profiles ofat different developmental days and in different tissues at day 2 of 5th instar nymphs were assayed using reverse-transcription quantitative PCR (RT-qPCR).Using RT-qPCR, the expression ofwas detected after treated with 20Efor 1, 3, 6, 12 h and interfering with 20E receptor geneby RNAi for 48 and 72 h, respectively. The biological function ofwas analyzed by combination of RNAi and H&E staining method. 【】 A cuticle protein gene was obtained by searching the transcriptome database of. The length of the cDNA is 457 bp and full length of its ORF is 306 bp, encoding 101 amino acids. Amino acid sequence analysis showed that the protein encoded by the gene contains one signal peptide and three repeated motifs, but no chitin binding domain, and the repeating motifs were conserved among species by Weblogo analysis. Phylogenetic tree analysis showed that the protein has a close genetic relationship with BcNCP1 of. Thus, the protein was named as LmNCP1 (GenBank accession number: MF326211) according to the result of phylogenetic tree. The results of RT-qPCR showed thatwas highly expressed in integument at day 2 of 5th instar nymphs, and lower expression in wing pads, foregut and fat body, but low or no expression in other tested tissues. The expression ofwas high at the early stages (N5D1 and N5D2) of 5th instar nymphs, and then decreased (N5D3-N5D6), following a increase at before ecdysis of next instar (N5D7), which is coincidence with the formation of endocuticle and exocuticle. Compared with the control group, the expression ofsignificantly increased by 1.3 and 0.9 times after injection with 20E for 1 h and 3 h. After 48 h and 72 h ofinterference by RNAi, the expression ofsignificantly decreased by 71% and 87%, respectively, comparedwiththe control group. After declining the expression ofby RNAi at day 2 of 4th and 5th instar nymphs, the locusts could normally molt and no obvious phenotype was observed. However, the endocuticle of the locusts was thinner than that of the control by H&E staining.【】 A cuticle protein genewas obtained according to the transcriptome database of. The protein encoded bydoes not contain chitin binding domain, but contains three repeated motifs.was mainly expressed in integument among all the tested tissues. Furthermore,responds to the regulation of-mediated 20E signaling pathway. The results of RNAi suggested thatwas involved in the formation of endocuticle duringmolting.

; cuticle protein;; 20-hydroxyecdysone (20E)

2017-10-09；

2018-01-05

國家自然科學(xué)基金（31702067，31640075，31672364）、山西省青年科學(xué)基金（201601D021102）

楊亞亭，Tel：0351-7018871；E-mail：2291272205@qq.com。

趙小明，Tel：0351-7018871；E-mail：zxming@sxu.edu.cn。通信作者張建珍，Tel：0351-7018871；E-mail：zjz@sxu.edu.cn