玉米籽粒淀粉粒密度基因tw1的精細定位

孫粲然，張雪海，馬指揮，郭戰(zhàn)勇，湯繼華，付志遠

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玉米籽粒淀粉粒密度基因的精細定位

孫粲然，張雪海，馬指揮，郭戰(zhàn)勇，湯繼華，付志遠

（河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，鄭州 450002）

【】淀粉粒密度影響籽粒容重，通過對一個玉米籽粒淀粉粒密度突變體進行鑒定和精細定位，為容重相關基因的克隆和功能驗證奠定基礎?！尽恳杂N選系過程中發(fā)現(xiàn)的一個淀粉粒密度突變體為材料，利用近紅外光譜分析儀檢測其籽粒內(nèi)部化學成分的變化，用掃描電鏡觀察授粉后18—45 d正常籽粒和突變籽粒中淀粉粒形態(tài)的差異；于2014—2016年分別在河南鄭州和原陽以及海南三亞種植與B73的雜交組合及F2和BC1分離群體，并對其進行遺傳分析；使用來自maizeGDB（http://www.maizegdb.org）的覆蓋全基因組的1 000對SSR引物，通過集團分離分析法（bulked segregation analysis，BSA）篩選與目的基因緊密連鎖的標記，實現(xiàn)目的基因的初步定位；并在該定位區(qū)間內(nèi)開發(fā)新的標記，對從38 000 BC1分離群體中篩選出的交換單株進行基因型分析，實現(xiàn)目的基因的精細定位；通過候選基因序列分析、功能預測和等位性測驗確定首選候選基因?！尽吭撏蛔凅w籽粒較正常籽粒體積變小，比重增加；細胞學和化學組份分析結(jié)果表明，與野生型籽粒相比，突變體籽粒中的粗蛋白含量降低，粗淀粉含量沒有顯著變化，淀粉粒形狀不規(guī)則且變小、密度增加，可能是導致籽粒容重變大的原因；對授粉后不同天數(shù)籽粒內(nèi)部淀粉粒結(jié)構(gòu)的觀察顯示，突變體籽粒淀粉粒的密度比正常籽粒密度大，并隨發(fā)育進程不斷增加；對與B73的F2及測交后代分離群體的遺傳分析結(jié)果表明，籽粒突變是由單隱性基因（命名為）控制的；該基因首先被定位在第6染色體的SSR標記umc1105和bnlg1154之間，物理距離為22 Mb；利用上述2個標記對BC1群體進行交換單株篩選，并開發(fā)標記，將該基因定位于SSR標記B3和A47之間，物理距離為0.2 Mb；在該候選區(qū)段內(nèi)有包含在內(nèi)的3個候選基因，等位性測驗結(jié)果表明，與不是等位基因；候選基因序列分析和功能預測結(jié)果表明GRMZM2G042607編碼的蛋白具有碳水化合物識別結(jié)構(gòu)域，在種子中對碳水化合物的儲藏起沉積作用，是最可能的候選基因?！尽繉崿F(xiàn)了籽粒淀粉粒密度突變性狀基因的精細定位，并確定了候選基因為編碼一種β-1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的GRMZM2G042607。

玉米；容重；淀粉粒密度；；精細定位

0 引言

【研究意義】玉米是中國第一大糧食作物，對于保證國家糧食安全具有極其重要的意義。2010年起，中國已由玉米出口國轉(zhuǎn)變?yōu)橛衩走M口國，玉米供需矛盾日益突出。銷售市場競爭的日益加劇對玉米的商品品質(zhì)和加工品質(zhì)提出了越來越高的要求。容重能夠反映玉米的使用價值和商品價值[1-3]，是檢驗籽粒商品品質(zhì)的重要指標之一。在國際貿(mào)易中，容重已成為國際上玉米質(zhì)量定級的重要參考[4]。此外，容重還是玉米產(chǎn)量的一個次級構(gòu)成因子，與玉米產(chǎn)量密切相關[5]。影響玉米容重的諸多因素中，如玉米的形狀、胚乳形態(tài)[6]、灌漿期[7]、生育期[8]等，遺傳因素占主導地位[9]。但容重性狀的量化測定需要的種子量較大，難以用于群體單株果穗籽粒容重的遺傳分析中。比重是種子絕對重量與絕對體積的比值（g·ml-1），與容重相比，種子的比重排除了籽粒之間空隙以及雜物的影響，與種子的化學成分密切相關，是影響容重的主要因子，因此，遺傳分析中多用籽粒比重的大小來反映容重的大小?！厩叭搜芯窟M展】目前，玉米籽粒容重的遺傳研究主要集中在相關性狀的QTL定位方面。Ding等[10]利用玉米的F2:3群體定位到16個分布在第1、2、3、4、5、7染色體上的容重QTL。許理文等[6]用SNP芯片對240個DH系群體進行基因型分析，在4個環(huán)境下檢測到5個控制玉米容重的QTL，共解釋23.61%的表型變異，其中位于第1染色體的和第9染色體的貢獻率最高。Beavis等[11]利用96個RFLP標記對B73和Mo17構(gòu)建的F2:4群體的容重性狀進行QTL分析，鑒定出分布在玉米第3、5、7、10染色體上的4個QTL。Ajnone-marsan等[12]利用B73和A7構(gòu)建的F2:3群體，定位到6個容重相關QTL，分布在玉米的第1、2、3、5、9染色體上。Peng等[13]利用F2:3分離群體，結(jié)合兩年三點的試驗數(shù)據(jù)，共定位到4個籽粒容重相關的QTL，其中只有位于第1染色體umc1298—bnlg1671標記之間的QTL在6個環(huán)境中都被檢測到，并且表現(xiàn)為穩(wěn)定遺傳的加性效應，對表型的貢獻率達到7%；白光紅等[14]利用綜3和87-1的294個F9:10家系，鑒定出7個與玉米籽粒比重有關的QTL，其中對表型的貢獻率達到14.06%。【本研究切入點】盡管玉米籽粒容重相關性狀的QTL定位研究較多，但相關基因的精細定位和克隆尚未見報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究對育種選系過程中發(fā)現(xiàn)的導致玉米籽粒容重變化的淀粉粒密度突變體及其與常規(guī)自交系B73組配的F2和BC1分離群體進行細胞學和遺傳學分析，通過標記開發(fā)和交換單株篩選實現(xiàn)突變基因的精細定位，為相應基因的克隆和功能驗證奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與作圖群體

所用材料為育種選系過程中發(fā)現(xiàn)的淀粉粒密度變化的自然突變體和常規(guī)自交系B73，2014年夏在河南省鄭州市河南農(nóng)業(yè)大學科教園區(qū)組配了B73×的雜交組合，同年冬季在海南省三亞市河南農(nóng)業(yè)大學南繁基地種植淀粉粒密度自然突變體和F1種子，通過自交和回交獲得了F2果穗（15穗）和BC1代果穗（300穗）。2015年春在河南省鄭州市河南農(nóng)業(yè)大學科教園區(qū)種植了來自同一F2果穗的所有420個籽粒和來自同一個BC1果穗上的所有475個籽粒，并對其相應的F2單株和BC1單株進行自交。2015年夏在河南省鄭州市河南農(nóng)業(yè)大學科教園區(qū)種植2 800個在兩側(cè)標記發(fā)生交換的BC1正常籽粒，并通過自交進一步驗證是否為交換單株。2016年夏在河南省原陽縣河南農(nóng)業(yè)大學科教園區(qū)種植了突變體和4個來自玉米突變體庫（http://maizecoop.cropsci.uiuc.edu/）的突變體，用于二者的等位性測驗（表1）。

表1 su2突變體來源

⊕代表自交

⊕means selfing

1.2 突變體籽粒的細胞學觀察

為明確淀粉粒密度突變體籽粒內(nèi)部性質(zhì)的變化，利用日立S-3400掃描電鏡對授粉后18、21、24、27、30和45 d的野生型和突變體籽粒胚乳中的淀粉粒形態(tài)進行觀察；利用近紅外光譜分析儀對成熟籽粒的粗淀粉和粗蛋白含量進行測定。

1.3 淀粉粒密度基因的定位

將F2群體中的15個正常籽粒的單株DNA等摩爾數(shù)混合成顯性池，15個突變籽粒的純合單株DNA等摩爾數(shù)混合成隱性池[15]。利用均勻覆蓋玉米全基因組的1 000對SSR引物（http://www.maizegdb.org）對雙親、顯性池和隱性池進行標記分析，篩選差異標記。篩選到的差異標記用于分析已知基因型的420個F2單株，驗證差異標記與目的基因是否連鎖。與目的基因緊密連鎖的標記用于分析38 000個BC1正常籽粒胚乳，對可能的交換單株進行自交鑒定，根據(jù)交換單株自交果穗的籽粒表型確定單株的基因型，從而確定與目的基因連鎖的標記以及連鎖標記與目的基因的相對位置，實現(xiàn)目的基因的精細定位。

采用改良的CTAB法提取[16]親本DNA、BSA混池所用的單株DNA及關鍵交換單株DNA，采用堿煮法提取[17]大群體籽粒樣品胚乳DNA。開發(fā)SSR標記時，參考序列為B73（https://maizegdb.org/，B73 reference sequence Version3），SSR序列查找利用SSRHunter軟件，SSR所在的單拷貝序列在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站進行blast分析，SSR引物設計采用primer premier 5.0軟件。引物設計原則：PCR產(chǎn)物長度100—250 bp，GC含量在40%—60%，引物無錯配，引物3’端無發(fā)夾結(jié)構(gòu)，退火溫度在55—62℃，引物長度18—24 bp。由于切胚乳提取DNA的方法易對種子造成創(chuàng)傷，為了提高種子的成活率，通常會用3%的H2O2（ddH2O）對種子處理15 min進行消毒，并通過育苗移栽提高其成株率。

1.4 等位性測驗和候選基因確定

精細定位的候選區(qū)段內(nèi)包含前人已克隆的，為明確本研究的突變基因是否是的等位基因，用突變體和4個來自玉米突變體庫的不同背景的突變體進行等位性測驗。通過候選基因序列分析和功能預測篩選最可能的目的基因。

2 結(jié)果

2.1 突變體表型鑒定

與野生型籽粒相比，淀粉粒密度自然突變體籽粒體積變小，粒長沒有變化籽粒能夠正常發(fā)育，且籽粒頂部較黃（圖1）。比重增加（正常1.10 g·ml-1，突變1.25 g·ml-1），近紅外分析表明突變體籽粒的粗蛋白含量降低（正常3.37%，突變2.83%），但粗淀粉含量沒有顯著變化（正常66.22%，突變66.68%）。進一步對其籽粒內(nèi)部淀粉粒進行掃描電鏡分析，發(fā)現(xiàn)突變體籽粒的淀粉粒變?。ㄕ?3.27 μm，突變8.52 μm），密度增加（圖2）。授粉后不同時期突變體與野生型的籽粒淀粉粒觀察結(jié)果表明，授粉后18 d開始，突變體籽粒出現(xiàn)不規(guī)則形狀的淀粉粒，淀粉粒密度隨著發(fā)育進程不斷增加（圖3）。

2.2 突變體的遺傳分析

淀粉粒密度突變體和B73的雜交F1果穗、F2果穗及分離群體和BC1代果穗的自交群體的表型分析結(jié)果顯示，F(xiàn)1果穗籽粒正常且無分離，F(xiàn)2果穗中正常籽粒和突變籽粒符合3﹕1（1.784＜χ20.05）的分離比；420個F2單株自交后，100個單株的自交果穗與野生型相同，213個單株的自交果穗出現(xiàn)正常籽粒與突變籽粒3﹕1（1.784＜χ20.05）的分離比，107個單株的自交果穗與突變型相同，表現(xiàn)1﹕2﹕1的野生型穗：分離穗：突變型穗的分離比（0.162＜χ20.05）；BC1代果穗中正常籽粒和突變籽粒符合1﹕1（0.162＜χ20.05）的分離比；475個BC1單株自交后，249個單株的自交果穗出現(xiàn)正常籽粒與容重突變籽粒3﹕1（0.689＜χ20.05）的分離比，226個單株的自交果穗與突變體表型一致，符合1﹕1（0.557＜χ20.05）的分離穗：突變型穗的分離比（表2和表3）。遺傳分析結(jié)果表明籽粒淀粉粒密度突變體的突變是由1對隱性基因控制的，將該基因命名為。

a：突變型果穗；b：B73果穗；c：F1果穗；d：BC1分離穗；e：突變籽粒和正常籽粒

圖2 突變型（a）和野生型（b）籽粒淀粉粒

a、c、e、g、i：授粉后18、21、24、27和30 d野生型籽粒的淀粉粒；b、d、f、h、j：授粉后18、21、24、27和30 d突變型籽粒的淀粉粒

a, c, e, g, i: Starch granules of wild grain phenotype in 18, 21, 24, 27, 30 DAP; b, d, f, h, j: Starch granules of mutant grain phenotype in 18, 21, 24, 27, 30DAP

圖3 授粉后不同天數(shù)AA和aa淀粉粒的變化

Fig. 3 The change of starch granules for AA and aa in different days after pollination (DAP)

表2 （Mrd×B73）F2和BC1群體分離情況

χ20.05=3.84

表3 （Mrd×B73）F2和BC1代果穗和群體中單株果穗的表型分析

χ20.05=3.84

2.3 籽粒淀粉粒密度突變基因的精細定位

利用BSA方法在1 000對SSR標記中篩選到43對差異標記，其中位于bin6.04區(qū)的7對SSR標記利用包含50個單株的小群體驗證后是與目的基因緊密連鎖的。利用與目的基因緊密連鎖的SSR標記對420個F2單株DNA進行標記分析，根據(jù)F2單株自交果穗的表現(xiàn)型確定交換單株，初步將目的基因定位于SSR標記umc1105和bnlg1154之間，物理距離22 Mb。在SSR標記umc1105和bnlg1154之間開發(fā)了349對SSR標記，并利用靠近目的基因左右兩端的兩對引物對BC1果穗中的3.8萬個正常籽粒胚乳DNA進行標記分析，對篩選到的交換單株在田間自交進行驗證其表型，同時對交換單株的DNA再次進行標記分析驗證。通過多步交換單株篩選和標記分析，將目的基因定位于新開發(fā)的SSR標記B3（Chr.6：113 266 416）和A47（Chr.6：113 466 703）之間，物理距離200 kb（表4）。B73基因組顯示該物理區(qū)間內(nèi)有3個蛋白編碼基因，GRMZ M2G048836、GRMZM2G042607和GRMZM2G348551（）（圖4）。生物信息學分析結(jié)果表明，GRMZ M2G048836編碼葉綠素中ATP依賴的鋅蛋白酶；GRMZM2G042607編碼β-1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶；GRMZM2G348551是，編碼可溶性淀粉合成酶，參與淀粉和蔗糖的代謝（表5）。

表4 多態(tài)性標記信息

表5 候選基因預測

2.4 候選基因確定

候選區(qū)段內(nèi)的4個不同遺傳背景的突變體與的等位性測驗結(jié)果表明，雜交當代果穗籽粒正常且無分離，說明突變體不是的等位突變引起的（圖5）。生物信息學分析顯示GRMZM2G042607基因162—359個氨基酸位置是其對碳水化合物的識別結(jié)構(gòu)域，具有碳水化合物結(jié)合能力，在種子中對碳水化合物的儲藏起沉積作用（圖4），是本研究突變的首選目的基因。對GRMZM2G042607基因的測序結(jié)果顯示目的基因的調(diào)控序列在突變體和野生型之間有5個多態(tài)性位點，啟動子區(qū)的SNP1（A/G），5′UTR的InDel1（7T/8T）和InDel2（-------/GTGAAGA），3′UTR的InDel3（8T/9T），Poly A尾巴前的SNP2（G/T）。為驗證GRMZM2G042607基因的效應，基于540份自然群體胚乳細胞和淀粉粒大小的分析結(jié)果，對相應淀粉粒大小的2個極端類型的自交系的GRMZM2G042607基因進行測序，結(jié)果表明，這5個多態(tài)位點都不特異，因此在下一步的試驗中需要進一步分析其啟動子序列。

3 討論

3.1 淀粉粒大小影響籽粒容重

容重作為重要的玉米籽粒商品品質(zhì)衡量指標，在品種選育過程中受到育種工作者的重視。玉米籽粒容重與籽粒硬度、淀粉含量、淀粉顆粒大小等因素密切相關。玉米籽粒內(nèi)含物中淀粉含量占75%以上，淀粉含量與籽粒容重顯著正相關[18-20]。淀粉粒是淀粉的主要存在形式，不同粒度的淀粉粒對籽粒容重的貢獻不同，籽粒中2—10 μm的淀粉粒體積百分比與容重正相關，10—20 μm的淀粉粒體積百分比與容重負相關[21]。此外，小淀粉粒的多少決定了淀粉粒的總表面和結(jié)合的蛋白量，影響胚乳的硬度，而籽粒硬度又與籽粒容重極顯著正相關[22-24]?？梢姡蚜Ｖ械矸哿Ｗ冃?，密度增加，結(jié)合的蛋白增多，籽粒容重也會相應增加。本研究中的突變體籽粒的淀粉粒變?。?.52 μm），密度增加，淀粉粒之間的間隙變小，容重變大，而且該突變體的總淀粉含量并沒有顯著變化，因而可以在不改變淀粉含量的前提下提高玉米商品品質(zhì)。

3.2 候選基因的確定

大量的研究表明，當籽粒中碳水化合物的合成受到影響時，玉米籽粒中淀粉的形態(tài)和含量會發(fā)生變化，從而導致容重及品質(zhì)發(fā)生改變[18-20]。編碼一種異淀粉酶，該基因突變在乳熟期阻止糖分向淀粉轉(zhuǎn)化，籽粒中的還原糖和蔗糖的含量顯著增高，導致突變體籽粒胚乳變小，干重降低，容重變小[25-26]。編碼水溶性淀粉合成酶，導致突變體胚乳中碳水化合物的性質(zhì)發(fā)生改變，在籽粒發(fā)育過程中糖類濃度高，淀粉含量低[27]。（）編碼內(nèi)在包膜小蛋白BT1[28]，負責把糖元從細胞質(zhì)運輸?shù)降矸垠w內(nèi)作為糖基供體用于淀粉的合成，在乳熟期，的突變導致籽粒還原糖和蔗糖含量高而水溶性多糖和淀粉含量低[29]。本研究中，（GRMZM2G042607）基因編碼的β-1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶具有碳水化合物結(jié)合能力，在種子中對碳水化合物的儲藏和轉(zhuǎn)運起沉積作用。前人研究表明碳水化合物結(jié)合模塊中的淀粉結(jié)合域數(shù)目增加，對淀粉的親和力也相應增加，但淀粉粒變小而淀粉特性不受影響[30]。該基因可能是導致突變體淀粉粒變小，密度增加，容重變大的主要原因。

圖4 tw1的精細定位

a：Mrd穗子t1、t1*su2-1、T2*su2-1、su2-1、su2-1⊕和su2-1⊕；b：Mrd穗子T2、T2*su2-2、T2*su2-2、su2-2、su2-2⊕和su2-2⊕；c：Mrd穗子T3、T3*su2-3、su2-3和su2-3⊕；d：Mrd穗子T4、T4*su2-4、su2-4和su2-4⊕

糖基化對于真核生物中蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄修飾是十分重要的，是植物細胞維持代謝平衡的重要機制之一[31]。在水稻中，類黃酮糖基化的改變，會造成可溶性糖分的增加以及淀粉合成的減少，導致水稻結(jié)實率下降[32]。N聚糖是植物糖基化中需要的重要的低糖，水稻α-1,3-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶的缺乏造成藻糖無法參與N-糖基合成，影響水稻的分蘗角、節(jié)間和穗節(jié)長度，增加形狀不規(guī)則的白堊籽粒數(shù)[33]。昆蟲細胞中，β-1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶可以將β-1,3半乳糖轉(zhuǎn)移到N聚糖中，隨后參與糖基化[34]。人類中，β-1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶通常與細胞增殖有關，可能會導致惡性腫瘤的形成[35-36]。植物中，β-1,3半乳糖轉(zhuǎn)移酶在N聚糖的延伸中起作用，能夠轉(zhuǎn)移β-1,3半乳糖，并在α-1,4-巖藻糖參與下形成三糖復合體Lewis a結(jié)構(gòu)[37-38]，參與糖基化。本研究中的目的基因編碼了一個β-1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶GALT1。目前還沒有β-1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和相應糖基化對于玉米籽粒發(fā)育相關的報道，但是根據(jù)前人的研究，本文中GRMZM2G042607基因編碼的β-1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶GALT1可能會影響N聚糖的合成，有待進一步研究。

4 結(jié)論

利用籽粒淀粉粒密度突變體定位到一個淀粉粒密度基因，該基因的候選基因是編碼β-1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的GRMZM2G042607。

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（責任編輯 李莉）

Fine mapping of Grain test weight gene

SUN Canran, ZHANG Xuehai, MA Zhihui, GUO Zhanyong, Tang Jihua, FU Zhiyuan

(College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002)

【】Starch grain density affects maize kernel test weight. In this study, we use a mutantof maize to identify and fine map the gene controlling starch grain density, which are helpful for the cloning and function verification of the related grain test weight gene.【】Theis a starch grain density mutant which was identified during maize breeding practices. Scanning electron microscopy and near infrared spectroscopy (NIR) analyzer were used to observe changes of chemical composition in thekernels. The segregation population F2and BC1were derived from the cross ofand B73, which were planted in Zhengzhou and Yuanyang, Henan Province and Sanya, Hainan Province, and used for genetic analysis. BSA (Bulked Segregation Analysis) was used to identify linkage markers selected from 1 000 pairs of SSR primers from maizeGDB (http://www.maizegdb.org) of target gene. The BC1segregation population of 38 thousand individuals were used to fine map the target gene. The candidate genes were sequenced and functional predicted by bioinformatics. Allelism test was performed forand. 【】Compared with the normal seed, thehad smaller grain size and no change in grain length and increased specific gravity.The crude protein content in mutants decreased, the content of crude starch did not change significantly, but thehas irregular shape and smaller starch grain, increased density, and increased grain test weight. Observations of the starch grain structure inside the kernel in different days after pollination showed that the density of the mutant kernel starch kernel increased with the progress of development and was always higher than that of the normal kernel. The genetic analysis of F2and BC1population showed that grain test weight mutation was controlled by a single recessive genewhich was firstly located on chromosome 6 between SSR marker umc1105 and bnlg1154. After screening and analysis the recombinant from the BC1segregation population, the gene was located between B3 and A47. There are three protein-coding genes in the 0.2 Mb candidate physical interval. Allelism test excludedgene and sequence analysis of the other two candidate genes verified that GRMZM2G042607 should be the primary candidate gene of, which encodes protein with a carbohydrate recognition domain and deposits deposition of carbohydrates in the seed. 【】Thegene is fine mapped and find the candidate gene, GRMZM2G042607,encodes beta-1,3 galactosyltransferase.

maize; test weight; starch grain density;; fine mapping

2017-11-03；

2018-01-30

國家自然科學基金重大研究計劃集成項目（91735306）

孫粲然，E-mail：suncanran123@163.com。

付志遠，E-mail：fuzhiyuan2004@163.com